종양 거대 해부를 통한 종양 내용 향상

포르말린-고정 파라핀-포매(FFPE) 조직은 정상적인 임상 진단 과정의 일부로서 수집되고 임상 조직 저장소에 보유되며, 암 연구¹을 포함한 인간 연구를 위한 방대한 자원을 나타낸다. 인간 질병에 대한 우리의 이해가 깊어짐에 따라, 이전에 형태 학적 및 면역 표현형 특성에 기초한 단일 실체로 생각되었던 질병이 실제로 분자 서브 타이핑 분석이 필요한 별개의 분자 아형으로 구성되어 있다는 것이 점점 더 분명 해지고 있습니다. 결과적으로, 이들 아류형을 분별할 수 있는 고감도 게놈 분석이 점점 더 중요해지고 있다². FFPE 조직은 고정 관련 문제로 인해 게놈 기술과 호환되지 않는 것으로 유명하지만 기술 및 프로토콜이 발전함에 따라 이러한 기술은 임상적으로 유 비쿼터스 조직 형식 3,4,5와 점점 더 호환되고 있습니다. 그러나, FFPE 조직은 종종 종양 및 비종양 조직 물질의 혼화제이며, 여기서 비종양 물질의 존재는 종종 원치 않으며, 높은 비율로 존재하는 경우, 게놈 분석의 결과를 상당히 훼손하고 영향을 미칠 수 있다⁶. 실제로, 60%의 최소 종양 함량이 그러한 분석에 자주 사용되며, 여기서 이 역치에 미치지 못하는 조직은 연구 기준⁽⁷)을 달리 충족함에도 불구하고 배제될 수 있다. 이것은 환자 조직이 소중하고 많은 수의 수집이 어려운 희귀 한 질병 환경에서 특히 문제가 될 수 있습니다.

마크로해부(macrodissection)는 정상 조직의 양을 줄임으로써 낮은 종양 함량의 영향을 최소화하는 방법^이다3. 핵산 추출 전에 이러한 교란스러운 비종양 물질의 제거는 추출된 핵산의 종양 백분율 함량 및 따라서 종양 순도를 상당히 증강시킬 수 있다. 조직 절제술은 전문가 병리학 적 검토에 크게 의존하며, 여기서 종양 영역은 보드 인증 병리학 자⁸에 의해 갓 생성 된 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 염색 조직 섹션에서 확인되고 동그라미화됩니다. 그런 다음 동그라미로 표시된 H&E는 원치 않는 조직과 표적 조직의 제거 및 수집을 각각 안내하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 Mayo Clinic의 AIDS 및 Cancer Specimen Resource (ACSR) Technical Core Laboratory에서 수행 된 조직 수확을 통한 병리학 적 검토에서 거시 해부의 단계를 설명합니다.

모든 샘플을 수집하여 승인된 메이요클리닉 IRB 프로토콜(PR16-000507 및 PR2207-02)에 따라 사용하였다.

1. 시료 준비

1. 조직 부유 수조를 켭니다. 온도를 39 °C로 설정하고 물이 온도에 도달하도록하십시오. 나무 컬렉션 스틱을 수조에 담그십시오.
2. 절편화될 FFPE 조직 블록을 식별하고 검색한다.
3. 용매 세척을 견딜 수 있는 조직학 등급 영구 마커를 사용하여 현미경 슬라이드를 사전 라벨링합니다.
4. 마이크로톰을 사용하여 FFPE 블록을 단면화하십시오. 각 블록에 대해 단면당 4-5μm의 두께로 최소 2개의 전체 얼굴 섹션을 절단합니다(그림 1A).
5. 조직 절편의 갓 자른 리본을 슬라이드 장착을 위해 미리 예열된 조직 부유조로 옮깁니다(그림 1B, C).
   참고: 따뜻한 물은 부분의 주름을 "다림질"하는 데 도움이 됩니다(그림 1C).
6. 각 섹션을 순차적으로 처리할 때 포셉을 사용하여 리본에서 단일 섹션을 분리합니다(그림 1D).
7. 미리 레이블이 지정된 현미경 슬라이드에서 단일 섹션을 수집합니다.
   1. 현미경 슬라이드를 단면 아래의 비스듬히 잠기고 조직 섹션의 가장자리가 슬라이드에 닿도록 슬라이드를 배치합니다(그림 1E).
   2. 조직 섹션과 접촉한 후 슬라이드를 부유식 욕조에서 천천히 당겨 조직 섹션이 물에서 나올 때 슬라이드에 대해 플러시를 곧게 펴도록 합니다(그림 1F).
8. 슬라이드 당 1 개의 조직 섹션을 마운트하고 모든 섹션이 수집 될 때까지 반복하십시오.
9. 슬라이드 장착형 조직 절편을 실온(RT)에서 완전히 건조시키십시오.

