방법 논문

골관절염 부전골 두께의 소프트웨어 지원 정량 측정

DOI:

10.3791/62973

⸱

2022년 3월 18일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Harrington Laboratory for Molecular Orthopedics, Department of Orthopedic Surgery, University of Kansas Medical Center, 2Division of Sports Medicine, Department of Orthopedic Surgery, University of Kansas Medical Center, 3Department of Biochemistry & Molecular Biology, University of Kansas Medical Center

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 방법론 문서는 뮤린 골관절염 무릎 관절과 정상적인 무릎 관절에서 조직학적 이전 골 두께를 대조군으로 정량화하는 소프트웨어 보조 정량측정 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 미묘한 두껍게에 매우 민감하며 초기 골관절염 부전 골골절 골격 변화를 감지하는 데 적합합니다.

초록

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부전 골 두껍게 하고 경화증은 동물 모델과 인간 모두에서 골관절염(OA)의 주요 특징입니다. 현재, 조직학적 기전 골 두꺼기의 심각도는 주로 반정적 채점 시스템에 기반한 시각적 추정에 의해 결정된다. 본 기사는 내측 반월상연수(DMM)의 불안정화에 의해 유도된 무릎 OA의 마우스 모델에서 체전건조골 두께를 정량적으로 측정하는 재현가능하고 쉽게 실행되는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 내측 대퇴 혼딜및 부전골 골이 일반적으로 DMM 유도 무릎 OA에서 발생하는 의료 경골 고원에 대한 관심 영역을 정의 한 후 조직 이미지에 체전 골 두께를 정량화하는 ImageJ 소프트웨어를 활용했다. 가짜 시술을 가진 무릎 관절에서 히스토로지 이미지가 컨트롤로 사용되었습니다. 통계 분석에 따르면 새로 개발된 정량형 아전드랄 골 측정 시스템은 낮은 관측자 간 변동성으로 매우 재현가능했다. 결과는 새로운 프로토콜이 널리 사용되는 시각 채점 시스템보다 미묘하거나 온화한 초통골 뼈 두껍게에 더 민감하다는 것을 건의합니다. 이 프로토콜은 조기 및 진행 골관절염 뼈 변화를 감지하고 OA 연골 등급과 함께 OA 치료의 생체 내 효능을 평가하기에 적합합니다.

서론

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관절 연골, 골관절염 및 아척골뼈(SCB) 경화증의 손실로 인한 관절 공간 협결에 의해 방사선학적으로 특징지어지는 골관절염(OA)은 관절염의 가장 흔한 형태이다1,2. OA의 병인학에서 동맥 뼈의 역할은 완전히 이해되지 않지만, 골다피성 형성 및 SCB 경화증은 일반적으로 원인 요인이 아닌 질병 과정의 결과라고 생각되지만, 동맥 뼈 아키텍처 /모양 및 생물학의 변화는 OA3,4의 개발 및 진행에 기여할 수 있습니다. . SCB 측정을 포함한 정확하고 쉽게 실행되는 OA 등급 시스템의 개발은 연구 실험실 간의 비교 연구와 OA 진행을 예방하거나 감쇠하도록 설계된 치료제의 효능을 평가하는 데 매우 중요합니다.

SCB는 얇은 돔 모양의 뼈 판과 반골 뼈의 기본 층으로 지어졌습니다. SCB 플레이트는 석회화 연골 바로 아래에 평행하게 누워 있는 피질 라멜라입니다. 동맥 및 정맥 혈관의 작은 가지뿐만 아니라 신경은 석회화 된 연골과 반골 뼈 사이의 통신, SCB 플레이트의 채널을 통해 관통. 기전 성 전골은 혈관, 감각 신경, 골수를 포함하고 SCB 플레이트보다 더 다공성 및 대사 활성이다. 따라서 SCB는 충격 흡수 및 지지 기능을 발휘하며 정상적인 관절5,6,7,8에서 연골 영양소 공급 및 신진 대사에도 중요합니다.

