시간-분해된 Förster 공명 에너지 전달 세포 기반 분석 프로토콜은 384-웰 포맷의 세포 용해물에서 내인성 인산화 신호 변환기 및 전사 활성화제(STAT) 1/3/4/5/6 단백질의 단순하고, 특이적이며, 민감하고, 강력한 정량화를 위해 기술된다.
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방법 논문
인간 세포에서 내인성 인산화 STAT 단백질의 측정을 위한 시간 분해된 Förster 공명 에너지 전달 분석
이 논문에서
요약
초록
야누스 키나제 (JAK) / 신호 변환기 및 전사 활성화제 (STAT) 신호 전달 경로는 사이토 카인 및 성장 인자에 대한 세포 반응을 매개하는 데 중요한 역할을합니다. STAT 단백질은 주로 JAKs에 의해 매개되는 티로신 인산화에 의해 활성화된다. STAT 신호전달 경로의 비정상적인 활성화는 많은 인간 질환, 특히 암 및 면역 관련 병태에 연루되어 있다. 따라서, 천연 세포 신호전달 환경 내에서 STAT 단백질 인산화를 모니터링하는 능력은 학술 및 약물 발견 연구 모두에 중요하다. 인산화된 STAT 단백질을 정량화하는 데 사용할 수 있는 전통적인 분석 형식에는 웨스턴 블롯팅 및 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)이 포함됩니다. 이러한 이질적인 방법은 노동 집약적이고 처리량이 낮으며 웨스턴 블롯팅의 경우 종종 신뢰할 수 없습니다 (특이적). 균질 (세척 없음) 방법을 사용할 수 있지만 비싸지 만 여전히 비쌉니다.
여기서, 상세한 프로토콜은 신규한 천둥 시간 분해된 뫼르스터 공명 에너지 전달(TR-FRET) 플랫폼을 사용하여 부착성 또는 현탁 세포로부터의 세포 용해물에서 인산화된 STAT1(Y701), STAT3(Y705), STAT4(Y693), STAT5(Y694/Y699), 및 STAT6(Y641)의 내인성 수준의 384-웰 포맷으로 민감하고, 견고하며, 비용 효율적인 측정을 위해 제공된다. 세포 분석의 워크플로우는 간단하고 빠르며 고처리량 스크리닝(HTS)을 위해 설계되었습니다. 분석 프로토콜은 유연하고, 저용량 샘플(15μL)을 사용하며, 단 하나의 시약 첨가 단계만 필요로 하며, 저처리량 및 고처리량 응용 분야에 적합할 수 있습니다. 각각의 포스포-STAT 샌드위치 면역검정은 공지된 작용제 및 억제제와 함께 최적화된 조건 하에서 검증되고 예상되는 약리학 및 Z'-인자 값을 생성한다. TR-FRET 분석은 비율계량이며 세척 단계가 필요하지 않으므로 기존 접근 방식보다 훨씬 더 나은 재현성을 제공합니다. 함께, 이 분석 제품군은 세포 처리 후 특정 인산화된 STAT 단백질의 보다 포괄적인 분석과 JAK/STAT 신호전달 경로의 특이적이고 선택적인 조절제의 스크리닝 및 특성화를 위한 새로운 비용 효율적인 도구를 제공합니다.
서론
JAK/STAT 신호전달 경로는 다양한 사이토카인, 인터페론, 성장 인자 및 관련 분자1,2에 대한 세포 반응을 매개하는 데 중요한 역할을 합니다. 특정 세포-표면 수용체에 대한 이들 리간드의 결합은 JAKs의 활성화를 초래하고, 이는 차례로 특정 티로신 잔기의 인산화에 의해 STAT 단백질을 활성화시킨다. STAT 인산화는 그들의 이량체화 및 핵 내로의 전좌를 초래하며, 여기서 이들은 조절된 표적 유전자의 전사에 그들의 효과를 발휘한다. STAT 제품군은 STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b 및 STAT6의 일곱 멤버로 구성됩니다. 구성원은 증식, 분화, 아폽토시스, 혈관 신생 및 면역 체계 조절을 포함한 생리 세포 과정의 조절에 복잡하고 필수적인 역할을합니다. STAT 신호전달 경로의 비정상적 활성화는 많은 인간 질환, 특히 암 및 면역 관련 병태3,4에 연루되어 있다. 따라서, 천연 세포 신호전달 환경 내에서 STAT 단백질 인산화를 평가하는 능력은 학술 및 약물 발견 연구 모두에 중요하다.
