애기장염 씨앗의 표면 살균을 위한 높은 처리량, 견고하고 매우 시간 유연한 방법

Summary

아라비도프스탈리아나(Arabidopsis) 종자의 표면 살균을 위한 고처리량 프로토콜이 제공되어 진공 펌프로 구성된 간단한 흡입 장치로 액체 처리 단계를 최적화합니다. 수백 개의 종자 시료는 하루에 표면 살균될 수 있습니다.

Abstract

애기장염은 지금까지 기능 연구에 가장 널리 사용되는 식물 모델 종입니다. 아라비도시스 씨앗의 표면 살균은 이 쪽으로 요구되는 근본적인 단계입니다. 따라서, 고처리량 인 애비도시스 종자 표면 살균 방법을 한 번에 수십~수백 개의 시료(예: 트랜스제닉 라인, 에코타입 또는 돌연변이)를 처리하는 것이 가장 중요하다. 일반적인 진공 펌프로 구성된 수제 흡입 장치로 튜브에서 액체를 효율적으로 제거하는 종자 표면 살균 방법이 이 연구에서 제시된다. 하루에 수백 개의 샘플을 처리하는 이 방법으로 노동 집약적인 실습 시간을 획기적으로 줄임으로써 약간의 노력으로 가능합니다. 시리즈 타임코스 분석은 높은 발아율을 유지함으로써 표면 멸균의 매우 유연한 시간 범위를 더욱 나타내냈습니다. 이 방법은 종자 크기에 따라 흡입 장치의 간단한 사용자 정의와 작은 씨앗의 다른 종류의 표면 살균에 쉽게 적응 할 수있다, 액체를 제거하기 위해 원하는 속도.

Introduction

아라비도시스는 브라시카세아 족에 속하는 디플로이드 식물 종입니다. 상대적으로 짧은 수명 주기(장시간 성장 조건 하에서 세대당 2개월), 작은 식물 크기, 식물당 수백 종의 종생산과 함께 자체 수분은 최초의 기초 식물 모델 종^1,2를만들었습니다. 또한, 그 게놈은완전히 서열3, 광범위한 역유전학 도구(포화 T-DNA, 트랜스포손 및 화학적으로 돌연변이된 인구)를 사용할 수 있는^4,5,6,효과적인 아그로박테리움-매개변환은 추가 하류 작업을 위한 충분한 형질전환선을 확보하기 에 잘 확립되어^있다7 . 따라서, 지난 2년 동안, 자연, 유전적 및 현상변이를 포함한 분자 수준에서 식물 생물학의 다양한 측면을 해부하는 모델 종으로 애기독증을 사용하여 큰 발전을 이루었다^8,9.

애기장....

Protocol

1. 시약 및 미디어 준비

1. 70% 에탄올 용액 준비: 737mL95% 기술 용탄올을 증류수 263mL에 추가합니다. 완전히 섞으세요.
   참고: 멸균이 아닌 작업 벤치에 70% 에탄올 용액을 준비합니다.
   주의: 에탄올은 인화성이 매우 높으며 눈에 심각한 자극을 일으킬 수 있습니다. 화염과 열원을 멀리하십시오. 눈과 접촉하는 경우 풍부한 물로 헹구는 다.
2. 5% 표백제 용액 준비: 가정용 표백제 5mL(비염염소산나트륨 3.5%, NaClO 포함)을 멸균 증류수 95mL에 추가합니다. 이온 세제(예: 트웬 20)를 몇 방울 떨어뜨리고 완전히 섞습니다.
   참고: 라미나르 후드 내부에 표백제 용액을 5% 준비합니다.
   주의: 표백제의 활성 성분인 염산화나트륨은 매우 자극적입니다. 그것은 매우 부식성이 며 위 장관에 심각한 손상을 일으킬 수 있습니다. 접촉의 경우, 풍부한 물로 즉시 헹구는 다. 섭취의 경우, 치료 조언을 위해 독극물 관리 센터 또는 의료 의사에게 전화하십시오.
3. 반강도 무라시게와 스쿠그(1/2 MS) 중간^26을준비한다.
   1. MS 중간 분말 2.2 g(비타민 포함)과 800mL의 증류수에 자당 10g을 넣습니다. 1M KOH를 사용하여 용액의 pH를 조정하고 증류수를 ....