SCB 두껍게 (조직학에서) 및 경화증 (방사선 사진)은 OA의 주요 특징과 OA 병리학의 주요 연구 분야입니다. SCB 두껍게 측정은 OA 심각도에 대한 히스토로지학적 평가의 중요한 구성 요소입니다. 이전에 보고된 설치류 SCB 광물 밀도9뿐만 아니라 OA10,11,12,13의 설치류 모델에서 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영(micro-CT) 기반 정량적 SCB 측정을 통해 SCB 구조에 대한 이해와 OA 병리학의 SCB 변화의 역할을 향상시켰습니다. SCB 영역과 두께는 또한 특이적이고 비싼 뼈 히스토모홈트리 소프트웨어14를 가진 정교한 컴퓨터 시스템을 사용하여 조직학적 슬라이드로 정량화되었습니다. 그럼에도 불구하고, SCB 두껍게 그레이딩을 포함한 시각적 추정 기반 반정성 OA 채점 시스템은 특히 수많은 조직학적 이미지를 선별하기 위해 채점 시스템을 사용하기 쉽기 때문에 현재 마이크로 CT보다 더 널리 사용되고 있습니다. 그러나 대부분의 기존 OA 채점 시스템은 주로 연골 변화에 초점을 맞추고 있습니다15,16,17. SCB 두껍게를 온화하고, 보통, 중증으로 분류하는 널리 사용되는 골관절염 SCB 두께 채점 방법은 대체로 주관적이며, 그 신뢰성은 완전히 검증되지 않았다15. 안정적이고 쉽게 실행되는 단계별 골관절염 SCB 두께 측정 프로토콜은 완전히 개발되지 않았거나 표준화되지 않습니다.

이 연구는 OA의 마우스 모델에서 SCB 두께를 정량적으로 측정하기 위해 재현 가능하고 민감하며 쉽게 실행되는 프로토콜을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 당사의 엄격한 측정 테스트 및 통계 분석에 따르면 이 ImageJ 소프트웨어 지원 정량 측정 프로토콜은 정상 및 골관절염 무릎 관절 모두에서 SCB 두께를 정량화할 수 있음을 입증했습니다. 새로 개발된 프로토콜은 널리 사용되는 시각적 채점 시스템보다 가벼운 SCB 변경에 재현가능하고 민감합니다. 그것은 초기 골관절염 SCB 변화를 감지 하 고 OA 연골 등급과 함께 OA 치료의 생체 효능을 평가에 사용할 수 있습니다.

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프로토콜

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이 프로토콜에 포함된 모든 동물 절차는 모든 연방 및 주 법률 및 규정을 준수하여 캔자스 대학 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 쥐에 무릎 OA의 창조