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프로토콜
1. 세포 배양
- 가습된 37°C/5% CO2 배양기에서 세포를 유지하고 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 DMEM(HeLa 및 A431 세포) 또는 15% FBS(U266B1 세포)가 보충된 RPMI로 배양합니다. 70-80 % 합류에 도달 할 때까지 세포를 배양 한 다음 트립신화하고 계대 또는 분석에 사용하십시오.
참고 : 배양 배지에는 페놀 레드가 포함되어 있습니다. 분석을 수행하기 전에 임의의 세포주에 대해 혈청 기아가 수행되지 않았다.
2. 부착성 세포와 함께 2-플레이트 분석 프로토콜을 이용한 자극기 또는 억제제 적정
참고: 이 절차는 시험 화합물의 희석 시리즈로부터 농도-반응 곡선을 생성함으로써 자극제 또는 억제제 효능을 결정하는 방법을 설명한다.
- 세포 시딩
- 사전 최적화된 밀도(STAT3 및 STAT6의 경우 40,000 HeLa 세포/웰, STAT5의 경우 75,000 A431 세포/웰)로 50μL의 세포를 적절한 배양 배지의 96웰 조직 배양 처리 플레이트에 분주하십시오. 37°C/5% CO2에서 하룻밤 동안 배양한다.
참고: 최적의 세포 밀도 및 배양 배양 시간을....
- 사전 최적화된 밀도(STAT3 및 STAT6의 경우 40,000 HeLa 세포/웰, STAT5의 경우 75,000 A431 세포/웰)로 50μL의 세포를 적절한 배양 배지의 96웰 조직 배양 처리 플레이트에 분주하십시오. 37°C/5% CO2에서 하룻밤 동안 배양한다.
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결과
각 THUNDER TR-FRET 분석은 JAK/STAT 경로 특이적 활성화제 또는 억제제로 부착제(HeLa 또는 A431) 또는 현탁액 세포(U266B1)를 처리한 다음, 적용 가능한 경우 특정 인산화 및 총 STAT의 수준을 측정함으로써 약리학적으로 검증되었습니다. 분석은 두 플레이트 전사 프로토콜 및 사전 최적화된 분석 조건을 사용하여 384-웰 포맷으로 수행되었다. 도 3, 도 4, 도 5, 도 6, 및 도 7은 모든 STAT 검정에 대해 수득된 대표적인 농도-반응 곡선을 요약한다. 전반적으로, 포스포-STAT 분석법에 대한 모든 자극기 및 억제제 농도-반응 곡선은 견고한 TR-FRET 신호, 넓은 동적 범위, 낮은 웰 간 변동 계수 (일반적으로 ≤5 %),.......
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토론
웨스턴 블롯팅 및 ELISA 기반 방법과 같은 포스포단백질 분석을 위한 기존의 방법과 비교할 때, THUNDER TR-FRET 세포 분석을 위한 워크플로우는 간단하고 빠르며, 저용량 샘플(15μL)을 사용하며, 384-웰 포맷의 HTS용으로 설계되었으며, 자동화에 매우 적합합니다. 분석 프로토콜은 유연하며 중간 및 고처리량 응용 분야 모두에 쉽게 적응할 수 있습니다. 분석은 두 개의 플레이트 전송 프로토콜 또는 one-384-well 플레이트 프로토콜을 사용하여 실행할 수 있습니다. 두 플레이트 전달 프로토콜에서, 세포는 하나의 세포 배양 플레이트에서 시딩, 처리 및 용해되고, 용해물은 분석을 위해 후속적으로 별개의 백색 검출 플레이트 (반면적 96-웰 또는 384-웰 플레이트)로 옮겨진다. one-384-well 플레이트 프로토콜에서, 전체 워크플로우는 동일한 웰에서 수행되어, 액체 이송 단계가 필요하지 않습니다. 상기 분석은 부피를 비례적으로 감소시킴으로써 1536-웰 포맷에 쉽게 적응될 수 있었다. 분석 프로토콜에 관계없이.......