2. 병리학 적 검토

1. 각 블록⁹에 대해 하나의 대표적인 조직 절편에 대해 H&E 염색을 수행한다.
2. 갓 염색 된 H & Es를 제출하여 보드 인증 병리학 자의 병리학 적 검토를 받으십시오.
   참고: 검토 중에 병리학자는 각 조직의 종양 함량 비율을 결정 및 기록하고 각 H&E 슬라이드의 종양 영역을 원으로 표시합니다( 그림 2 및 그림 3, 행 1 참조). 표 1은 도 3, 행 1에 도시된 샘플 A-E에 대한 H&E의 병리학적 검토 동안 결정된 세포성에 의한 종양 함량 백분율을 개략적으로 설명한다. 종양 함량이 <60%인 절편은 매크로 해부⁷이 필요합니다. 핵산 추출에 필요한 절편의 수는 원형의 종양 영역의 크기에 따라 달라진다. 프로토콜의 섹션 1에서 섹션이 충분하지 않고 추가 절단이 가능한 경우 추가 섹션을 잘라야 할 수도 있습니다.

3. 탈파라핀화

1. 흄 후드에서 희석되지 않은 조직학 등급 d-Limonene 또는 d-Limonene 기반 용매로 유리 스테인딩 접시 2 개를 미리 채우고 희석되지 않은 200 증거 분자 등급 에탄올로 1 잔 스테인딩 접시를 미리 채 웁니다.
   주의: d-리모넨이 피부와 눈에 닿지 않도록 하고, 증기나 안개의 흡입을 피하며, 발화원을 멀리하십시오. 에탄올을 열, 불꽃 및 화염으로부터 멀리하고, 피부나 눈과의 유출 및 접촉을 피하고, 환기를 잘하고, 증기를 호흡하지 마십시오.
   주: 랙된 슬라이드를 잠길 수 있도록 접시를 충분히 채우십시오(그림 4A). 표시된 20-슬라이드 염색 접시를 채우기 위해 250 mL가 필요합니다. 40 슬라이드마다 d-리모넨 및 에탄올 세척을 교체하십시오. D-리모넨_(C10H16)은 조직학적 방법론에서 더욱 보편화되고 있는 자일렌에 대한 대안이고, 유사하게 효과적이며, 독성이 적고, 추출 후 양질의 핵산^{10,11,12,13,14}를 산출한다. 비록 이 프로토콜이 더 많은 생체친화성 대안들⁽¹⁵)을 사용하여 수행될 수 있지만, 추출된 핵산 품질에 대한 그들의 효과는, 만약 있다면, 결정되어야 한다.
2. 스테인팅되지 않은 FFPE 조직 장착 슬라이드를 유리 코플린 슬라이드 랙에 랙합니다(그림 4A, 삽입).
3. 랙된 슬라이드를 d-리모넨에 담그고 1 분 동안 2 분 동안 세척하십시오. 처음 20 초 동안 부드럽게 동요하십시오.
   주: 세척 사이의 이월을 최소화하기 위해 세척에서 슬라이드 랙을 분리할 때 랙이 잠깐 방전되도록 한 후 티슈 페이퍼의 랙 바닥을 부드럽게 닦아 과도한 세척을 제거하십시오.
4. 랙된 슬라이드를 희석되지 않은 D-리모넨에 담그고 2분 동안 2 분 동안 세척하십시오. 처음 20 초 동안 부드럽게 동요하십시오. 랙을 분리, 드레인 후 다시 닦으십시오.
5. 랙된 슬라이드를 에탄올 세척에 2분 동안 잠수시키고; 처음 20 초 동안 부드럽게 동요하십시오. 랙을 분리하고 흡수 조직에 올려 놓아 배수하십시오. 슬라이드를 적어도 10 분 동안 공기 건조시키되 2 시간을 넘지 않도록하십시오.

