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방법 논문

시투에서 메소네프로스 개발 중 제브라피시 애벌레와 청소년의 혼성화

2.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/62930

⸱

2021년 8월 13일

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Indiana University of Pennsylvania

이 논문에서

요약

제브라피쉬는 신장 발달을 이해하는 중요한 모델입니다. 여기서, 시투 혼성화 프로토콜은 메소네프로스 개발 중 제브라피시 애벌레및 청소년의 유전자 발현을 검출하도록 최적화된다.

초록

제브라피쉬는 일생에 두 개의 신장 구조를 형성합니다. 배아 발달 중 경향이 있는 (배아 신장)은 형성되고 2 일 후에 수정 후에 작동하기 시작합니다. 단지 두 개의 신전으로 이루어짐에 따라, 수성 세포는 증가하는 바디 질량 때문에 더 많은 신장 기능이 요구될 때까지 애벌레 생활 도중 유일한 신장 역할을 합니다. 이 높은 수요에 대처하기 위하여는, 메소네프로스 (성인 신장)는 변태 도중 형성하기 시작합니다. 새로운 기본 nephrons 는 경향이 있는 알 로에 융합 하 고 연결 된 lumens 형성. 그런 다음 보조 nephrons는 메소네프로스(mesonephros)에 분기 네트워크를 만들기 위해 기본 nephrons에 융합됩니다. 연구의 대다수는 배아를 사용 의 용이성 때문에 경향이 있는 phros에 집중됩니다. 따라서 메소네프로스의 발달을 더 잘 이해하기 위해 더 오래되고 더 큰 애벌레와 청소년 물고기를 연구하는 기술을 개발할 필요가 있습니다. 여기서, 유전자 발현 분석을 위한 시투 혼성화 프로토콜은 메소네프로스를 더 잘 시각화하기 위해 프로브 침투, 프로브 및 항체의 세척 및 표백에 최적화되어 있다. Tg (lhx1a-EGFP) 형질 전환선은 전구 세포와 초기 신장의 말단 튜블러를 라벨에 사용됩니다. 이 프로토콜은 메손프로스 연구의 격차를 메손프로스(mesonephros) 연구의 격차를 메웁니다. 새로운 신장 조직이 어떻게 형성되고 기존 신장론과 통합되고 재생 치료에 대한 통찰력을 제공하는지 이해하는 중요한 모델입니다.

서론

Zebrafish 배아는 최대 5 일 1,2에 대한 먹이없이 작은 크기, 투명성, 사용 가능한 도구 및 생존으로 인해 조직 발달을 연구하기위한 중요한 모델입니다. 그것은 크게 신장 발달의 이해와 제브라피시와 포유류 사이의 보존에 기여하고있다3,4,5. 신장은 유체 항상성을 유지하고 혈액을 필터링하고 폐기물을 배설하는 데 필수적인 역할을합니다. 신장의 기능성 단위인 네프론은 긴 튜블러에 연결된 혈액 필터를 포함한다. 제브라피시에서는 두 개의 신장 구조가 평생 동안 형성됩니다. 수경향 (임시 배아 신장) 초기 발달 도중 첫번째 양식. 전방 후방 축을 따라 실행되는 두 개의 네프론으로 구성되어 있으며 약 2일 후에 발효됩니다(dpf). 경향이 있는 소염의 유용성은 단순성에 있으며, 대부분 선형적이고 시각화하기 쉬운 두 개의 네프론을 가지고 있습니다 (근위 복잡한 튜블러는 3 dpf에서 코일되기 시작하지만). 이것은 중간 중음에서 초기 발달의 연구뿐만 아니라 세분화 패턴 및 tubule 수리7,8을 촉진했습니다.

