방법 논문

Y-27632를 사용하여 1차 인간 칭기발 상피 세포의 격리 및 배양

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DOI:

10.3791/62978

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2021년 11월 6일

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1Department of Tissue Engineering and Regeneration, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 2Department of Orthodontics, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 3Department of Stomatology, Shengli Oilfield Central Hospital, 4Department of Pediatric Surgery, Shengli Oilfield Central Hospital, 5Ningbo Stomatology Hospital of Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College

이 논문에서

요약

여기서 우리는 전통적인 방법에 록 억제제 Y-27632를 추가하여 인간 칭기발 상피 세포의 격리 및 배양에 대한 변형된 방법을 제시한다. 이 방법은 더 쉽고 시간이 많이 걸리며 줄기 세포 특성을 향상시키며 실험실과 임상 응용 분야에서 더 많은 수의 고잠재 상피 세포를 생성합니다.

초록

gingival 조직은 치주 조직을 보호하고 많은 구강 기능에 있는 의미 있는 역할을 하는 첫번째 구조물입니다. gingival 상피는 치지항 조직의 중요한 구조, 특히 치주 조직의 수리 및 재생에서. gingival 상피 세포의 기능을 연구하는 것은 구강 결함을 복구하고 생체 재료의 호환성을 검출하는 것과 같은 중요한 과학적 가치가 있습니다. 인간 gingival 상피 세포는 높게 분화된 각질 세포이기 때문에, 그들의 수명은 짧고, 통과하기 어렵습니다. 지금까지, 분리 및 배양 gingival 상피 세포, 직접 절제 방법 및 효소 방법이 있는 두 가지 방법이 있습니다. 그러나, 직접 적인 절제 방법을 사용하여 상피 세포를 얻는 데 필요한 시간은 더 길고, 효소 방법의 세포 생존율은 낮다. 임상적으로, gingival 조직의 취득이 제한되어 있으므로 안정적이고 효율적이며 간단한 체외 격리 및 배양 시스템이 필요합니다. 상피 세포의 성장을 선택적으로 촉진할 수 있는 Rho-관련 키나아제(ROCK) 억제제인 Y-27632를 첨가하여 전통적인 효소 방법을 개선했습니다. 당사의 변형된 효소 방법은 기존의 효소 방법의 단계를 단순화하고 직접 적인 절제 방법 및 효소 방법에 비해 상당한 이점을 갖는 상피 세포를 배양하는 효율성을 증가시킵니다.

서론

치주 조직을 보호하는 제1라인 방어 구조인 인간 칭기바는 물리적 및 화학적 장벽1일뿐만 아니라 면역 반응에 참여하고 면역 장벽2,3을구성하는 다양한 종류의 염증 중물질을 분비한다. gingival 상피는 치주 조직의 수리 및 재생에 중요한 역할을한다. 따라서, 칭기발 상피의 방어 및 면역을 공부하는 것은 치주염의 발생, 진단 및 처리를 이해하는 데 큰 의미가 있습니다. 인간 칭기질 조직에서 gingival 상피 세포의 격리 및 배양은 칭기발 상피를 연구하는 데 필요한 첫 번째 단계입니다. 이러한 절차는 조직 공학을 위한 종자 세포 생산, 치주 관련 질병의 체외 모델 및 치주 결함을 복구하기 위한 재료와 같은 기본적인 수술이 필요합니다.

1 차적인 gingival 상피 세포는 시험관 4에 있는낮은 분할 비율에 의해 특징지이며, 연구원은 수십 년 동안 최적 격리 및 재배 방법을 찾고 있습니다. 현재까지, 두 개의 상이한 기술, 직접 절제 방법 및 효소 방법, 일반적으로 시험관 4에서1차 칭기발 상피 세포를 얻기 위해 실험실에서 사용된다4,5. 직접 적인 절제 방법은 낮은 양의 조직 시편과 간단한 격리 절차의 요구 사항과 같은 장점을 가지고 있지만, 더 긴 배양 시간과 오염에 대한 감수성의 단점이5. 효소 방법은 필요한 배양 시간을 단축하지만, 효율은 상대적으로 낮으며 사용되는 효소 및 매체에 따라 다릅니다. Kedjarune외. 6 서브컬쳐 (2 주) 전에 더 많은 시간을 필요로 하는 직접 적인 절제 방법은 효소 방법에 비해 칭기발 상피 세포를 배양하는 데 더 성공한 것으로 나타났다. 그러나, 이들 두 가지 방법을 비교하면, 클링베일 외7은 효소 방법이 경구 상피 세포의 1차 배양에 가장 좋은 결과를 가져온 것으로 나타났으며, 최단 기간(11.9일 대 14.2일) 내에 최적의 세포 수율을 얻을 수 있었다.

