지방산 β산화는 간세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 에너지를 생성하는 데 필수적인 대사 경로입니다. 여기에서, 우리는 14C표지된 팔미트산을 사용하여 갓 분리된 원발성 간세포에서 지방산 β산화를 측정하는 방법을 설명한다.
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방법 논문
갓 분리된 마우스 간세포의 현탁액에서의 지방산 β산화의 측정
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
지방산 β산화는 간장의 에너지 요구를 충족시키고 전신 포도당 항상성을 유지하고 금식 상태에서 간 외 장기 기능을 지원하는 데 필수적인 케톤 생성 및 글루코 신 생성과 같은 추가 과정을위한 기질 및 보조 인자를 제공하는 핵심 대사 경로입니다. 지방산 β산화는 미토콘드리아와 퍼옥시좀 내에서 발생하며 지방산의 흡수 및 활성화, 효소 발현 수준 및 조효소 A 및 NAD+와 같은 보조인자의 가용성을 포함한 여러 메커니즘을 통해 조절됩니다. 간 균질물에서 지방산 β 산화를 측정하는 분석에서, 세포 용해 및 보조인자의 초생리학적 수준의 일반적인 첨가는 이러한 조절 메카니즘의 효과를 가린다. 또한, 균질물에서 소기관의 완전성은 제어하기가 어렵고 제제마다 크게 다를 수 있습니다. 온전한 원발성 간세포에서 지방산 β산화의 측정은 위의 함정을 극복합니다. 이 프로토콜은 14C표지된 팔미트산과 함께 인큐베이션된 갓 단리된 일차 마우스 간세포의 현탁액에서 지방산 β산화를 측정하는 방법을 기술한다. 배양의 시간 내지 수일을 피함으로써, 이 방법은 먹이를 먹인 마우스에 비해 금식 마우스로부터 분리된 간세포에서 관찰된 지방산 β산화의 활성화를 포함하여 본래의 간장의 단백질 발현 수준 및 대사 경로 활성을 더 잘 보존할 수 있는 장점이 있다.
서론
지방산 β산화는 지질 대사에 필수적인 과정으로식이 요법에서 지방산 합성과 섭취의 균형을 맞추는 이화 경로를 제공합니다. 이 과정은 심장 근육, 신장 피질 및 금식 간을 포함한 여러 장기에 대한 에너지를 생성하고식이 요법, 지방 조직 지방 분해 및 내부 트리글리 세라이드 저장 1,2에서 얻은 지방산을 활용합니다.
β산화 경로를 통한 지방산의 산화는 아세틸-CoA로서 방출되는 한 번에 두 개의 탄소에 의한 지방 아실 사슬의 순차적 단축을 초래하며, 이 과정은 미토콘드리아와 퍼옥시솜 모두에서 발생한다. 대부분의 지방산은 β산화만을 겪지만, 일부는 이 경로에 들어가기 전에 다른 탄소에서 산화됩니다. 예를 들어, 피탄산과 같은 3-메틸-치환 지방산은 α산화 경로에 들어가기 전에 퍼옥시솜에서 β산화에 의해 하나의 탄소의 제거를 겪는다. 유사하게, 일부 지방산은 먼저 소포체에서 말단 메틸기의 산화(ω-oxidation)에 의해 디카르복실산으로 전환되고, β산화에 의해 퍼옥시좀에서 우선적으로 산화된다(3).
특정 소기관에 관계없이, 지방산은 먼저 조효소 A(Co....
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프로토콜
마우스 (C57BL / 6J, 남성, 9-11 주령)에 대한 모든 실험 절차는 웨스트 버지니아 대학의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committees)의 승인을 받았다.
1. 간세포 분리
- 준비
- 간세포 분리 전날에, 표 1에 열거된 완충액 및 세포 배양 배지를 준비한다. 수술이 수행 될 곳 근처에서 온도를 37 ° C로 설정한 수조를 설치하십시오.
- 간세포 분리 당일에, 층류 후드 하에서, 완충액 1 35 mL를 멸균 50 mL 원심분리 튜브로 옮기고 70 mL의 완충액 2를 100 mL 멸균 비이커 또는 병으로 옮긴다.
- 항생제 젠타마이신 (50 μg / mL)과 페니실린 / 스트렙토 마이신 (1x)을 두 완충액에 첨가하십시오.
- 단계 1.1.3에서 준비된 완충액 2 20 mL를 100 mm 세포 배양 접시에 옮기고 얼음 위에 놓는다.
- 나머지 50 mL의 버퍼 2를 멸균된 50 mL 원심분리 튜브로 옮긴다. 항생제 보충 완충액 1 및 2를 함유하는 50 mL 튜브를 37°C에서 설정된 수조에 놓고 관류를 시작하기 전에 적어도 15분 동안 예열시킨다.
참고: 세....