Results

전체 종자 살균 절차에 필요한 시간을 평가하기 위해, 현재 프로토콜에서 96개의 시료를 처리하는 액체 처리시 시간 차이를 계산하고 기존의 파이펫팅 방법과 비교하였다. 결과는 현재 프로토콜이 시간을 절약하여 기존의 프로토콜(표 1)을 사용하여 액체 처리 시간을 4분의1로줄임을 나타냅니다. 이 표는 현재 프로토콜의 액체 제거 시간이 기존 방법보다 더 많은 시간을 절약하고 전체 8배 감소로 더 많은 시간을 절약한다는 것을 강조합니다.

종자 살균을 위한 시간 범위 선택
더 긴 살균 단계는 오염 율을 최소화하지만 종자 발아에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 오염 없이 가장 높은 발아율로 종자 살균을 위한 최적 시간 범위를 결정하기 위하여는, 각 살균 단계의 다른 기간이 시험되었습니다, 종자 발아 및 녹색 cotyledon 출현 비율을 둘 다 평가했습니다. 2일부터 4일째까지 수행된 발아 분석은 7일째에 10분에서 40분.......

Discussion

씨앗의 살균은 애기독증의 기능 적 연구를위한 기본 단계입니다. 그것은 자주 많은 다른 목적을 위해 수행 되지만, 애비도시스에서 높은 처리량 종자 표면 살균에 제한 된 연구를 사용할 수 있습니다.

지금까지, 가장 높은 처리량을 가진 방법 중 하나는 농축 된 HCl과 표백제혼합에 의해 생성 된 염소 가스를 사용하는 것입니다. 이 방법은 제한된 실습 시간을 필요로하지만, 그것은 인간에 매우 독성 가스를 사용⁽²⁷⁾. 또한 표면 멸균될 종자 수와 표면 종자 살균 지속 시간을 주의 깊게 제어해야 합니다. 씨앗이 너무 많은 경우, 염소 가스의 복용량완전히 종자 배치의 광범위한 오염의 결과로, 종자 코트에 존재하는 미생물을 죽일 충분하지 않을 것이다. 반면에 표면 살균 기간이 너무 길면 씨앗이 죽게 됩니다. 따라서, 몇 가지 장점에도 불구하고, 훈증은 애기독증에서 종자 표면 살균을위한 좋아하는 방법이 아니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
수족관 밸브	Amazon	B074CYC5SD	키트에는 2개의 밸브와 얇은 벽 튜브가 포함되어 있습니다. 판막은 액체가 멸균 팁으로 되돌아가는 것을 방지합니다
애기장대 Col-0 야생형 종자	Nottingham Arabidopsis Stock Center	N1093	야생형 종자(카나마이신에 민감)
애기장대 형질전환 계통 AdoIspS-79 종자	NA	NA	질전환 계통 Col-0 배경에서 형질전환된 Arundo donax의 이소프렌 합성효소 유전자를 과발현하고 카나마이신에 내성이 있는 형질전환 계통(Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583– 2599). 저자의 요청에 따라 사용 가능한
Microcentrifuge	Eppendorf	EP022628188	Benchtop microcentrifuge 씨앗을 회전시키는 데 사용되는 마이크로 원심분리기
Murashige & 비타민을 포함한 Skoog 배지	Duchefa	M0222	식물 멸균 배양
피펫 컨트롤러	브랜드	26300	혈청학 피펫 작동에 사용
폴리에틸렌 튜브 1	Roth	9591.1	진공 펌프에서 디캔테이션 병까지 연결용 튜브(내경: 7mm, 외경: 9mm)
폴리에틸렌 튜브 2	Roth	9587.1	디캔테이션 병에서 수족관 밸브까지 연결하기 위한 튜브  (내경: 5mm, 외경: 7mm)
커넥터가 있는 나사 캡	Roth	PY86.1	2-way 디스펜서, 디캔팅 병용 폴리프로필렌 스크류 캡 GL45
혈청학 피펫	브랜드	27823	눈금이 매겨진 유리(재사용 가능) 혈청학 피펫. 일회용 피펫을 대신 사용할 수 있습니다
.	Qiagen	85300	TissueLyser II 비드 밀은 조직 균질화에 일반적으로 사용됩니다. 튜브에 구슬을 추가하지 않고도 셰이커로 작동합니다.
기술 에탄올	ITW 시약 (Nova Chimica Srl)	212800	에탄올 96% v/v 부분적으로 변성 기술 등급
Tween 20	Merck Millipore	655205	계면활성제 역할을 하는 비이온 세제
범용 튜빙 커넥터	Roth	Y523.1	튜빙 연결을 개선/단순화하는 데 사용할 수 있습니다
진공 펌프	Merck Millipore	WP6222050	사용됩니다. 흡입 장치 만들기