따라서, 경구 상피 세포의 격리 및 배양에 대한 보다 편리하고 효과적인 방법을 개발하는 것이 중요했다4. 우리는 이전에 Y-27632, Rho 관련 단백질 키나아제 (ROCK)의 억제제, 성인 피부 조직에서 인간 1 차형 표피 세포 및 각질 세포의 격리 절차를 단순화한다는 것을보고8,9,10. 우리는 G-배지를 개발, 자발적으로 진피 세포에서 표피를 분리하고 1 차성 표피 세포의 성장과 수율을 지원하는 새로운 조건부 접종 배지8,9,10. 본 연구에서는 G-배지와 Y-27632를 결합하여 gingival 상피 세포를 위한 새로운 혈청 없는 격리 및 배양 기술을 개발했습니다. 본질적으로, 우리의 방법은 기존의 2 단계 효소 방법의 단순화를 기반으로, 그래서 우리는 직접 절제 방법과 우리의 새로운 방법을 비교했다. 이 수정된 효소 방법은 칭기발 조직으로부터 칭기발 상피 세포를 분리하는 데 필요한 시간을 현저히 단축하고 칭기발 상피 세포를 배양하는 효율을 증가시킵니다.

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프로토콜

이 프로토콜에 사용되는 인간 조직은 기관의 인간 연구 윤리위원회의 지침에 따라 맥시안면 외과 부서에서 영향을 받은 치아의 추출에서 버려진 신선한 성인 gingival 조직입니다 (의정서 번호. GR201711, 날짜: 02-27-2017).

1. 준비

  1. 3% 페니실린/연쇄상구균(P/S)으로 보충된 10mL의 인산염 완충식식염(PBS)을 포함하는 15mL 튜브에서 신선한 성인 게이발 조직을 수집하고 조직을 4°C로 유지한다.
    참고: 절제 후 24시간 이내에 조직에 대해 자세히 설명합니다.

2. 시약 및 문화 매체 준비

  1. 세탁 용액 준비: 페니실린 (100 U/mL) 및 1.5 mL의 페니실린 (100 U/mL)와 1.5 mL (100 mg/L)와 PBS의 3 % P / S. 믹스 50 mL.
  2. 성장인자 함유 배지(G-medium라고 함): DMEM/F12(3:1) 배지1% P/S, 2% B27 보충제, 표피 성장 인자(EGF) 20 ng/mL, 섬유아세포 성장인자 2(FGF2), 40 μg/mL의 40μg/mL을 준비한다.
  3. 새로운 방법에 대한 효소 소화 용액 준비: Dispase 분말 125 mg과 DMEM의 50 mL에 타입 I 콜라게나아제 분말 125 mg을 용해하십시오.
    참고: 0.22 μm 여과기를 통해 모든 효소 솔루션을 필터링하고 4°C에 보관하십시오.
  4. 효소 소화를 중화시키기 위해 배지 의 500mL를 준비하십시오: 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 DMEM 배지에서 1% P/S.

3. 직접 적인 절제 방법

  1. 깅지발 조직 전처리
    1. 30 s에 대 한 75% 에탄올의 5 mL로 gingival 티슈를 세척. 이어서, 5분 동안 세척용액(2.1단계)으로 2회 헹구세요.
      참고: 직경 50mm의 세포 배양 접시에 모든 세초를 수행합니다.
  2. 깅지발 상피 세포 배양
    1. 깅지발 조직을 1mm3개로 자르고 100mm 세포 배양 접시에 뿌립니다. 절삭 작업에 미세 한 뾰족한 집게와 안과 가위를 사용합니다.
    2. G-배지(2.2단계)를 문화 요리에 넣습니다. 이어서, 문화 접시를 37°C에서 5% CO2 인큐베이터로 배양한다. 반전된 현미경(40x)을 사용하여 24시간마다 조직을 검사합니다.
    3. 상피 세포가 조직 조각 주위직경 2-5 mm로 전파되었을 때 칭기발 조직 조각을 제거하십시오. 2-4일마다 G-배지를 변경합니다.