노른자가 감소하고 유충이 수생 계통9에서 먹이에 의존할 때 제브라피시의 유용성은 5dpf 후에 제한됩니다. 약 2 주 에서, 애벌레는 새로운 조직 양식 및 오래된 조직이 분실되고/또는 개편되는 청소년으로 변태를 겪습니다9. 이것은 또한 메소네프로스 (영구 성인 신장)가 10,11,12를 형성 할 때입니다. 첫 번째 성인 nephron 여섯 번째 소밋 근처 형성, 그리고 경향이 있는 phros의 탈경 초기 tubule와 융합. 추가 nephrons는 처음에이 위치에 후방을 추가, 뿐만 아니라 나중에 전방으로. 이 첫 번째 파도의 기본 네프론은 경향이있는 사람의 튜블러에 융합하고 폐기물을 입금하기 위해 일반적인 루멘을 공유합니다. 보조 nephrons다음 파도에서 형성 하 고 기본 nephrons에 융합. 이 반복적인 과정은 포유류 신장에 다소 유사한 분기되는 메손프로스를 만듭니다. 아마도, 경향이 있는 것은 결국 그것의 관 정체성을 잃고 모든 nephrons그들의 낭비를 배수하는 두 개의 중요한 수집 덕트가 됩니다13.

첫 번째 성인 nephron의 형성 전에, 단 하나 전구 세포는 ~4 mm (총 길이) 애벌레 (~10 dpf)에서 나타나기 시작합니다. Tg (lhx1a-EGFP) 형질 전환선에 표시된 이 세포는, 경향이 있는 phros를 고착하고 신뢰의 미래 사이트로 이동하는 것처럼 보입니다. 단일 세포는 새로운 nephrons12로 분화하는 클러스터로 결합합니다. 이 세포가 어디에 상주하는지 또는 메소네프로 발생의 발병 전에 어떤 유전자를 표현하는지 불분명합니다.

메손프로스 개발을 이해하면 포유류 신장에 대한 통찰력을 수성세포증이 할 수 없는 방식으로 얻을 수 있습니다. 이들은 단 하나 전구 세포에서 nephrogenic 골체의 형성, 기존 세포와 새로운 nephrons의 기능적인 통합, 및 분진 형태를 포함합니다. 그러나, 태아 발달을 공부하는 한계가 있습니다. 유충은 그들의 더 큰 크기와 색소 침착을 가지고 있기 때문에 덜 투명합니다. 개발 타임 라인은 개별 동물 중 동기가 아니며 먹이 주기 및 혼잡9,14와 같은 환경 요인에 크게 의존합니다. 녹다운 시약이 존재하지만, 배아15에 비해 애벌레에서 덜 효과적입니다. 본 프로토콜에서, 제브라피시 메소네프로스 개발 중 유전자 발현을 결정하는 시투 혼성화 방법이 기재된다. 몇 가지 단계는 메손프로스의 시각화와 프로브 및 항체의 침투 및 세척을 증가시키기 위해 최적화된다. Tg(lhx1a-EGFP) 형질전환선은 EGFP가 단일 전구 세포, 신장 골체 및 초기 신장의 단면 튜블러를 라벨에 부착하기 위한 프로브와 함께 사용됩니다. 이 방법은 메소네프로스 발달에 대한 깊은 이해와 재생 치료에 대한 통찰력을 제공합니다.

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프로토콜

제브라피시 애벌레와 청소년의 사용은 IUP IACUC (프로토콜 #02-1920, #08-1920)에 의해 승인됩니다. 솔루션 콘텐츠에 대한 세부 정보는 재료 표에 나열됩니다.

1. 애벌레 를 기르다

참고: 애벌레와 청소년을 관심 있는 단계로 올리는 데는 최대 21일 이상이 소요됩니다.

  1. 마지막 식사 후 늦은 오후에 짝짓기 탱크에 남성 1 마리와 암컷 물고기 1 마리를 추가하여 짝짓기 성인 얼룩말 물고기를 설정합니다.
    참고 : 모든 물고기 쌍이 짝짓기않습니다. 먼저 20쌍을 설정하여 짝짓기 속도를 결정하고 향후 실험에서 그에 따라 조정합니다.
  2. 물고기가 짝짓기를 마친 다음 날 (오후 1시경) 페트리 플레이트에 E3 배지로 배아를 수집합니다.
    1. 플레이트당 30배 이하의 배아가 없는지 확인하십시오.
    2. 페트리 플레이트에서 이물질(예: 대변)을 제거하고 20mL의 E3 배지를 추가합니다.
    3. 1 일 동안 28.5 °C에서 배양하십시오.
  3. 수생 시스템에 다시 성인 얼룩말 물고기를 넣어.
  4. 1dpf에서 E3 배지를 신선한 E3로 교체하십시오.
    1. 5 dpf까지 4 일 동안 28.5 °C에서 배양하십시오.
  5. 2.8 L 탱크에 400 μm 화면을 넣고 2cm의 시스템 물로 채웁니다.
    1. 1 접시 (총 30 개까지)에서 5 dpf 애벌레를 추가합니다.
    2. 수생 시스템에 탱크를 넣어,하지만 물 흐름을 시작하지 않습니다.
  6. 14 dpf까지 하루에 두 번 분말 식품의 애벌레 4 mL을 공급합니다.
  7. 6dpf에서, 초당 1 드립에서 물 흐름을 시작합니다.
    참고: 매일 수류를 확인하고 그에 따라 조정하십시오.
  8. 8dpf에서, 천천히, 꾸준한 스트림으로 물 흐름을 증가.
  9. 14 dpf에서, 분말 식품 이외에 살아있는 소금물 새우를 먹이십시오.