3. 매크로 해부

1. 벤치에서 코플린 유리 병에 DNase / RNase 유리 물에 50 mL의 3 % 글리세롤을 미리 채 웁니다.
   참고: 매 40 슬라이드 후에 글리세롤 세척을 교체하십시오.
2. 마이크로튜브 당 160 μL의 조직 소화 완충액으로 1.5 mL 마이크로튜브를 사전 라벨링하고 프리필한다.
   참고: 마크로해독 후 수행된 핵산 추출은 DNA/RNA FFPE 추출 키트(표 자료)를 사용했습니다. 따라서, 이 프로토콜에 사용된 조직 소화 완충액은 10 μL의 프로테이나제 K와 150 μL의 PKD 완충액으로 구성되었다.
3. H&E의 병리학적 표시를 탈파라핀화된 조직 슬라이드의 뒤쪽으로 추적합니다.
   참고: 탈파라핀화되지 않은 조직(그림 3, 행 2 및 그림 4B)과 비교했을 때, 탈파라핀화된 조직은 흰색이며 매우 잘 보입니다(그림 3, 행 3 및 그림 4C). 이러한 가시성과 탈파라핀화된 조직 특징의 식별성이 높아져 거대 해부를 가능하게 합니다. H&E를 벤치에 내려놓고 H&E가 검토한 일치하는 병리학자의 뒷면에 탈파라핀화된 슬라이드의 앞쪽을 놓습니다(그림 4D). 탈파라핀화된 조직을 H&E 조직과 정렬합니다(그림 4E). 병리학자의 표식을 추적하는 것은 거시 해부 과정에서 중요한 단계이며, 가능한 한 정확하게 이러한 표시를 재현하기 위해주의를 기울여야합니다. 이는 샘플 B, D 및 E와 같은 작고 단절된 조직에 특히 어려울 수 있습니다(그림 3, 그림 4E 및 그림 4E 인셋 i). 추적을 돕기 위해, 병리학자가 그린 표시를 추적하기 위해 잉크가 많은 미세 또는 초미세 니브 마커 (그림 4E, inset ii)를 사용해야합니다. 에탄올 와이프는 오류를 제거하고 필요한 경우 재추적을 허용하는 데 유용 할 수 있습니다.
4. 이제 표시된 탈파라핀화된 슬라이드 조직을 위로 향하게 하고 깨끗한 면도날의 모서리로 마커의 선을 추적하여 종양 영역의 가장자리를 미리 자릅니다.
5. 각 슬라이드를 순차적으로 처리하고, 탈파라핀화된 슬라이드를 3% 글리세롤 용액에 담그십시오. 슬라이드를 천천히 제거하기 전에 조직이 완전히 잠겨 있는지 확인합니다(그림 4F).
   참고 : 글리세롤 딥의 목적은 조직 수집을 돕기 위해 조직을 약화시키는 것뿐만 아니라 수집 된 조직을 배치해야하는 조직과 플라스틱 마이크로 튜브 사이에 반발을 일으킬 수있는 정전기의 축적을 줄이는 것입니다.
6. 과도한 글리세롤 용액을 제거하기 위해 조직으로 슬라이드 뒷면을 부드럽게 닦고, 슬라이드를 벤치에 눕히고, 측면을 아래로 향하게 닦아냅니다. 조직을 1-2 분 동안 잠깐 공기 건조시킵니다.
   참고 : 과도한 글리세롤을 추출 과정으로 옮기면 핵산 추출의 수율과 품질에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다. Tissues는 약간 습기가 있어야하지만 수집 할 때 눈에 띄게 젖지 않아야합니다.
7. 관심 있는 종양 영역이 슬라이드에 있는 위치에 따라 면도날의 평평한 가장자리를 사용하여 (a) 면도기를 사용하여 슬라이드에서 관심 있는 조직을 긁어내거나 수집하거나 (b) 관심 있는 종양 조직을 수집하기 전에 먼저 비종양 조직을 제거하고 폐기합니다(그림 3).
   참고: 수집된 조직은 블레이드 바닥에서 수집되거나 굴러가는 경향이 있습니다(그림 4G).
8. 나무 스틱을 사용하여 수집된 조직을 블레이드(그림 4H 및 인셋)에서 제거하고 적절한 사전 라벨이 부착되고 미리 채워진 마이크로튜브(그림 4I)로 옮깁니다.
   참고 : 소화 완충액은 나무 따기에서 조직을 액체로 "당기는"역할을합니다.
9. 핵산 추출을 진행한다.
   참고: 핵산 추출은 제조업체의 지침에 따라 DNA/RNA FFPE 추출 키트를 사용하여 완료되었으며, 생성된 핵산은 UV-vis 분광광도계를 사용하여 정량화되었습니다. 생성된 RNA를 디지털 유전자 발현 프로파일링 기반 DLBCL90 검정¹⁶ 상에서 실행하였다.