4. 새로운 수정 된 효소 방법

  1. 깅지발 조직 전처리
    1. 이를 위해, 직접 절제 방법, 단계 3.1.1에 대해 설명된 것과 동일한 단계를 따릅니다.
  2. 칭기발 조직의 소화
    1. 치지발 조직을 약 <1mm 크기의 작은 조각으로 자르고 두 개의 살균 된 블레이드를 넣습니다. 두 개의 수술 용 블레이드로 파쇄하는 과정을 반복하십시오.
    2. 2.5 mg/mL 디스파스 + 콜라게나아제 용액 1mL을 깅지발 조직 조각을 포함하는 1.5 mL 원심분리기 튜브에 추가한 다음 37°C의 인큐베이터에서 15-20분 동안 튜브를 배양합니다.
    3. 조직이 투명하고 flocculent가되면, 소화를 종료하는 중화 용액의 1 mL을 추가합니다. 10-15회 위아래로 피펫팅하여 용액을 철저히 혼합합니다. 100 μm 메쉬 필터를 통해 솔루션을 전달합니다.
    4. 원심 분리기 200 x g에서 5 분 동안.
    5. 상체를 제거하고 성장 인자 함유 배지의 10mL에서 하단의 세포 펠릿을 재중단한다(단계 2.2). 셀 현탁액을 100mm 세포 배양 접시로 옮기. 세포 배양 접시에 Y-27632의 10 μM을 추가합니다.
    6. 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 세포를 배양한다. 오래된 G-배지를 2일마다 신선한 G-매체로 교체하십시오. 1일과 3일에 세포를 관찰하십시오.

5. 세포 패시징

  1. 인큐베이터에서 접시를 꺼내 소비 한 매체를 제거하고 PBS로 두 번 씻으십시오. 각 100mm 접시에 0.05% 트립신 2mL를 추가합니다.
    참고: 접시를 흔들어 트립신 솔루션과 접시 바닥 사이에 충분한 접촉이 있는지 확인합니다.
  2. 소화 과정을 위해 37°C에서 약 5분 동안 인큐베이터에 접시를 둡니다.
  3. 현미경 (40x)을 사용하여 세포를 검사하고 대부분의 세포가 접시의 바닥에서 분리되었는지 확인하십시오.
  4. 중화 용액의 2mL를 추가하여 소화를 멈추고 세포를 15mL 튜브로 옮춥니까. 파이펫 을 위아래로 10-15 번. 5 분 동안 200 x g에서 세포를 원심 분리합니다.
  5. 상체를 천천히 제거합니다. G-배지의 10mL로 세포를 다시 중단하고 세포의 수를 계산합니다.
  6. G-배지 10mL에 약 1 x 106 셀을 추가하고 각 100mm 접시에 10 μM Y-27632를 추가합니다.
  7. 2일마다 G-배지 및 Y-27632를 갱신합니다. 1일과 5일에 셀을 봅니다.

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결과

도 1은 직접 절제 방법 및 수정된 효소 방법의 회로도도를 나타낸다. 직접 적인 절제 방법은 전체 과정에서 소화 효소가 필요하지 않습니다. 대조적으로, 전통적인 효소 방법은 일반적으로 기형 섬유아세포 층에서 상피 시트를 분리하기 위해 소화 효소, 디스파제 및 콜라게나아제 의 두 세트를 필요로하고, 다음 트립신은 현탁액으로 상피 세포를 방출합니다. 우리의 새로운 방법은 분리 단계를 생략하고 단순화 된 효소 방법입니다. 더욱이, G-배지에 Y-27632를 첨가하면 상피 세포 성장을 효과적으로 촉진한다. 직접 적인 박리 방법은 일반적으로 통과하기에 충분히 성장하는 gingival 상피 세포에 대한 약 2 주가 걸리고 쉽게 오염된다. 그러나, 새로운 방법에 의해 얻어진 진피세포의 수는 직접 적인 절제 방법에 의해 얻어진 것보다 훨씬 크며, 패혈증요건을 충족시키기 위해 평균 8일만 소요된다.

