아노펠스 감비아모기의 라발 살리보리 땀샘의 해부 및 면역스테인팅

요약

성인 모기 침샘 (SG)은 바이러스와 기생충을 포함하여 모든 모기 매개 병원균을 인간 숙주에게 전염시키는 데 필요합니다. 이 비디오는 애벌레 (L4) 단계 Anopheles 감비아모기에서 SGs의 효율적인 격리와 추가 분석을 위한 L4 SGs의 준비를 보여줍니다.

초록

모기 침샘 (SGs)은 곤충 매개 병원체의 전송을 위한 필수 게이트웨이 기관입니다. 말라리아를 일으키는 원인이 되는 바이러스 및 Plasmodium 기생충을 포함하여 질병을 일으키는 에이전트는, SG 세포의 분비 구멍에 축적됩니다. 여기에서, 그(것)들은 후속 혈액 식사 도중 그들의 척추 동물 호스트에게 전송을 위한 태세입니다. 성인 땀샘이 초기 pupal SG 히스토시스를 넘어 지속되는 애벌레 SG 덕트 싹 잔재의 정교화로 형성됨에 따라, 애벌레 SG는 질병 전염을 제한하는 내정간섭을 위한 이상적인 표적입니다. 애벌레 SG 개발을 이해하면 형태학과 기능적응에 대한 이해를 높이고 이 장기를 대상으로 하는 새로운 개입 평가에 도움이 될 수 있습니다. 이 비디오 프로토콜은 Anopheles 감비아 모기에서 애벌레 SGs를 분리, 고정 및 염색하는 효율적인 기술을 보여줍니다. 25% 에탄올 용액으로 애벌레에서 해부된 땀샘은 메탄올 빙하 아세트산 혼합물에 고정되고 차가운 아세톤 세척이 뒤따릅니다. 인산염 완충식식염수(PBS)에서 몇 가지 헹구면 SG는 SG 발현 단백질에 대한 광범위한 마커 염료 및/또는 항세라로 염색될 수 있습니다. 애벌레 SG 절연을 위한 이 방법은 또한 시투 혼성화 분석, 그밖 전사 응용 프로그램 및 proteomic 연구 결과에 있는 조직을 수집하는 것을 이용될 수 있었습니다.

서론

말라리아는 2019년 1년에 거의 2억 3천만 건의 감염과 추정된 409,000명의 죽음을 일으키는 원인이 되는 중요한 공중 위생^{위협입니다.} 사망자의 대부분은 사하라 사막 이남아프리카에 있으며, 곤충 벡터가 아노펠스 감비아인기생충 플라스모듐 팔시파룸에의해 발생하며, 이 비디오 데모의 주제입니다. 이 수치는 세기의 전환기 이후 연간 사망률이 현저한 감소(>300,000명 감소), 2000년부터 2015년까지 관찰된 질병 비율의 유망한 감소는 가늘어지며, 질병^전염을제한하는 새로운 접근법의 필요성을 시사합니다 2. 말라리아를 통제하고 가능하게 제거하기 위한 유망한 추가 전략 중 CRISPR/Cas9 기지를 둔 유전자 편집 및 유전자 드라이브^3,4,5를사용하여 모기 벡터 용량을 표적으로 하는 것입니다. 실제로, 질병^전염감소에 가장 큰 영향을 미쳤던 모기 벡터(오래 지속되는 살충제 처리된 침대 그물의 확장된 사용을 통해)의 표적화이다 6.

프로토콜

1. 솔루션 및 도구 준비

1. 해부 용액 의 준비
   1. 해부 용액을 준비하려면 15 개의 플라스틱 튜브에 증류 된 H₂O의 7.5 mL에 100 % 에탄올2.5 mL을 추가하십시오. 튜브를 3번 반전하여 섞습니다.
      참고: 이 솔루션은 몇 주 동안 실온에서 저장할 수 있습니다.
2. 10배 인산완충식염식염수(PBS) 재고 준비
   1. 10x PBS 스톡을 준비하려면 17.8g Na₂HPO₄• 2H₂O, 2.4 g KH₂PO_4,80g NaCl, 2g KCl을 800mL의 탈온화 수를 추가하십시오. 고체가 완전히 녹을 때까지 저어접시에 저어줄과 섞으세요. 최종 부피를 정수물로 1L로 조정합니다.
      참고: 이 솔루션은 몇 달 동안 실온에서 저장할 수 있습니다.
3. 1x PBS 준비
   1. 멸균 유리 병에 H₂O의 90 mL에 10 x PBS의 10 mL을 추가합니다. 뚜껑을 단단히 닫고 3배 반전하여 섞습니다.
      참고: 용액은 몇 주 동안 4°C로 저장할 수 있습니다.
4. 고....