  1. 10-11주에 22개의 야생형 BALB/c 마우스에서 Glasson et al.18 에 의해 기술된 바와 같이 내측 반월상연골(DMM)의 외과적 불안정에 의해 무릎 OA의 마우스 모델을 생성한다. 같은 배경과 나이를 가진 8개의 마우스에 통제 절차로 가짜 수술을 수행합니다.
    참고: 남녀 모두 원래 프로젝트에 사용되어 성별 을 생물학적 변수로 고려하기 위한 NIH 요구 사항을 충족시켰지만 성차이 검사는 이 프로토콜의 범위가 아닙니다.
  2. 이소플루란의 흡입으로 동물을 마취한다. 호흡 속도/노력 및 발가락/꼬리 핀치에 대한 반응 부족을 모니터링하여 마취의 깊이를 확인하십시오. 동물을 척추 위치에 놓습니다.
  3. 무릎 부위에 피부를 면도하고 포비도네 요오드 + 알코올 피부 스크럽으로 피부를 청소; 세 번의 교대 주기.
  4. 수술 현미경으로 오른쪽 무릎에 DMM 절차를 수행합니다. 내측 파라 파텔라 절개(길이 1.2-1.5 cm)를 통해 무릎 관절을 노출시키고 관절 캡슐을 절개합니다. 슬개골과 슬개골 힘줄을 그대로 유지합니다. 내측 반월상 연골 인대 (MML)를 조심스럽게 노출 한 후 내측 반월 상 연골을 불안정하게하기 위해 마이크로 수술 가위로 변속합니다.
  5. MML이 시각화되었지만 형법화되지 않은 제어 절차로 오른쪽 무릎에 가짜 수술을 수행하십시오.
  6. 8-0으로 조인트 캡슐을 닫습니다. DMM 및 샴 시술 모두에 대해 7-0 의 흡수성 봉합사를 가진 흡수성 폴리글락틴 봉합사 및 피부 절개는 치유가 발생한 후 무릎의 적절한 사용을 보장합니다.
  7. SR Buprenorphine (0.20-0.5 mg/kg) 피하 (SC) 항성 게증에 대 한 수술 절차 직전에 주입 (SC) 단일 주사 후 최대 72 시간 까지 통증 완화를 제공. 수술 후 수술된 동물을 모니터링합니다.
  8. 수술 후 2, 8, 16주에서 CO2 챔버를 사용하여 동물을 안락사시합니다. 무의식 후, 물리적 인 방법으로 동물의 죽음을 확인 (가슴 구멍을 여는). 안락사의 이 방법은 미국 수의학 협회 (AVMA)의 안락사에 패널의 권고와 일치합니다.
  9. DMM 수술 후 2, 8, 16주, 샴 수술 후 2주 및 16주 후에 무릎 관절을 수확하여 OA 심각도 또는 SCB 가 두꺼워진 다른 각도로 마우스 무릎 관절을 얻습니다.

2. 조직 섹션 및 조직학적 이미지 의 준비

  1. 마우스 무릎 관절 조직 샘플을 2% 파라포름알데히드로 수정하고, 파라핀에 포함된 25% 포름산으로 탈칼시화하고, 내측 및 측면 구획을 모두 검사합니다.
  2. 미세토메를 사용하여 무릎 의 후방 측에서 무릎 표본을 자르고 70-80 μm 간격으로 5 μm 두께의 조직 섹션을 수집하여 전체 무릎 관절을 가로 질러 약 40 개의 조직 슬라이드를 얻습니다. 마이크로미터 보조 추정에 따르면 슬라이드 번호 1-6은 극후방, 11-18중반, 중전방에서 23-30, 무릎 관절의 극전방 부분에서 35-40입니다. 추가 얼룩에 대한 중간 섹션을 폐기하거나 수집합니다.
  3. 제조업체의 지침에 따라 Safranin-O 및 빠른 녹색 얼룩을 수행하여 5개의 슬라이드마다 연골 세포와 행렬을 구체적으로 식별합니다. 이전에 설명된 바와 같이 세포 및 조직 수준에서 무릎 관절을 검사하는 제조업체의 지침에 따라 Hematoxylin-Eosin 염색을 수행19,20,21,22.
  4. 디지털 카메라가 장착된 현미경으로 조직학적 이미지를 습득합니다. 일반적인 조직병리학적 분석 및 조직학 OA 등급은 이전에 설명된 바와 같이 수행되었다15,19,20,21,22.

