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방법 논문

아노펠스 감비아모기의 라발 살리보리 땀샘의 해부 및 면역스테인팅

4.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/62989

⸱

2021년 9월 30일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Tufts School of Medicine, 3Department of Biomedical Sciences, Idaho College of Osteopathic Medicine

이 논문에서

요약

성인 모기 침샘 (SG)은 바이러스와 기생충을 포함하여 모든 모기 매개 병원균을 인간 숙주에게 전염시키는 데 필요합니다. 이 비디오는 애벌레 (L4) 단계 Anopheles 감비아모기에서 SGs의 효율적인 격리와 추가 분석을 위한 L4 SGs의 준비를 보여줍니다.

초록

모기 침샘 (SGs)은 곤충 매개 병원체의 전송을 위한 필수 게이트웨이 기관입니다. 말라리아를 일으키는 원인이 되는 바이러스 및 Plasmodium 기생충을 포함하여 질병을 일으키는 에이전트는, SG 세포의 분비 구멍에 축적됩니다. 여기에서, 그(것)들은 후속 혈액 식사 도중 그들의 척추 동물 호스트에게 전송을 위한 태세입니다. 성인 땀샘이 초기 pupal SG 히스토시스를 넘어 지속되는 애벌레 SG 덕트 싹 잔재의 정교화로 형성됨에 따라, 애벌레 SG는 질병 전염을 제한하는 내정간섭을 위한 이상적인 표적입니다. 애벌레 SG 개발을 이해하면 형태학과 기능적응에 대한 이해를 높이고 이 장기를 대상으로 하는 새로운 개입 평가에 도움이 될 수 있습니다. 이 비디오 프로토콜은 Anopheles 감비아 모기에서 애벌레 SGs를 분리, 고정 및 염색하는 효율적인 기술을 보여줍니다. 25% 에탄올 용액으로 애벌레에서 해부된 땀샘은 메탄올 빙하 아세트산 혼합물에 고정되고 차가운 아세톤 세척이 뒤따릅니다. 인산염 완충식식염수(PBS)에서 몇 가지 헹구면 SG는 SG 발현 단백질에 대한 광범위한 마커 염료 및/또는 항세라로 염색될 수 있습니다. 애벌레 SG 절연을 위한 이 방법은 또한 시투 혼성화 분석, 그밖 전사 응용 프로그램 및 proteomic 연구 결과에 있는 조직을 수집하는 것을 이용될 수 있었습니다.

서론

말라리아는 2019년 1년에 거의 2억 3천만 건의 감염과 추정된 409,000명의 죽음을 일으키는 원인이 되는 중요한 공중 위생위협입니다. 사망자의 대부분은 사하라 사막 이남아프리카에 있으며, 곤충 벡터가 아노펠스 감비아인기생충 플라스모듐 팔시파룸에의해 발생하며, 이 비디오 데모의 주제입니다. 이 수치는 세기의 전환기 이후 연간 사망률이 현저한 감소(>300,000명 감소), 2000년부터 2015년까지 관찰된 질병 비율의 유망한 감소는 가늘어지며, 질병전염을제한하는 새로운 접근법의 필요성을 시사합니다 2. 말라리아를 통제하고 가능하게 제거하기 위한 유망한 추가 전략 중 CRISPR/Cas9 기지를 둔 유전자 편집 및 유전자 드라이브3,4,5를사용하여 모기 벡터 용량을 표적으로 하는 것입니다. 실제로, 질병전염감소에 가장 큰 영향을 미쳤던 모기 벡터(오래 지속되는 살충제 처리된 침대 그물의 확장된 사용을 통해)의 표적화이다 6.

