여기서 우리는 전통적인 방법에 록 억제제 Y-27632를 추가하여 인간 칭기발 상피 세포의 격리 및 배양에 대한 변형된 방법을 제시한다. 이 방법은 더 쉽고 시간이 많이 걸리며 줄기 세포 특성을 향상시키며 실험실과 임상 응용 분야에서 더 많은 수의 고잠재 상피 세포를 생성합니다.
여기서 우리는 전통적인 방법에 록 억제제 Y-27632를 추가하여 인간 칭기발 상피 세포의 격리 및 배양에 대한 변형된 방법을 제시한다. 이 방법은 더 쉽고 시간이 많이 걸리며 줄기 세포 특성을 향상시키며 실험실과 임상 응용 분야에서 더 많은 수의 고잠재 상피 세포를 생성합니다.
gingival 조직은 치주 조직을 보호하고 많은 구강 기능에 있는 의미 있는 역할을 하는 첫번째 구조물입니다. gingival 상피는 치지항 조직의 중요한 구조, 특히 치주 조직의 수리 및 재생에서. gingival 상피 세포의 기능을 연구하는 것은 구강 결함을 복구하고 생체 재료의 호환성을 검출하는 것과 같은 중요한 과학적 가치가 있습니다. 인간 gingival 상피 세포는 높게 분화된 각질 세포이기 때문에, 그들의 수명은 짧고, 통과하기 어렵습니다. 지금까지, 분리 및 배양 gingival 상피 세포, 직접 절제 방법 및 효소 방법이 있는 두 가지 방법이 있습니다. 그러나, 직접 적인 절제 방법을 사용하여 상피 세포를 얻는 데 필요한 시간은 더 길고, 효소 방법의 세포 생존율은 낮다. 임상적으로, gingival 조직의 취득이 제한되어 있으므로 안정적이고 효율적이며 간단한 체외 격리 및 배양 시스템이 필요합니다. 상피 세포의 성장을 선택적으로 촉진할 수 있는 Rho-관련 키나아제(ROCK) 억제제인 Y-27632를 첨가하여 전통적인 효소 방법을 개선했습니다. 당사의 변형된 효소 방법은 기존의 효소 방법의 단계를 단순화하고 직접 적인 절제 방법 및 효소 방법에 비해 상당한 이점을 갖는 상피 세포를 배양하는 효율성을 증가시킵니다.
치주 조직을 보호하는 제1라인 방어 구조인 인간 칭기바는 물리적 및 화학적 장벽1일뿐만 아니라 면역 반응에 참여하고 면역 장벽2,3을구성하는 다양한 종류의 염증 중물질을 분비한다. gingival 상피는 치주 조직의 수리 및 재생에 중요한 역할을한다. 따라서, 칭기발 상피의 방어 및 면역을 공부하는 것은 치주염의 발생, 진단 및 처리를 이해하는 데 큰 의미가 있습니다. 인간 칭기질 조직에서 gingival 상피 세포의 격리 및 배양은 칭기발 상피를 연구하는 데 필요한 첫 번째 단계입니다. 이러한 절차는 조직 공학을 위한 종자 세포 생산, 치주 관련 질병의 체외 모델 및 치주 결함을 복구하기 위한 재료와 같은 기본적인 수술이 필요합니다.
1 차적인 gingival 상피 세포는 시험관 4에 있는낮은 분할 비율에 의해 특징지이며, 연구원은 수십 년 동안 최적 격리 및 재배 방법을 찾고 있습니다. 현재까지, 두 개의 상이한 기술, 직접 절제 방법 및 효소 방법, 일반적으로 시험관 4에서1차 칭기발 상피 세포를 얻기....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
이 프로토콜에 사용되는 인간 조직은 기관의 인간 연구 윤리위원회의 지침에 따라 맥시안면 외과 부서에서 영향을 받은 치아의 추출에서 버려진 신선한 성인 gingival 조직입니다 (의정서 번호. GR201711, 날짜: 02-27-2017).