3. ImageJ 소프트웨어로 골관절염 부전건조증 뼈의 정량적 측정

  1. ImageJ 소프트웨어를 다운로드하고 관심있는 히스토로지 이미지를 엽니 다.
    1. https://imagej.nih.gov/ij/ 자바 1.8.0_172로 번들로 제공되는 ImageJ를 다운로드하십시오.
    2. ImageJ 프로그램을 엽니다. 리본의 파일 탭을 클릭하고 열린 옵션을 클릭하여 히스토로지 이미지를 엽니다.
    3. 파일 디렉터리 주소를 찾고, 그림 파일을 선택하고, 열기를 클릭 합니다.
  2. 조직학적 이미지의 마이크로미터로 ImageJ를 교정합니다.
    1. 직선 도구를 사용하여 마이크로미터에서 한 단위길이를 스케치하고 >(다음) 설정 눈금 분석을 클릭합니다. 알려진 거리 및 픽셀 종횡비를 1로 설정하고 확인을 클릭합니다. ImageJ는 마이크로미터의 단위 길이로 픽셀 길이를 변환할 수 있습니다.
    2. 측정된 계수를 영역으로 설정합니다. > 측정 설정 분석 및 새 창 아래 의 임계값 상자에 대한 제한을 확인합니다. 이 단계는 ImageJ를 설정하여 선택한 "임계값" 내에서 매개 변수 "영역"을 측정합니다.
  3. 총 부전건조뼈(SCB) 관심 영역을 측정합니다.
    1. 내측 대퇴 추도(MFC) 및 내측 선골 고원(MTP)의 피질 플레이트에 인접한 SCB 피질 플레이트 및 기초 반구 뼈의 일부를 각각 의로에 대한 특정 치수로 커버하는 도 1A의 주황색 상자에 도시된 바와 같이 SCB 관심 영역(ROI)을 정의한다. 골관절염 SCB 두껍게 하는 것은 일반적으로 이 지역에서 생깁니다. 검사된 모든 관절에 대해 각 MFC 또는 MTP에서 동일한 모양과 치수를 가진 SCB ROI를 정의하여 모든 동물에 대해 동일한 크기의 특정 ROI를 측정했습니다.
    2. ImageJ의 메인 창 아래에 다각형 선택 도구를 사용하여 관심 있는 총 SCB 영역의 윤곽선을 스케치합니다.
      참고: 선택 도구는 시스템에 측정된 영역을 제한하는 임계값을 제공합니다.
    3. 총 SCB 영역 측정: 임계값을 선택한 후 측정 > 분석합니다. 영역 측정이 있는 "결과" 창이 열립니다.
  4. 골수 없이 단단한 뼈를 포함하는 뼈 물질 영역을 측정합니다.
    1. 전체 SCB 영역 외부 영역을 제외하려면 > 지우기 외부 편집을 클릭합니다.
      참고: 외부 지우기 옵션을 클릭한 후에는 전체 SCB 영역만 표시됩니다. 총 SCB 영역 외부의 사진은 검은색으로 바뀝니다. 이 단계를 통해 관찰자는 관심 영역 내의 뼈 물질 영역에 집중할 수 있습니다.
    2. "임계값 색상" 창을 열기 위해 > 색상 임계값을 조정하려면 이미지를 클릭> 합니다. "임계값 색상" 창 하단의 원본 을 클릭하여 그림을 원래 상태로 복원합니다. 3.3.2 단계에서 선택 도구를 사용하여 뼈 물질 영역에 작은 상자를 그립니다. "임계값 색상" 창 하단의 샘플 옵션을 클릭하여 골격 물질 영역을 정의합니다.
      참고: "임계값 색상" 창의 "샘플" 옵션을 사용하면 ImageJ가 총 SCB 영역에서 골격 물질 샘플 영역과 동일한 모든 픽셀을 선택할 수 있습니다. 선택한 뼈 물질 영역이 빨간색으로 바뀝니다.
    3. 임계값 색상 균형 창 하단에서 선택 하여 영역 측정 임계값을 만듭니다. ImageJ 메인 메뉴에서 측정 > 분석 한 다음 뼈 물질 영역 측정 결과가 "결과" 창에 표시됩니다.
    4. 총 SCB 영역 및 뼈 물질 영역의 데이터를 저장합니다.
  5. 총 SCB 영역 내에서 뼈 물질 두께(mm2/1.0 mm2)를 나타내는 총 SCB 영역(mm2)에 대한 뼈 물질 영역(mm2)의 비율을 계산합니다.
  6. DMM 유도 OA의 극후방, 중후방, 중전방 및 극전방 영역(2.2단계에서 설명된 대로)의 히스토리학적 단면/이미지(3.1-3.5단계에 설명된 대로)의 SCB 두께를 측정하여 6개의 무릎 관절(그림 1B)의 영역별 SCB 두께를 평가한다.
    참고: 이는 골관절염 SCB가 연골 병변과 공동 국한되는 것으로 알려져 있기 때문에 이러한 정량적 측정 프로토콜의 신뢰성을 검증할 수 있으며, SCB 농축을 인한 골관절염 연골 손상이 설치류 무릎 관절의 체중 베어링 영역(중간 부분)에서 더 심각하다는 것을 알 수 있다14,15. 따라서, 골관절염 SCB 농축의 정량적 측정을 위해 중간 섹션을 사용하는 것이 적절하다.