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결과
여기에 설명 된 간 관류는 일반적으로 트리판 블루 배제로 추정 된 바와 같이 평균 생존율이 80 %인 30-40 백만 세포 / 간을 산출합니다 (그림 2). 관류 완충액 1 및 2를 제조하는데 사용되는 크렙스-헨셀릿 완충액(KHB) 내의 글루코스의 전형적인 농도는 11 mM이다. 공복 마우스로부터 분리된 간세포에서 지방산 β산화를 측정할 때, KHB 내의 글루코스의 농도는 공복 상태를 더 잘 나타내기 위해 낮아질 수 있다. 도 2에 나타난 바와 같이, 글루코스 농도를 5.6 mM로 낮추는 것은 간세포의 수율 또는 생존율에 부정적인 영향을 미치지 않는다.
표 2는 CPT1의 강력한 억제제인 에토목시르의 존재 및 부재 하에서, 미토콘드리아 지방산 산화10,13
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토론
간 관류 중에는 기포가 간에서 미세 모세 혈관을 차단하고 완충액 순환을 예방하거나 제한하며 간세포 수율과 생존력을 전반적으로 감소시키기 때문에 기포의 도입을 피하는 것이 중요합니다20,21. IVC의 캐뉼레이션 전에 버퍼 충전된 유입 라인을 면밀히 검사하고, 본원에 기술된 바와 같이, 버퍼 1을 포함하는 튜브로부터 유입 라인을 들어 올려 버퍼 2로 전환하는 것을 피하는 것과 같은 예방책은, 실패한 관류의 수를 성공적으로 감소시킬 수 있다(생존력<70%). 관류 시스템에서 버블 트랩을 사용하면 이러한 위험을 크게 줄일 수 있습니다20,21.
콜라게나제 활성은 간세포의 분리를 위한 또 다른 중요한 파라미터이며, 역사적으로12,20
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 Roberta Leonardi에게 국립 보건원 보조금 R35GM119528에 의해 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| (R)-(+)-에토목시르 나트륨 염 | Tocris Bioscience | 4539/10 | |
| [1-14C]-팔미트산, 50– 60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL | 미국 방사성 표지 화학물질 | ARC 0172A | |
| 1 M HEPES, 멸균 | Corning | 25060CI | |
| 10 µ L 용적형 치환 피펫용 일회용 모세관/피스톤 | Mettler Toledo | 17008604 | |
| 1000 µ L, 200 &마이크로; L 및 10 &마이크로; L 피펫 및 팁 | |||
| 5 mL, 10 mL 및 25 mL 혈청학 피펫 | |||
| 50 mL 멸균 원심분리 튜브 | CellTreat | 229421 | |
| 70% 과염소산 | Fisher Scientific | A2296-1LB | |
| BSA, 지방산 무함유 | Fisher Scientific | BP9704100 | |
| CaCl2 이수화물 | MilliporeSigma | 223506 | |
| D-(+)-포도 | MilliporeSigma | G7021 | |
| EGTA | Gold Biotechnology | E-217 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200CSPP | |
| 필터 시스템, 0.22 μ m PES 필터, 500mL, 멸균 | CellTreat | 229707 | |
| 겐타마이신 황산염 | Gold Biotechnology | G-400-25 | |
| HDPE, 6.5mL 섬광 바이알 | Fisher Scientific | 03-342-3 | |
| 혈구계 | |||
| 피하 주사 바늘 22G, 1.5인치 | BD Biosciences | 305156 | |
| Isoflurane | VetOne | ||
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
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| MgSO4 헵타하이드레이트 | MilliporeSigma | M1880 | |
| 마이크로 원심분리기 | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| 미세 해부 가위 | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5980 | |
| NaCl | Chem-Impex International | 30070 | |
| NaHCO3 | Acros 유기물 | ||
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| 인산염 완충 식염수(PBS) | Cytiva Life Sciences | SH30256.01 | |
| 용적식 피펫 MR-10, 10 &마이크로; L | Mettler Toledo | 17008575 | |
| 50 mL 코니컬 튜브용 인서트가 있는 냉장 원심분리기 | Eppendorf | 5810 R | |
| 둥근 바닥, 14 mL, 폴리프로필렌 배양 시험관 | Fisher Scientific | 14-956-9A | |
| 섬광 계수기 | Perkin Elmer | TriCarb 4810 TR | |
| ScintiVerse BD 칵테일 | Fisher Scientific | SX18-4 | |
| 흔들리는 수조, 30L 용량 | New Brunswick Scientific | 모델 G76 | |
| 멸균 세포 스트레이너, 100 &마이크로; m | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 엄지 드레싱 펜치 | Roboz 수술 기구 Co | RS-8120 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| 가변 흐름 연동 펌프 | Fisher Scientific | 138762 | |
| 수조, 2– 2.5L 용량 |
참고문헌
- Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. Triglyceride Metabolism in the Liver. Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).
- Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiological Reviews. 90 (....
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