2. 1 일 - 2 : 애벌레 수정

  1. 원하는 시점에서 애벌레 탱크를 제거합니다.
  2. 페트리 플레이트에 20mL의 시스템 워터를 채웁니다.
  3. 미세한 메쉬 그물을 사용하여 애벌레를 부드럽게 떠서 수면으로 가져옵니다.
    1. 더 넓은 개구부를 제공하고 페트리 플레이트에 애벌레를 전송하기 위해 전송 파이펫의 끝을 잘라. 더 큰 파이펫 입은 한 번에 여러 개의 작은 애벌레 또는 몇 가지 큰 애벌레의 전송을 허용합니다.
  4. 트리카인 2mL(2%, pH 7 스톡)를 추가하여 애벌레를 고정시합니다.
    1. 애벌레가 움직이지 않는 후 대부분의 물을 제거하고 10mL의 트리카인을 추가합니다. 애벌레가 안락사될 때까지 15분 기다립니다.
    2. 선택 사항: 8mm 이상의 청소년의 경우, 해부 현미경으로 면도날(안락사 후)으로 머리와 꼬리를 잘라 고정 용액의 침투를 개선합니다. 머리와 꼬리를 잘라내고 각 동물의 총 길이를 자신의 페트리 플레이트에 분리하십시오. 동물을 측정하는 방법에 대한 3 단계를 참조하십시오.
  5. 트리카인을 20mL의 고정 용액(4% 파라포름알데히드, 1% DMSO)으로 교체하십시오. 페트리 플레이트에 뚜껑을 다시 놓고 연기 후드에 천천히 흔들어 놓습니다.
    참고: 흔들 플랫폼을 사용하는 것이 중요합니다. 원형 동작이 있는 흔들리는 플랫폼은 동물 축을 구부러집니다. 신선한 (미리 만들어진 냉동되지 않음) 고정 용액만 사용하십시오.
    주의: 고정 용액에는 발암 물질인 파라포름알데히드가 포함되어 있습니다. 연기 후드(또는 마스크)와 장갑을 사용하여 분말을 측정합니다.
  6. 30분 후 고정 솔루션을 신선한 고정 솔루션으로 교체합니다.
    1. 적절한 처리를 위해 별도의 폐기물 용기에 사용된 고정 솔루션을 수집합니다.
    2. 애벌레를 신선한 고정 용액 25mL가 들어 있는 50mL 튜브로 옮기습니다.
    3. 캡이 단단하고 2 일 동안 4 °C에서 천천히 흔들는지 확인하십시오. 편의를 위해 더 오래 배양 할 수 있습니다.

3. 3일차: 애벌레 측정

  1. 연기 후드에서 고정 용액을 20mL의 PBST로 교체하십시오.
  2. 애벌레를 페트리 플레이트로 옮킨다.
  3. 해부 현미경에 평평한 통치자를 넣고 페트리 플레이트를 통치자 위에 놓습니다.
  4. 속눈썹 조작기를 사용하여 각 애벌레를 통치자로 이동하여 총 길이(주아웃에서 카달 지느러미 의 끝까지)를 측정합니다(그림 1).
  5. 유사한 길이(예: 5.0mm 및 5.1 mm)의 여러 애벌레를 5.5mL 유리 유리 바이알 1개, 유리병 당 최대 10개의 애벌레에 결합합니다.