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토론

gingival 조직은 치주 무결성 및 건강을 유지하는 중요한 구조입니다. Gingival 상피 세포는 치주 조직의 수리 및 재생에 중요한 역할을 하며 경구 생물학, 약리학, 독성학 및 구강 점막 결핍을 포함한 과학 연구 및 임상 응용 프로그램 및 관련 분야에서 사용될 수 있다18. 따라서 경구상피세포(19)를수확하는 안정적이고 효율적인 방법을 개발할 필요가 있다. 1 차상 세포는 몇몇 통로 및 짧은 수명을 가진 완전히 분화한 세포의 종류입니다. 상피 세포를 배양하는 것은 섬유아세포5를배양하는 것보다 더 복잡한 것으로 입증되었습니다.

현재, 출판 된 문헌은 상피 세포의 격리 및 문화에 대한 다양한 프로토콜이 존재한다는 것을 보여줍니다. 그러나, 두 가지 방법, 직접 절제 방법 및 효소 방법은 이러한 프로토콜 중 가장 자주 사용 됩니다. 1910년, Ca...

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공개 사항

모든 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 글

이 작품은 산동성 자연과학재단(ZR2019ZD36)과 산동성 의 주요 연구 개발 프로그램(2019GSF108107)에서 X.W.에 의해 지원되었습니다. 산동성 주요 연구 개발 프로그램 (2018GSF118240)에서 J.G.에; 산동성 의료보건과학기술개발사업(2018WS163)과 산동성 의료보건과학기술개발사업(2019WS045)

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
이름약어 & 코멘트
백작 자동 세포 계수기상하이 Ruiyu Bio-science& 기술 Co.Ltd.BBA0218AC자동 세포 계수
CO2 인큐베이터Thermo Scientific51026333세포 배양용
Sorvall ST 16R 원심분리기Thermo Scientific75004380세포 원심분리기
세포 배양 접시Eppendorf30702115세포 배양용
50 ml 원심분리기 튜브KIRGEN171003세포 원심분리용
1.5 ml 마이크로 원심 분리기 튜브KIRGEN190691J세포 소화를 위해
Cell StrainerCorning은431792세포 여과
인산염 완충 용액Solarbio Life ScienceP1020-500세척 용액
DMEMThermo ScientificC11995500중화 매체의 구성 요소
정의 된 K-SFM수명 Technologies10785-012치은 상피  세포 배양 배지
페니실린 스트렙토마이신Thermo Scientific15140-122항생제
태아 소 혈청생물학 산업04-001-1AC5중화 매체
0.05% TrypsinLife Technologies25300-062HGGEPCs 해리
희석 매체Life Technologies50-9701코팅 매트릭스
DispaseGibco17105-041HGGEPC 절연
콜라겐 분해 효소 유형 ILife Technologies17100-017HGGEPC 절연
F12 영양 혼합물, HamsLife Technologies31765035G-medium
B27 SupplementLife Technologies구성 요소 17504044G-medium
FGF-2 MilliporeMerck Biosciences341595G-medium
Y-27632유전자 조작IAD1011ROCK 억제제
FungizoneGibco15290026G-medium
EGF 재조합 인간 단백질GibcoPHG0311G-medium
Cell Counting Kit-8의 성장 인자 준비Dojindo Molecular TechnologiesCK04세포 증식 분석용
Rabbit Anti-Human CK18Abcamab82254HGGEPC의 분화 마커를 확인하기 위한 면역형광 염색용
Rabbit Anti-Human Cytokeratin10Abcamab76318HGGEPC의 분화 마커를 확인하기 위한
Vimentin세포 신호 전달 기술3390치은 섬유아세포의 면역
, Rabbit Anti-Human pan-ckBD550951HGGEPCs
rabbit anti-Ki67Abcam15580
의 분화 마커를 확인하기 위한 면역형광 염색용HGGEPC의 분화 마커를 확인하기 위한 면역형광 염색
토끼 anti-p75NGFRAbcamab52987HGGEPC의 분화 마커를 확인하기 위한 면역형광 염색용, HGGEPC의 분화 마커를 확인하기 위한 면역형광 염색용
을 통합했습니다 면역형광 염색용 형광 염색용의 분화 마커를 확인하기 위한 면역형광 염색용, HGGEPCs rabbit anti-p63 Biolegend 619002용, , ,

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