결과

타액선은 4단계 유충에서 해부하기 가 비교적 쉽습니다. 남성과 여성 애벌레는 여성의 등쪽 흉부하지만 남성의 등쪽 흉부를 따라 빨간색 줄무늬에 의해 후반 L4 애벌레 단계에서 구별 될 수 있지만 남성(그림 2). 우리는 또한 안테나 형태가 성인 모기에서 이 구조에서 관찰된 다름과 유사한 여성 L4 애벌레(그림2)보다남성에서 훨씬 더 정교하다는 것을 관찰합니다. L4 단계 동안 상당한 전반적인 성장과 함께, 타액 선은 L4¹²동안 루멘을 형성한다. Hoechst로 염색된 초기 L4 단계 유충에서 분리된 침샘은 좁은수축(도 3B,C)에의해 분리된 근위 및 탈모엽을 드러낸다. 성형 루멘은 가장 근접한 끝에 있는 타액 덕트에서 (도시되지 않음)에서 단상 엽을 통해 모든 방법을 확장합니다. 성형 루멘은 중후반.......

토론

본 명세서에서 기재된 프로토콜은 Drosophila SG 해부 프로토콜 및 성인 모기 해부^{프로토콜(14,15,16)으로부터}적응되었다. 그러나, 대부분의 마커는 성인 해부 및 SG 염색 방법을 사용할 때 지하 멤브레인(도시되지 않은 데이터)을 관통하지 않았다. 성인 프로토콜의 적응은 25% EtOH 용액에서 땀샘을 해부하고, MeOH와 빙하 아세트산의 조합으로 땀샘을 세척하고, 90 년대 아세톤 세척을 갖는 것을 포함했다. 원래 성인 프로토콜에서 성인 SG는 1x PBS^14,15,16로해부되었다. 25% EtOH 솔루션에서 해부하여 SG를 보존하고 염색 기간 동안 손상을 방지했습니다. 초기 해부를 수.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
KH2PO4	Millipore 시그마	P9791
Na2HPO4 &; 2H2O	밀리포어 시그마	71643
NaCl	Millipore Sigma	S7653
아세톤	Millipore 시그마	179124
브러시 with soft bristles	Amazon (SN NJDF) 디테일 페인트 브러시 세트	B08LH63D89
커버 슬립 (22 x 50 mm)	VWR	48393-195
DAPI (DNA)	ThermoFisher Scientific	D1306
에틸 알코올 200 proof	Millipore Sigma	EX0276
Gilson Pipetman P200 피펫	Gilson	P200
빙하 아세트산	시그마 Aldrich	695092
보석상 겸자, Dumont No. 5	Millipore 시그마	F6521
KCl	Millipore 시그마	58221
메탄올	Millipore 시그마	1414209
매니큐어	아마존 (샐리 한센)	B08148YH9M
나일 레드 (지질)	ThermoFisher Scientific	N1142
종이 타월 / 물티슈	ULINE	S-7128
페트리 플레이트 (퍼티 플레이트 만들기)	ThermoFisher Scientific	FB0875712
피펫 팁	Gilson	팁 E200ST
플라스틱 전사 피펫	Fisher 과학적	S304671
일차 항체 (예: Crb, Rab11)	발달 연구 하이브리도마 은행(DSHB); Andrew Lab	Mouse anti-Crb (Cq4) 또는 Rabbit anti-Rab11
형광 태그가 있는 2차 항체 (예: Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit)	ThermoFisher Scientific	A11008
퍼티 플레이트용 실리콘 수지 및 경화제	Dow Chemicals - Ximeter Silicone	PMX-200
슬라이드, 한쪽 끝에 서리 덥음, VWR 라벨링용	20 X 50 mm	48393-195
밀 배아 Agglutinin	ThermoFisher Scientific	W834