1. 준비
2. 시약 및 문화 매체 준비
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
도 1은 직접 절제 방법 및 수정된 효소 방법의 회로도도를 나타낸다. 직접 적인 절제 방법은 전체 과정에서 소화 효소가 필요하지 않습니다. 대조적으로, 전통적인 효소 방법은 일반적으로 기형 섬유아세포 층에서 상피 시트를 분리하기 위해 소화 효소, 디스파제 및 콜라게나아제 의 두 세트를 필요로하고, 다음 트립신은 현탁액으로 상피 세포를 방출합니다. 우리의 새로운 방법은 분리 단계를 생략하고 단순화 된 효소 방법입니다. 더욱이, G-배지에 Y-27632를 첨가하면 상피 세포 성장을 효과적으로 촉진한다. 직접 적인 박리 방법은 일반적으로 통과하기에 충분히 성장하는 gingival 상피 세포에 대한 약 2 주가 걸리고 쉽게 오염된다. 그러나, 새로운 방법에 의해 얻어진 진피세포의 수는 직접 적인 절제 방법에 의해 얻어진 것보다 훨씬 크며, 패혈증요건을 충족시키기 위해 평균 8일만 소요된다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
gingival 조직은 치주 무결성 및 건강을 유지하는 중요한 구조입니다. Gingival 상피 세포는 치주 조직의 수리 및 재생에 중요한 역할을 하며 경구 생물학, 약리학, 독성학 및 구강 점막 결핍을 포함한 과학 연구 및 임상 응용 프로그램 및 관련 분야에서 사용될 수 있다18. 따라서 경구상피세포(19)를수확하는 안정적이고 효율적인 방법을 개발할 필요가 있다. 1 차상 세포는 몇몇 통로 및 짧은 수명을 가진 완전히 분화한 세포의 종류입니다. 상피 세포를 배양하는 것은 섬유아세포5를배양하는 것보다 더 복잡한 것으로 입증되었습니다.
현재, 출판 된 문헌은 상피 세포의 격리 및 문화에 대한 다양한 프로토콜이 존재한다는 것을 보여줍니다. 그러나, 두 가지 방법, 직접 절제 방법 및 효소 방법은 이러한 프로토콜 중 가장 자주 사용 됩니다. 1910년, Ca.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
모든 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
이 작품은 산동성 자연과학재단(ZR2019ZD36)과 산동성 의 주요 연구 개발 프로그램(2019GSF108107)에서 X.W.에 의해 지원되었습니다. 산동성 주요 연구 개발 프로그램 (2018GSF118240)에서 J.G.에; 산동성 의료보건과학기술개발사업(2018WS163)과 산동성 의료보건과학기술개발사업(2019WS045)
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 이름 | 약어 & 코멘트 | ||
| 백작 자동 세포 계수기 | 상하이 Ruiyu Bio-science& 기술 Co.Ltd. | BBA0218AC | 자동 세포 계수 |
| CO2 인큐베이터 | Thermo Scientific | 51026333 | 세포 배양용 |
| Sorvall ST 16R 원심분리기 | Thermo Scientific | 75004380 | 세포 원심분리기 |
| 세포 배양 접시 | Eppendorf | 30702115 | 세포 배양용 |
| 50 ml 원심분리기 튜브 | KIRGEN | 171003 | 세포 원심분리용 |
| 1.5 ml 마이크로 원심 분리기 튜브 | KIRGEN | 190691J | 세포 소화를 위해 |
| Cell Strainer | Corning은 | 431792 | 세포 여과 |
| 인산염 완충 용액 | Solarbio Life Science | P1020-500 | 세척 용액 |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | 중화 매체의 구성 요소 |
| 정의 된 K-SFM | 수명 Technologies | 10785-012 | 치은 상피 세포 배양 배지 |
| 페니실린 스트렙토마이신 | Thermo Scientific | 15140-122 | 항생제 |
| 태아 소 혈청 | 생물학 산업 | 04-001-1AC5 | 중화 매체 |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | HGGEPCs 해리 |
| 희석 매체 | Life Technologies | 50-9701 | 코팅 매트릭스 |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | HGGEPC 절연 |
| 콜라겐 분해 효소 유형 I | Life Technologies | 17100-017 | HGGEPC 절연 |
| F12 영양 혼합물, Hams | Life Technologies | 31765035 | G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 구성 요소 17504044 | G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | G-medium |
| Y-27632 | 유전자 조작 | IAD1011 | ROCK 억제제 |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | G-medium |
| EGF 재조합 인간 단백질 | Gibco | PHG0311 | G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | 의 성장 인자 준비Dojindo Molecular Technologies | CK04 | 세포 증식 분석용 |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | HGGEPC의 분화 마커를 확인하기 위한 면역형광 염색용 |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | HGGEPC의 분화 마커를 확인하기 위한 |
| Vimentin | 세포 신호 전달 기술 | 3390 | 치은 섬유아세포의 면역 |
| , Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | |
| 의 분화 마커를 확인하기 위한 면역형광 염색용HGGEPC의 분화 마커를 확인하기 위한 면역형광 염색 | |||
| 토끼 anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | HGGEPC의 분화 마커를 확인하기 위한 면역형광 염색용, HGGEPC의 분화 마커를 확인하기 위한 면역형광 염색용 |
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청
허가 요청