총 5개의 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL) FFPE 조직 블록을 절개하였고, 생성된 절편은 핵산 추출 전에 대량해부되거나 또는 그렇지 않은 것으로 나타났다. 추출된 RNA를 DLBCL90 분석16에서 실행하였다. 마크로디스크션된 샘플은 한 번은 5 μL의 RNA 스톡 농도를 사용하되 총 RNA 투입량의 300 ng 이하를 사용하고 한 번은 5 μL의 RNA 스톡을 사용하여 각각의 비해부된 대응물의 RNA 입력과 일치하도록 희석하여 두 번 실행하였다. DLBCL90 결과는 표 2에 요약되어 있습니다.

DLBCL은 상이한 치료 반응성을 갖는 3개의 별개의 기원 세포(COO) 아류형, 즉 GCB, ABC 및 분류되지 않은 또는 UNC17,18로 알려진 중간 그룹으로 구성된다. MYC, BCL2 및 BCL6을 단독으로 또는 조합하여 포함하는 전좌(이중 또는 삼중 히트)는 또한 DLBCL에서, 특히 GCB 서브타입19에서 빈번하게 관찰된다. DLBCL90 분석은 전임자인 Lymph2Cx 임상 분석의 확장으로, 따라서 DLBCL COO 아형 결정이 가능하지만 형광 계내 혼성화(FISH)16,20의 대안으로 디지털 유전자 발현을 사용하여 BCL2와 관련된 이중 히트(DH) 전좌를 보유하는 샘플을 확인하기 위해 주로 개발되었습니다. 표 2의 결과는 매크로 해부가 COO 또는 DHITsig 상태 요구가 조사된 샘플의 60%(3/5)를 요구한다는 것을 보여준다.

샘플 A의 매크로 해부는 COO 콜에 아무런 영향을 미치지 않았지만 DHITsig 콜을 NEG에서 UNCLASS로 변경했으며, 이러한 변화는 매크로 해부 된 샘플 RNA 입력과 유사한 확률 점수 (0.224, 0.254)와 관계없이 관찰되었습니다. 대조적으로, 샘플 C의 매크로 해부는 DHITsig 콜에 아무런 영향을 미치지 않았지만 COO 콜을 GCB에서 UNC로 변경했다. 다시, 이러한 변화는 거대해부된 샘플 RNA 입력과 무관하게 관찰되었다. 그러나, 0.117에서, COO 콜 확률은 감소된 RNA 입력을 갖는 거대해부된 샘플에 대한 콜 임계값 0.1에 더 가까웠다. 샘플 A와 유사하게, 샘플 E의 매크로 해부는 COO 콜에 영향을 미치지 않았지만 DHITsig 콜을 변경하였다. 그러나, 샘플 E의 경우 호출은 UNCLASS에서 NEG로 변경되었고, 상당히 유사한 확률 호출(0.849, 0.833)을 갖는 매크로 해부된 샘플 RNA 입력과 무관하게 그렇게 되었다. 특히, DHITsig NEG에 대한 이러한 콜 변화는 샘플 E가 ABC-DLBCL로 발견되었고, BCL2를 수반하는 이중 히트 전좌가 GCB-DLBCL19에서 독점적으로 관찰되는 것으로 보고되었다는 점을 감안할 때 생물학적으로 의미가 있다.