4. 3 일 - 4 : 탈수

  1. PBST를 100% 메탄올의 4mL로 교체하십시오. 실온에서 5 분 동안 유리병을 흔들어.
  2. 메탄올을 신선한 메탄올과 바위로 5분 간 교체하십시오. 한 번 더 반복합니다.
  3. 바이알을 -20°C에서 2일 동안 보관합니다. 편의를 위해 더 오래 배양 할 수 있습니다.

5. 5일차: 수화

  1. 유리병을 실온으로 데우습니다.
  2. 메탄올을 75% 메탄올/25% PBST로 4mL로 교체하십시오. 실온에서 5분 간 바위를 흔들수 있습니다.
  3. 5.2 단계의 솔루션을 50 % 메탄올 / 50 % PBST의 4 mL로 교체하고 5 분 동안 바위를 교체하십시오.
  4. 5.3 단계에서 25% 메탄올/75% PBST의 4mL로 솔루션을 교체하고 5분 동안 바위를 흔들어 보세요.
  5. 5.4 단계의 솔루션을 4mL PBST로 교체하고 10 분 동안 바위를 대체하십시오.
  6. PBST를 신선한 PBST 4mL로 교체하고 10분 간 바위를 흔들어 보시면 됩니다. 한 번 더 반복합니다.

6. 5일차: 프로틴타제 K 다이제스트

  1. PBST를 단백질Ae K 용액(20 μg/mL, PBST의 1% DMSO 최종 농도)으로 교체하고 실온에서 30분 간 바위를 휘두른다.
    참고: 6mm 이상의 애벌레는 더 긴 잠복기 및/또는 더 높은 단백질제 K 농도가 필요합니다. 정확한 시간과 농도는 경험적으로 결정되어야 합니다. 6mm보다 0.5mm 더 긴 배양 시간이 10분 증가하여 시작합니다.
  2. 단백질Ae K 용액을 PBST 의 4mL로 교체하고 바위를 10 분 동안 교체하십시오.
  3. PBST를 신선한 PBST 4mL로 교체하고 10분 간 바위를 흔들어 보시면 됩니다. 한 번 더 반복합니다.
  4. PBST를 4mL의 신선한 고정 용액으로 교체하고 1h의 바위를 흔들어 보입니다. 편의를 위해 4°C에서 더 오래 배양할 수 있습니다.

7. 5일차: 표백

  1. 고정 용액을 4mL의 PBST로 교체하고 실온에서 10 분 동안 바위를 흔들어보십시오.
  2. PBST를 신선한 PBST 4mL로 교체하고 10분 간 바위를 흔들어 보시면 됩니다. 한 번 더 반복합니다.
  3. 애벌레를 6웰 플레이트(우물당 최대 10개)로 옮기습니다.
  4. PBST를 3mL의 신선한 표백 용액으로 교체하십시오.
  5. 실온에서 바위와 해부 현미경에서 색소 침착을 모니터링 5 분마다. 메소네프로스(수영 방광과 창자에 대한 등살)를 따라 색소침착이 사라지는 것을 찾아본다.
    참고: 최대 6mm 길이의 애벌레의 경우 메소네프로를 둘러싼 색소 침착을 표백하는 데 최대 20분이 소요됩니다. 애벌레의 무결성을 보존하기 위해 필요한 것보다 더 오래 표백하지 마십시오.
  6. 유충을 유리 유리 병으로 다시 옮기.
  7. 표백 용액을 PBST의 4mL로 교체하십시오. 10 분 동안 바위.
  8. PBST를 신선한 PBST 4mL로 교체하고 10분 간 바위를 흔들어 보시면 됩니다. 한 번 더 반복합니다.
  9. PBST를 4mL의 신선한 고정 용액으로 교체하고 1h의 바위를 흔들어 보입니다. 편의를 위해 4°C에서 더 오래 배양할 수 있습니다.

8. 5일차: 사전혼성화

참고: 70°C에서 수행되는 단계의 경우 유리병 냉각을 최소화하기 위해 신속하게 작업하는 것이 중요합니다.