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공개 사항
경쟁 관심사: Jaime Padros, Mireille Caron 및 Geneviève Chatel은 이 연구에 사용된 THUNDER TR-FRET 분석 키트를 제조하는 BioAuxilium Research의 직원입니다. 또한 Jaime Padros와 Mireille Caron은 BioAuxilium Research의 주주입니다. 그렇다고 해서 데이터 및 자료 공유에 대한 모든 JoVE 정책에 대한 저자의 준수가 변경되는 것은 아닙니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 96웰 마이크로플레이트, 투명, 평평한 바닥, 폴리스티렌, 조직 배양 처리, 멸균 | Corning | 3595 | 2-플레이트 분석 프로토콜을 사용할 때 세포를 배양하기 위한 플레이트입니다. 다른 세포 배양 96웰 플레이트는 |
| 384웰 마이크로플레이트, 백색, 저용량 | PerkinElmer | 6007290 | 이 플레이트는 2-플레이트 또는 1-플레이트 분석 프로토콜을 사용할 때 TR-FRET 검출을 위한 플레이트입니다. 다른 저용량, 백색 384웰 플레이트를 사용할 수 있습니다: |
| A431 세포주 | ATCC | CRL-1555 | |
| 접착 마이크로플레이트 씰 | PerkinElmer | 6050185 | |
| DMSO | Fisher | D159-4 | |
| Dulbecco' s 수정된 이글 매체 (DMEM) | Wisent | 319-005-CL | THUNDER TR-FRET은 페놀 레드를 함유한 배양 배지와 호환됩니다. |
| EnVision Xcite 멀티라벨 플레이트 리더 | PerkinElmer | 2104-0020A | 이 분석은 TR-FRET 옵션이 장착된 다양한 플레이트 리더에서 수행할 수 있습니다. |
| Erlotinib hydrochloride | Sigma | CDS022564 | |
| Falcon 조직 배양 처리 플라스크 | Fisher | 13-680-65 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 098-150 | |
| HeLa cell line | ATCC | CCL-2 | |
| JAK 억제제 1 | Cayman Chemical | 15146 | |
| 오비탈 플레이트 쉐이커 | 사용 가능한 많은 옵션 해당 | 없음 | |
| 재조합 인간 EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| 재조합 인간 IFN&알파; 2b | ProSpec | CYT-460 | |
| 재조합 인간 IL-4 | R& D Systems | 204-IL | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) | Wisent | 350-007-CL | THUNDER TR-FRET은 페놀 레드 |
| THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET 세포 신호 분석 키트 | BioAuxilium Research | KIT-STAT1PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 세포 신호 분석 키트 | BioAuxilium Research | KIT-STAT3PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) TR-FRET 세포 신호 분석 키트 | BioAuxilium Research | KIT-STAT4P-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + 총 STAT5 TR-FRET 세포 신호 분석 키트 | BioAuxilium Research | KIT-STAT5PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + 총 STAT6 TR-FRET 세포 신호 분석 키트 | BioAuxilium Research | KIT-STAT6PT-500 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Wisent | 325-542-CL | |
| U266B1 세포주 | ATCC | TIB-196 | |
| 초순수 | NA | NA | Milli-Q 등급 물 (18 MΩ. cm)을 사용하여 Lysis Buffer 및 Detection Buffer를 희석합니다. |
참고문헌
- Villarino, A., Kanno, Y., O'Shea, J. Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system. Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).
- Hammarén, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. The regulation of JAKs in cytokine signaling and its brea....
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재인쇄 및 허가