여성 모기는 혈액 식사 도중 감염된 인간에게서 플라스모듐 게임토사이클을 취득합니다. 수정, 성숙, 미드구트 상피 통과, 인구 확장 및 헤모코엘 항비에 이어 수백 에서 수만 개의 플라스모듐 스포로조이트가 모기 SGs를 침범하고 구성 분비 세포의 분비 충치를 채웁니다. 일단 분비 구멍 안쪽에, 기생충은 침골 덕트에 직접 접근할 수 있고 이렇게 다음 혈액 식사에 새로운 척추 동물 호스트로 전송을 위한 태세입니다. SGs는 말라리아를 일으키는 산포로조이트를 인간 호스트에게 전달하는 데 중요하기 때문에, 실험실 연구에 따르면 SGs는 혈액 공급, 모기 생존 또는 fecundity7,8,9에필수적이지 않다고제안하며,전송 차단 측정을 위한 이상적인 표적을 나타냅니다. 성인 모기 SGs는 초기 pupal SG 히스토시스10을넘어 지속되는 애벌레 SGs의 "덕트 싹"잔재의 정교화로 형성되어 애벌레 SG가 성인 단계 질병 전염을 제한하는 중재를위한 이상적인 표적이됩니다.

SG 발달의 애벌레 단계를 특성화하면 형태와 기능적 적응에 대한 더 나은 이해를 개발할 뿐만 아니라 주요 SG 조절기의 유전자 편집을 통해 이 기관을 대상으로 하는 새로운 개입을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 애벌레 침샘 건축의 모든 이전 연구는 면역 염색 및 현대 이미징 기술10,11을선행하기 때문에, 우리는 다양한 항체 및 세포마커(12)를가진 타액 샘을 분리하고 염색하기위한 프로토콜을 개발하였다. 이 비디오는 공초점 화상 진찰을 위한 Anopheles 감비아E L4 애벌레에서 애벌레 SGs의 추출, 고정 및 염색에 이 접근을 보여줍니다.

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프로토콜

1. 솔루션 및 도구 준비

  1. 해부 용액 의 준비
    1. 해부 용액을 준비하려면 15 개의 플라스틱 튜브에 증류 된 H2O의 7.5 mL에 100 % 에탄올2.5 mL을 추가하십시오. 튜브를 3번 반전하여 섞습니다.
      참고: 이 솔루션은 몇 주 동안 실온에서 저장할 수 있습니다.
  2. 10배 인산완충식염식염수(PBS) 재고 준비
    1. 10x PBS 스톡을 준비하려면 17.8g Na2HPO4• 2H2O, 2.4 g KH2PO4,80g NaCl, 2g KCl을 800mL의 탈온화 수를 추가하십시오. 고체가 완전히 녹을 때까지 저어접시에 저어줄과 섞으세요. 최종 부피를 정수물로 1L로 조정합니다.
      참고: 이 솔루션은 몇 달 동안 실온에서 저장할 수 있습니다.
  3. 1x PBS 준비
    1. 멸균 유리 병에 H2O의 90 mL에 10 x PBS의 10 mL을 추가합니다. 뚜껑을 단단히 닫고 3배 반전하여 섞습니다.
      참고: 용액은 몇 주 동안 4°C로 저장할 수 있습니다.
  4. 고정의 준비.
    1. 빙하 아세산 의 200 μL에 메탄올 600 μL을 추가합니다. 매번 솔루션을 신선하게 만드십시오.
  5. 퍼티 플레이트의 건설 (실리콘 고무로 채워진 조직 배양 접시)
    1. 에폭시(1g)와 물(50mL)의 성분(1:50)을 섞어 페트리 접시에 붓습니다. 사용하기 전에 부품이 건조될 때까지 기다립니다.
      참고: 일단 제작되면 퍼티 플레이트를 수년간 사용할 수 있습니다.

2. 글랜드 해부 (그림1A)