  1. 고정 용액을 4mL의 PBST로 교체하고 실온에서 10 분 동안 바위를 흔들어보십시오.
  2. PBST를 신선한 PBST 4mL로 교체하고 10분 간 바위를 흔들어 보시면 됩니다. 한 번 더 반복합니다.
  3. PBST를 Hyb-솔루션의 4mL로 교체하고 실온에서 10분 간 바위를 흔들어 보실 수 있습니다.
    주의: Hyb-, Hyb+및 프로브 솔루션에는 피부를 자극할 수 있는 폼아미드가 포함되어 있습니다. 장갑을 사용하여 이러한 솔루션을 처리합니다.
  4. Hyb-를 신선한 Hyb와 바위 4mL로 10분 간 교체하십시오. 한 번 더 반복합니다.
    1. 사용 된 Hyb- Hyb +를 수집하고 적절한 처리를 위해 별도의 폐기물 용기에 솔루션을 프로브하십시오.
  5. Hyb-를 Hyb+ 솔루션의 4mL로 교체합니다.
  6. 하룻밤 사이에 70°C에서 바이알을 배양합니다.
  7. HYb+의 500 μL에서 EGFP-플루오레세인 프로브를 1:100으로 희석하고 70°C에서 O/N을 배양합니다.
    참고: 프로브 합성에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오.

9. 6일차: 프로브 혼성화

  1. 유리병의 Hyb+ 용액을 예열된 프로브로 교체하고 하룻밤 사이에 70°C에서 배양합니다.
    참고: 6mm 이상의 애벌레는 2일 간 배양을 필요로 합니다.
  2. 세척 버퍼, 2x SSCT 및 0.2x SSCT 용액을 70°C에서 밤새 예열합니다.

10. 7 일 : 프로브 세척

  1. 프로브를 예열된 세척 버퍼의 4mL로 교체하고 70°C에서 30분 동안 배양합니다.
    1. 적절한 처리를 위해 별도의 폐기물 용기에서 사용된 프로브를 수집합니다.
  2. 워시 버퍼를 4mL의 신선한 세척 버퍼로 교체하고 70 °C에서 30 분 동안 인큐베이션하십시오.
  3. 세척 버퍼를 예열된 2x SSCT 용액의 4mL로 교체하고 70°C에서 15분 동안 배양합니다.
  4. 50mL의 예열된 0.2x SSCT를 50mL 튜브에 넣습니다.
    1. 튜브 의 상단에 셀 스트레이너 (100 μm)를 삽입합니다. 세포 스트레이너가 멈출 때까지 끝까지 밀어내도록 하십시오.
    2. 유리 유리 병에서 유충을 세포 여과기로 옮기습니다. 애벌레가 완충액에 잠겨 있는지 확인하고 70°C에서 2시간 동안 배양합니다.
  5. 예열된 0.2x SSCT의 50mL를 포함하는 새로운 튜브를 준비합니다.
    1. 세포 스트레이너를 10.4.2단계로부터 0.2x SSCT의 새로운 튜브로 옮기고 70°C에서 2시간 동안 배양한다.
    2. 10.5 단계를 한 번 더 반복합니다.

11. 7일차: 차단

  1. 애벌레를 새로운 유리 유리 유리 병으로 옮기고 실온으로 식힙니다.
  2. 0.2x SSCT를 67%의 4mL로 교체하고 실온에서 0.2x SSCT/33% MABT및 바위를 10분 간 교체하십시오.
  3. 11.2단계에서 솔루션을 33% 0.2x SSCT/67% MABT및 록으로 10분 간 교체하십시오.
  4. 11.3 단계에서 솔루션을 MABT의 4mL로 교체하고 10 분 동안 바위를 흔들어 보세요.
  5. MABT를 신선한 MABT와 바위4mL로 10분 간 교체하십시오. 한 번 더 반복합니다.
  6. MABT를 블로킹 용액의 4mL로 교체하고 하룻밤 사이에 4°C에서 배양한다. 편의를 위해 더 오래 배양 할 수 있습니다.

12. 8일차 - 9일: 항체 배양

  1. 500 μL 차단 용액에서 항 형광 항체 1:5,000을 희석시.
  2. 차단 용액을 항체 용액으로 교체하고 2 일 동안 4 °C에서 배양하십시오. 편의를 위해 더 오래 배양 할 수 있습니다.
    1. 유충을 동요하기 위해 하루에 두 번 유리병을 소용돌이.
      참고: 6mm 보다 긴 애벌레는 1-2일 더 많은 배양이 필요합니다.

