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펩티도믹스 연구를 위한 아민의 환원 메틸화를 이용한 샘플 준비 및 상대적 수량

DOI:

10.3791/62971

⸱

November 4th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences, Bioscience Institute, Sao Paulo State University (UNESP), 2Biodiversity of Coastal Environments Postgraduate Program, Bioscience Institute, Sao Paulo State University (UNESP)

In This Article

Summary

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이 문서에서는 열 불활성화를 기반으로 한 시료 준비 방법을 설명하여 내인성 펩티드를 보존하여 분해 후 모독을 피하고, 동위원소 라벨링과 LC-MS를 사용하여 상대적 수량을 유지합니다.

Abstract

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펩티도믹스는 생물학적 샘플에서 펩타이드의 정성적 및 정량적 분석으로 정의될 수 있다. 주요 응용 분야에는 질병 또는 환경 스트레스의 펩티드 바이오마커 를 식별하고, 신경 펩티드, 호르몬 및 생리 활성 세포 내 펩티드를 식별하고, 단백질 가수분해제에서 항균 및 영양 펩티드를 발견하고, 프로테올리틱 프로세스를 이해하는 연구에 사용될 수 있습니다. 최근 시료 제제, 분리 방법, 질량 분석 기술 및 단백질 시퀀싱과 관련된 계산 도구의 사전은 확인된 펩티드 수 및 펩티돔의 증가에 기여하였다. 펩티도믹 연구는 세포에서 자연적으로 발생하는 펩티드를 자주 분석합니다. 여기서, 열불활성화에 기초한 샘플 준비 프로토콜이 기재되어 프로테아제 활성을 제거하고 온화한 조건으로 추출하므로 펩티드 결합 분열이 없다. 또한, 아민의 환원 메틸화에 의한 안정적인 동위원소 라벨링을 이용한 펩타이드의 상대적 양도 도시된다. 이 라벨링 방법은 시약이 시판되고, 다른 사람에 비해 저렴하고, 화학적으로 안정적이며, 단일 LC-MS 실행에서 최대 5개의 시료를 분석할 수 있기 때문에 몇 가지 장점이 있다.

Introduction

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"Omics" 과학은 DNA, RNA, 단백질, 펩타이드, 대사 산물 등과 같은 분자 세트의 심층 분석을 특징으로 합니다. 이러한 생성된 대규모 데이터 세트(유전체학, 전사학, 프로테오믹스, 펩티도믹스, 메타볼로믹스 등)는 생물학에 혁명을 일으켰으며 생물학적 과정에 대한 고급 이해로 이어졌다1. 용어 펩티도믹스는 20 세기 초에 소개되기 시작하고, 몇몇 저자는 proteomics2의 분기로 그것을 언급했습니다. 그러나, 펩티도믹스는 세포 과정 동안 자연적으로 생성된 펩티드 함량뿐만 아니라 이들 분자의 생물학적 활성의 특성화를 조사하는 것이 주요 관심사인 뚜렷한 특수성을 갖는다3,4.

처음에, 생리 활성 펩티드 연구는 에드먼 분해 및 방사선 면역을 통해 신경 펩티드와 호르몬 펩티드에 제한되었다. 그러나, 이들 기술은 고농도각 펩티드의 절연에 따라, 항체의 생성을 위한 시간, 교차 반응성 가능성 외에 글로벌 분석을 허용하지 않는다5.

펩티도믹스 분....

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Protocol

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펩티드 추출 및 환원 메틸화를 위한 다음 절차는 이전에 발표된 절차24,25,26,27에서 조정되었다. 이 프로토콜은 국립 동물 실험 통제 위원회 (CONCEA)의 지침을 따랐으며 상파울루 주립 대학의 생물 과학 연구소에서 동물 사용 윤리위원회 (CEUA)의 승인을 받았습니다. 프로토콜 단계는 그림 1에 표시됩니다.

참고: 초순수로 모든 수성 솔루션을 준비합니다.

1. 펩타이드 추출

  1. 세포 배양
    1. 15% 태아소 혈청과 1%페니실린-연쇄절제술을 함유한 덜벡코의 수정된 이글 배지에서 37°C에서 15cm 의 접시에 SHSY5Y 세포를 재배한다.
    2. 각 샘플에 대해 2-3 플레이트를 사용합니다. 세포를 100% 합류로 증가시면 됩니다.
    3. 치료 용 후 인산염 완충 식염수로 세포를 두 번 씻으하십시오. 다음으로,....