  1. 후기 L4 애벌레를 수집합니다(~10일 후 해치; 그림 2) 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 트레이를 먹이기에서.
    참고 : 표준 모기 축산 및 애벌레 문화에 대한이 유용한 온라인 매뉴얼을 참조하십시오13.
    1. 해부 현미경의 무대에 퍼티 플레이트를 놓고 퍼티 플레이트에 애벌레를 옮기.
      참고: 초기 해부에 대한 애벌레를 알리쿼팅할 때 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 한 번에 ~10개의 애벌레를 슬라이드로 옮기는 것이 좋습니다.
  2. 10개의 애벌레와 는 별도로 해부 용액 한 방울(1:3 EtOH:H2O)을 퍼티 플레이트에 놓습니다.
  3. 플라스틱 이송 파이펫 또는 일회용 유리 파이펫을 사용하여 L4 유충 1개를 25% EtOH 낙하에 넣습니다.
  4. 집게 (#5),각 손에 하나씩, 그리고 지배적이지 않은 손으로 애벌레의 머리를 잡습니다. 지배적 인 손을 사용하여, 머리 바로 아래에 집게로 애벌레를 잡고 머리가 몸의 나머지 부분에서 분리하고 땀샘이 머리에 부착 된 상태로 유지되는 최소한의 일정한 힘으로 부드럽게 당깁니다. 애벌레 시체의 신체 부위를 버리십시오.
    참고: 해부할 때 근처에 종이 타월을 놓아 애벌레 시체를 수집합니다.
  5. 1.5 mL 마이크로 센심 분리기 튜브에서 1 x PBS의 1 mL로 머리 / 땀샘을 수집합니다. 부착된 헤드가 있는 ~40개의 해부된 땀샘에 PBS 1mL을 사용하십시오. 헤드/SG가 버퍼의 맨 아래로 가라앉을 때까지 기다립니다.

3. 항체 염색에 대한 고정 (도1B)

  1. 유리 이송 파이펫을 사용하여 마이크로 센심 분리기 튜브의 상단에서 시작하여 끈적끈적한 모기 조직을 피하고 조직을 손상시키지 않고 가능한 한 많은 PBS 솔루션을 제거하십시오. 메탄올의 3:1 혼합물의 800 μL을 빙하 아세트산으로 바꿉니다. 튜브를 하룻밤 사이에 4°C로 놓습니다(권장 12-24시간; 19h 선호).
  2. 다음 날, 용액을 배출하고 차가운 100 % 아세톤1 mL로 교체하십시오. 90 년대를 남겨주세요.
  3. 아세톤을 제거하고 매번 1mL의 1mL로 조직을 세 번 부드럽게 헹구십시오.
    참고: 샘플은 흐름과 함께 천천히 떠서 각 PBS 추가가 완료될 때까지 튜브 바닥으로 되돌아갑니다.

4. 면역 염색 (그림1B)

  1. 1x PBS의 총 부피의 200 μL에서 적절한 희석(1:100)에 1차 항체(예를 들어, Rab11)를 추가한다. 파이펫 끝으로 튜브 내용물들을 부드럽게 소용돌이시다. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
  2. 1차 항체 용액을 제거하고 1x PBS 1mL로 세 번 세척하십시오(파이펫 안팎으로 용액을 부드럽게 피펫으로 피펫).
  3. 총 부피의 200 μL에 적절한 희석 (1:200)에 이차 항체 (Alex Fluor 488 염소 안티 토끼)를 추가합니다. 파이펫 끝으로 튜브 내용물들을 부드럽게 소용돌이시다. 실온에서 90분 동안 배양하십시오.
  4. 나일 레드 (지질, 1 μg /μL의 5 μL) 및 / 또는 Hoechst (DNA, 1 μg /μL의 3 μL)와 같은 염료를 이 단계에서 PBS200 μL에 추가합니다. 실온에서 60분 간 추가로 배양합니다. 1x PBS로 3회 부드럽게 씻으십시오.

5. 현미경 검사법을 위해 얼룩진 땀샘 장착 (그림1C)