13. 10 일 - 11 : 항체 세척

  1. 항체 용액을 4mL의 PBST로 대체하고 실온에서 10 분 동안 바위를 하십시오.
  2. PBST를 신선한 PBST 4mL로 교체하고 10분 간 바위를 흔들어 보시면 됩니다. 한 번 더 반복합니다.
  3. 애벌레를 50mL 튜브로 옮킨다.
  4. PBST2의 40mL를 추가합니다. 튜브를 측면에 놓고 하룻밤 사이에 4 °C에서 바위를 놓습니다.
  5. PBST2를 40mL의 신선한 PBST2로 교체하고 하룻밤 사이에 4°C의 바위를 보입니다. 편의를 위해 더 오래 배양 할 수 있습니다.
    참고: 6mm 보다 긴 애벌레는 1-2일 의 세탁이 더 필요합니다.

14. 12일차: 염색

  1. 애벌레를 6웰 플레이트로 옮기습니다.
  2. PBST2를 실온에서 3mL의 염색 버퍼와 바위로 5분 간 교체하십시오.
  3. 염색 버퍼를 3mL의 신선한 염색 버퍼로 교체하고 바위를 5분 간 교체합니다. 한 번 더 반복합니다.
  4. 염색 버퍼를 염색 용액의 3mL로 교체합니다. 알루미늄 호일로 덮고 다음 몇 시간 동안 얼룩을 모니터링하십시오.
    1. 약한 신호가 있는 프로브의 경우 하룻밤 사이에 4°C에서 배양하고 염색 용액을 신선한 염색 용액으로 교체합니다.
  5. 원하는 염색 강도에 도달하면 염색 용액을 정지 용액의 3mL로 교체하고 30분 동안 바위를 흔들어 주세요.
  6. 정지 용액을 3mL의 신선한 정지 용액으로 교체하고 30 분 동안 바위를 흔들어 보입니다. 한 번 더 반복합니다.
  7. 애벌레를 새로운 유리 유리 유리 병으로 옮기고 정지 용액을 4mL의 신선한 고정 용액으로 대체하고 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. 편의를 위해 4°C에서 더 오래 배양할 수 있습니다.
  8. 애벌레를 4°C의 어둠 속에서 고정용액에 최대 1년 동안 보관하십시오.

15. 12일차: 이미징

  1. 고정 용액을 4mL의 PBST로 교체하고 실온에서 10 분 동안 바위를 흔들어보십시오.
  2. 애벌레를 6웰 플레이트로 옮기습니다.
  3. PBST를 신선한 PBST 4mL로 교체하고 10분 간 바위를 흔들어 보시면 됩니다. 한 번 더 반복합니다.
  4. PBST를 50% 글리세롤(PBST)의 3mL로 교체하고 10분 동안 바위를 흔들어 보시면 됩니다.
  5. 15.4 단계에서 100% 글리세롤의 3mL로 10분 동안 흔들림 없이 용액을 교체하십시오.
  6. 해부 현미경을 사용하여 6웰 플레이트에서 애벌레를 직접 이미지화하거나 애벌레를 복합 현미경으로 이미지로 우울증 슬라이드로 옮기는다. 속눈썹 조작기를 사용하여 애벌레의 방향을 지정합니다.

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결과

Tg(lhx1a-EGFP) 형질전환선을 이용하여, 이러한 좌식 혼성화 프로토콜은 메소네프로스 개발 중 신장 전구 세포 및 다양한 네프론 구조를 라벨링하는 데 효과적이라는 것을 입증하였다. 예상대로, 중추 신경계는 또한이 형질 전환선에 표시되어 있습니다 (표시되지 않음). 초기 메소네프릭 네프론은 약 5.2mm, 등쪽에서 발생하기 쉬운(그림 2A)을 형성하며, 이 네프론의 말단 튜블러는 EGFP10,12에 의해 표지된다. 전구체 클러스터는 이 단계에서 나중에 존재하며(그림 2A-B, 화살촉), 및 단일 전구 세포도 표지된다(그림 2C). 이 방법은 신장 발달을 공부하는 추가 공...