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Results

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질량 분광계에서 수행된 실행에서 얻은 결과는 질량 분광계 소프트웨어에서 열 수 있는 원시 데이터 파일에 저장됩니다. MS 스펙트럼에서, 2-5 라벨에 이르기까지 사용되는 라벨링 방식에 따라 표지된 펩티드를 나타내는 피크 그룹을 관찰할 수 있다. 예를 들어 그림 2에서 크로마토그래피 시간에서 검출된 피크 쌍은 동일한 실행에서 두 개의 동위원소 레이블만 사용된 실험에서 표시됩니다. 그림 3 은 각 LC-MS 런에서 3 및 4개의 서로 다른 레이블을 사용하여 긍정적인 결과의 다른 가능성을 보여줍니다. LC/MS 런에서 4 개 또는 5 개의 라벨을 사용하는 경우, 각 피크의 실제 강도 값을 얻기 위해 수정해야 하는 다른 태그와 표지된 펩타이드의 피크가 겹칠 수 있습니다(그림 4).

동위원소 라벨링은

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Discussion

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대부분의 펩티도믹스 연구에서, 중요한 단계 중 하나는 의심할 여지없이, 몇 분 후 프로테아제에 의해 생성 된 펩티드 단편의 존재를 피하기 위해 신중하게 수행해야하는 샘플 준비입니다. 비전자래드 샘플에서 제조된 뇌 추출물에 대한 초기 연구는 10kDa 마이크로필로테스에 존재하는 많은 단백질 단편을 보여주었다. 단백질 분해로부터 펩티드 스펙트럼을 피하기 위해 다른 접근법이 설명되었습니다: 집중 된 전자 레인지 조사 동물 희생6,8, 극저온 해부 다음 끓는 추출 버퍼31, 가정용 전자 레인지 오븐을 사용하여 조직의 전자 레인지 조사 후 9,26 . 세포 배양 및 일부 조직의 경우, 프로테아제 비활성화는 80°C에서 물을 첨가하여 직접 수행할 수 있다. 그러나, 신.......

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Disclosures

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경쟁적인 재정적 이익은 존재하지 않습니다.

Acknowledgements

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여기에 설명 된 기술의 개발 및 사용은 브라질 국가 연구위원회 보조금 420811/2018-4 (LMC)에 의해 지원되었다; Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) 교부금 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) 및 21/01286-1 (MEME). 기금은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 게시 결정 또는 문서 작성에 아무런 역할이 없었습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10kDa 차단 필터Merck MilliporeUFC801024Amicon Ultra-4, PLGC, Ultracel-PL 멤브레인, 10kDa
아세톤시그마-알드리치179124
아세토니트릴시그마-알드리치1000291000
중탄산암모늄시그마-알드리치11213
분석 컬럼(EASY-컬럼)EASY-컬럼(SC200)  10cm, ID75 &마이크로; m, 3 &마이크로; m, C18-A2
에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이시그마-알드리치E10521MS-222
플루오레스카민시그마-알드리치F9015
포름알데히드 용액시그마-알드리치252549
포름알데히드-13C, d2, 용액시그마-알드리치596388
포름알데히드-d2 용액: Sigma-Aldrich492620
포름산Sigma-Aldrich33015
흄 후드QuimisQ216
Hydrochloric acid - HClSigma-Aldrich258148
LoBind-Protein retention tubesEppendorfEP0030108116-100EA
LTQ-Orbitrap VelosThermo Fisher ScientificLTQ Velos
전자 레인지PanasonicNN-ST67HSRU
n Easy-nLC II nanoHPLCThermo Fisher ScientificLC140
PEAKS StudioBioinformatics Solutions Inc.버전 8.5
인산염 완충 식염수Invitrogen3002정제
precolumn (EASY-Column)Thermo Fisher Scientific(SC001)2 cm, ID100 µ m, 5 &마이크로; m, C18-A1
냉장 원심분리기HermleZ326K원뿔형 튜브용
냉장 원심분리기VisionVS15000CFNII마이크로튜브용
역상 정리 컬럼    (오아시스 HLB 1cc 카트리지)Waters186000383Oasis HLB 1 cc 카트리지
시아노보로하이드리드나트륨 - NaBD3CNSigma-Aldrich190020
시아노보로하이드리드나트륨 - NaBH3CNSigma-Aldrich156159
인산나트륨 이염기성Sigma-AldrichS9763참고: 0.2 M PB = 0.1 M 인산염 완충액 pH 6.8 (26.85 mL의 Na2HPO3 1M) 및 0.1 M 인산염 완충액 pH 6.8 (NaH2PO3 1M 23.15 mL)에서 물 250 ml까지
산나트륨 단일염기성 Sigma-AldrichS3139
SonicatorQsonicaQ55-110
표준 펩타이드프로테이맥스아미노산 서열: LTLRTKL
트리에틸암모늄 완충액 - TEAB 1 MSigma-AldrichT7408
트리플루오로아세트산 - TFASigma-AldrichT6508
초정제수Milli-QDirect-Q 3UV
진공 원심분리기GeneVacMiVac DNA 농축기
수조Cientec266
Xcalibur 소프트웨어ThermoFisher ScientificOPTON-30965
, 트 , 인

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. The era of 'omics unlimited. Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).
  2. Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. Plant peptides and peptidomics. Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).
  3. Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D.

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