도 1: 마이크로톰을 이용하여 슬라이드 장착형 조직 절편을 생성한다. (A) 마이크로톰 척에 의해 제자리에 유지된 FFPE 조직 블록을 절단하여 순차적 FFPE 조직 절편의 리본을 생성한다. (B) 미리 담근 나무 막대기를 사용하여 리본을 마이크로 톰에서 수집하여 따뜻한 수조로 옮깁니다. (C) 물의 따뜻함은 조직 리본의 주름을 다림질하는 데 도움이됩니다. (d) 개별 FFPE 조직 절편은 두 절편의 접합부에 닫힌 포셉을 배치하고 포셉을 부드럽게 열어 조직 리본으로부터 제거되며, 이는 서로 절편을 분리한다. (e) 섹션은 유리 슬라이드를 비스듬히 잠그고 단면의 가장자리가 유리 슬라이드에 닿을 때까지 조직 섹션 쪽으로 측면을 부드럽게 움직여 물에서 수집됩니다. (F) 슬라이드와 섹션이 닿으면 물에서 슬라이드를 천천히 제거하여 조직 섹션이 슬라이드에 대해 플러시되도록 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 절편의 병리학 및 조직학적 검토. (A,B) H&E 조직 섹션은 보드 인증 병리학자에 의해 현미경 검토를 거칩니다. (C,D) 병리학자가 전체 조직을보고 100 % 종양 조직이 아니라는 것을 알게되면 병리학자는 마커를 사용하여 조직의 종양 영역을 둘러싸게됩니다. (E, F) 원래의 FFPE 조직 블록에 대해 표시된 H & E를 보유하는 것은 모든 조직이 종양 물질이되는 것은 아니라는 것을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 조직 샘플. 이 이미지는 병리학적으로 검토되고 종양 마킹된 H&Es (행 1), 처리되지 않은 슬라이드 장착형 FFPE 조직 절편 (행 2), 탈파라핀화 슬라이드 장착형 FFPE 조직 절편(행 3), 탈파라핀화 슬라이드 장착형 FFPE 조직 절편(행 4), 이 프로토콜을 입증하는 데 사용된 5개의 샘플(A-E)에 대한 탈파라핀화 및 마크로해부된 슬라이드 장착형 FFPE 조직 절편(행 5)을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: FFPE 조직 절편의 탈파라핀화 및 매크로-해부: (A) 흄 후드에서, 슬라이드 랙에 장착된 FFPE 조직은 두 개의 d-리모넨 세척 및 하나의 에탄올 세척으로 세척된다. (B,C) 세척 후, 모든 파라핀이 제거되었고, 조직 만 슬라이드에 남아 있으며, 이는 이제 미리 씻은 것에 비해 흰색이며 눈에 잘 띄게됩니다. (D) 탈파라핀화된 슬라이드-장착된 조직 섹션은 그의 일치하는 마크된 H&E의 뒷면에 아래로 향하게 배치된다. (E) H&E의 종양 영역 표시는 미세 또는 초미세 니브된 영구 마커를 사용하여 탈파라핀화된 슬라이드의 뒷면에서 추적된다 (F) 표시된 탈파라핀화된 슬라이드-장착된 조직 섹션은 글리세롤 세척에 담근 후 수집을 위해 조직 섹션을 감쇠시킨다. 슬라이드는 글리세롤로부터 천천히 제거되고, 슬라이드 조직을 벤치에 정면으로 올려 놓기 전에 과도한 글리세롤을 제거하기 위해 조직으로 닦아냅니다. (g) 깨끗한 면도날의 편평한 측면을 사용하여, 조직은 거대 해부되고, 병리학자 표식의 외부의 원치 않는 조직은 블레이드의 가장자리를 따라 수집되는 관심있는 조직을 수집하기 전에 폐기된다. (H) 나무 막대기는 칼날의 가장자리에서 수집 된 조직을 제거하는 데 사용됩니다. (I) 조직은 미리 표지된 마이크로튜브 미리 채워진 조직 소화 완충액으로 옮겨지고 핵산 추출을 위해 준비된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 병리학 검토 데이터. 표는 (a) 전체 조직 단면에서 생존 가능한 종양의 백분율, (b) 세포성에 의한 검토 동안 병리학자가 원으로 표시/표시한 영역에서 생존 가능한 종양의 백분율, (c) 전체 조직의 추정된 전체 종양 세포성(a x b), (d) 거시해부로 달성된 종양 세포성의 추정된 배수 증가를 보여주며, (e 및 f) 5 μm의 수염색되지 않은 FFPE 슬라이드-장착된 조직 절편을 매칭된 마크로디스크해 및 마크로해부된 샘플에 대해 생성된 RNA 농도로 추출하였다. %기타는 종양 조직이 아닌 주어진 샘플에 존재하는 다른 모든 조직을 의미하며, 결합 조직, 기질 섬유아세포, 혈관 및 다른 고유 기질 요소를 포함할 수 있다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: DLBCL90 디지털 유전자 발현 분석 결과. 다섯 개의 샘플(A-E)은 핵산 추출이 수행되기 전에 마크로해부되지 않았거나 마크로디스크해부되지 않았다. 생성된 RNA를 DLBCL90 검정 상에서 실행하였고, 이를 위해 최대 RNA 입력 부피는 5 μL이다. 비-거대-해부된 샘플은 5 μL의 스톡 RNA를 사용하여 실행되었다. 각 마크로해부된 샘플은 (a) 60ng/μL의 분취량이 가능하지 않은 한 5μL의 스톡 RNA를 사용하여 두 번 실행하였고, (b) 5μL의 스톡 RNA를 사용하여 그들의 비-거대해부된 대응물의 농도/투입량과 일치하도록 희석하였다. 접미사 _M는 해당 샘플이 매크로 해부되었음을 나타냅니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개 할 것이 없습니다.