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토론

여기에 설명 된 시투 혼성화 방법은 메소네프로스 개발을 연구하는 것을 목표로 합니다. 그러나, 그것은 창 자, 신경계, 비늘 및 색소 침착14와 같은 변태 도중 그밖 조직 및 기관의 발달을 공부하기 위하여 적용될 수 있습니다. 프로브는 형질 전환선에서 내인성 유전자 또는 형광 마커를 위해 생성될 수 있다.

애벌레는 그들의 네이티브 맥락에서 장기와 조직을 관찰하기 위하여 그대로 남아 있는 것이 중요합니다. 조직의 무결성을 유지하기 위해 단백질 AE K 치료의 시간을 최소화하는 것이 중요합니다. 효소의 각 새로운 배치에 대 한 최고의 치료 시간을 결정 하는 것이 중요 하다. 대안적으로, 아세톤은 단백질제 K 대신에 조직 무결성향상을 위해 사용될 수 있다16. 과도한 표백은 또한 조직의 무결성을 감소시킵니다. 표백을 최소화하고 눈이 세차 중에 애벌레를 시각화하는 데 약간의 색소 침착 ...

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공개 사항

저자는 이해상충이 없습니다.

감사의 글

기금은 펜실베니아 과학 아카데미, 펜실베니아 생물학자의 연방, 펜실베니아 인디애나 대학 (대학원 연구 및 연구, 생물학부 및 신시아 수삭 학부 생물학 기금)에 의해 제공되었습니다. Tg (lhx1a-EGFP) 형질 전환선은 박사 닐 Hukriede에 의해 제공되었다 (피츠버그 대학).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
항플루오레세인 항체Roche/Sigma-Aldrich11426338910
표백 용액0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST
차단 시약Roche/Sigma-Aldrich11096176001차단 용액에 사용, 제조사의 지시에 따라 준비
세포 여과기Fisher Scientific  22-363-549100 &뮤; m
E3 매체5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001 % 메틸렌 블루
속눈썹 매니퓰레이터Fisher ScientificNC1083208유충 조작에 사용
고정 용액4 % 파라 포름 알데히드, PBS의 1 % DMSO;65 °C에서 가열; C를 흔들면서 분말이 녹을 때까지 만든 다음 냉각 후 DMSO를 첨가
Fluorescein 프로브 합성Roche/Sigma-Aldrich11685619910
유리 바이알Fisher Scientific03-338B
Hatchfry 캡슐화Argent
Hyb- 용액50% 포름아미드, 5X SSC, 0.1% Tween-20
Hyb+ 용액HYB-, 5mg/mL 토룰라 RNA, 50ug/mL 헤파린
MAB(10X)1M 말레산, 1.5M NaCl, pH 7.5
MABT1X MAB, 0.1% Tween-20
말레산시그마-알드리치M0375
파라포름알데히드시그마 알드리치158127
PBS(10X)8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4
PBST1X PBS, 0.1% Tween-20
PBST21X PBS, 0.2% Tween-20
분말 식품스피룰리나와 해치프라이 엔캡슐론을 각각 2g씩 어류 시스템 물 50mL에 섞고 잘 흔듭니다
Proteinase KSigma-AldrichP5568유충을 투과시키는 데 사용
Proteinase K 용액20  &뮤; g/mL, PBST
Spirulina 미세분말Argent
SSC(20X)3M NaCl, 0.3M 무수아세트산나트륨, pH 7, 오토클레이
SSCT(0.2X)20X SSC에서 희석, 0.1% Tween-20
SSCT(2X)20X SSC에서 희석, 0.1% Tween-20
염색 완충액100 mM 트리스 pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1 % Tween-20
염색 용액200 μ g/mL 요오도니트로테트라졸륨 클로라이드, 200 μ g/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, 염색 완충액
내 정지 용액1mM EDTA, pH 5.5, PBST
Torula(효모) RNASigma-AldrichR6625
TricaineSigma AldrichE105212%, pH 7
세척 버퍼50% 포름아미드, 2X SSC, 0.1% Tween-20
하십시오 . 의 1% DMSO 최종 농도 브

참고문헌

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