4. 통계

  1. SCB 두께의 정량적 측정 및 시각적 채점데이터를 사용하여 통계 분석을 수행합니다. Pearson의 상관 관계 계수 분석을 통해 관찰자 간 가변성과 재현성을 결정합니다.
  2. 학생의 t-테스트 또는 단방향 ANOVA를 사용하여 연구 그룹 간의 차이점을 결정하고 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 사후 테스트(Tukey)를 수행합니다. 통계적으로 유의하려면 0.05 미만의 p 값을 고려하십시오.

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결과

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시각적 추정 채점과 ImageJ 지원 정량 측정 간의 재현성 비교:
48개 관심 지역(ROI) (24MFC 및 24 MTP)의 SCB 두께는 24개의 무릎/동물로부터 각 무릎의 중간 섹션에서 정의된 3명의 독립적인 개인이 문헌에 설명된 바와 같이 기존의 0-3 시각적 채점 방식을 사용하여 득점되었으며, 여기서 0 = 정상(SCB 두껍게 없음), 1 =보통, 2 =중등도, 및 3[SCB] 이러한 이미지는 DMM 또는 가짜 시술 후 2, 8 및 16주에서 세 가지 수술 후 시간 지점에서 선택되었습니다. 일반적으로, DMM 절차를 가진 마우스는 2 주 수술 후 에서 시각적 SCB 두껍게 점수 0을 보여주었으며, 8 주에 1-2 점수를 매기고, 16 주에 2-3 점수를 받았다. 이러한 히스토티스 이미지의 SCB 두께는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 세 명의 다른 독립적인 관찰자에 의해 정량적으...

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토론

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SCB 두껍게 측정은 OA 심각도에 대한 히스토로지학적 평가의 중요한 구성 요소입니다. 대부분의 기존 OA 채점 시스템은 주로 연골 변화에 초점을 15,16,17. SCB 가중을 온화하고, 중등도, 중증으로 분류하는 널리 사용되는 뮤린 골관절염 SCB 두께 채점 방법은 크게 주관적이며, 그 신뢰성은 완전히 검증되지 않았다15. 본 연구는 SCB 두께를 정량화하기 위한 새로운 측정 프로토콜을 개발 및 검증하여 마우스에 무릎 OA 생성, 조직 섹션 및 조직학적 이미지 의 준비, ImageJ 소프트웨어로 골관절염 아분드리아 뼈의 정량적 측정, 프로토콜의 민감성과 재현성을 검증하기 위한 통계 적 분석.

이 프로토콜의 일반적인 기술은 ImageJ 소프트웨어의 지시를 따르지만, 새로...

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공개 사항

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저자는 경쟁적인 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 글

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이 작품은 국립 관절염 및 근골격계 및 피부 질환 국립 연구소 (NIH)에 의해 지원되었다 상 번호 R01 AR059088, 국방부 (DoD) 연구 상 번호 W81XWH-12-1-0304, 메리와 폴 해링턴 저명한 교수 에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Safranin-OSigma-AldrichS8884
패스트 그린Sigma-AldrichF7252
HematoxylinSigma-AldrichGHS216
EosinSigma-AldrichE4382
illustratorAdobe해당 없음

참고문헌

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