  1. 피펫 200 μL 의 100% 글리세롤을 현미경 슬라이드에.
    참고: 글리세롤은 점성이 있으므로 적절한 부피에 도달할 때까지 파이펫 팁을 액체에 둡니다. 100% 글리세롤로 곧장 들어갈 때 조직 수축이 관찰되지 않았습니다. 그러나, 연구원은 통해 갈 수 있습니다 30% 그리고 50% 글리세롤 튜브에 있는 글리세롤 세공 100% 글리세롤로 샘플을 이동 하기 전에.
  2. 스테인드 헤드(슬라이드당 최대 20개)를 부착된 땀샘(다른 내부 구조와 함께)으로 소프트브러시(그림 3A)를사용하여 현미경 슬라이드로 옮긴다. 샘플을 유리 슬라이드를 따라 균등하게 분배되도록 분산합니다.
    참고: 브러시로 커버 슬라이드에 땀샘을 증착할 때 집게를 사용하여 SGs를 부드럽게 방향을 지정하여 모두 동일한 방향으로 방향을 지정할 수 있습니다.
  3. 해부 현미경으로 보고, 두 쌍의 집게를 사용하여 땀샘에서 애벌레 머리를 분리하고 두 조직을 반대 방향으로 조심스럽게 당깁니다.
    참고: SG를 완전히 분리하는 것이 어렵기 때문에 머리를 제거하여 SGs 및 관련 내부 구조를 남깁니다. SGs가 다른 조직과 연관되어 있더라도 Hoechst 및 기타마커(그림 3B,C)로염색될 때 쉽게 인식할 수 있습니다.
  4. 머리를 제거하고 버리고 각 SG에 대한 분리 프로세스를 반복합니다.
    참고: 머리를 제거할 때 근처에 종이 타월을 설치하여 수집합니다.
  5. 1.5mm 두께의 커버슬립을 상단에 부드럽게 놓고(기포를 피하십시오) 명확한 매니큐어로 밀봉합니다.
  6. 4°C에 저장하여 방광 용기에 보관하십시오.
    참고: 스테인드 땀샘의 준비된 슬라이드는 품질에 주목할 만한 변화 없이 최대 6개월에서 1년 동안 어둠 속에서 4°C로 보관할 수 있습니다. 글리세롤이 몇 달이 되면 누출되기 시작하면 커버슬립과 파이펫을 더 글리세롤에 들어 올려 구멍을 메웁니다.

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결과

타액선은 4단계 유충에서 해부하기 가 비교적 쉽습니다. 남성과 여성 애벌레는 여성의 등쪽 흉부하지만 남성의 등쪽 흉부를 따라 빨간색 줄무늬에 의해 후반 L4 애벌레 단계에서 구별 될 수 있지만 남성(그림 2). 우리는 또한 안테나 형태가 성인 모기에서 이 구조에서 관찰된 다름과 유사한 여성 L4 애벌레(그림2)보다남성에서 훨씬 더 정교하다는 것을 관찰합니다. L4 단계 동안 상당한 전반적인 성장과 함께, 타액 선은 L412동안 루멘을 형성한다. Hoechst로 염색된 초기 L4 단계 유충에서 분리된 침샘은 좁은수축(도 3B,C)에의해 분리된 근위 및 탈모엽을 드러낸다. 성형 루멘은 가장 근접한 끝에 있는 타액 덕트에서 (도시되지 않음)에서 단상 엽을 통해 모든 방법을 확장합니다. 성형 루멘은 중후반...

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토론

본 명세서에서 기재된 프로토콜은 Drosophila SG 해부 프로토콜 및 성인 모기 해부프로토콜(14,15,16)으로부터적응되었다. 그러나, 대부분의 마커는 성인 해부 및 SG 염색 방법을 사용할 때 지하 멤브레인(도시되지 않은 데이터)을 관통하지 않았다. 성인 프로토콜의 적응은 25% EtOH 용액에서 땀샘을 해부하고, MeOH와 빙하 아세트산의 조합으로 땀샘을 세척하고, 90 년대 아세톤 세척을 갖는 것을 포함했다. 원래 성인 프로토콜에서 성인 SG는 1x PBS14,15,16로해부되었다. 25% EtOH 솔루션에서 해부하여 SG를 보존하고 염색 기간 동안 손상을 방지했습니다. 초기 해부를 수...

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공개 사항

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

우리는 안감비아애 애벌레에 접근하고 양육한 존스 홉킨스 말라리아 연구소에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
  KH2PO4Millipore 시그마P9791
  Na2HPO4 &; 2H2O밀리포어 시그마71643
  NaClMillipore SigmaS7653
아세톤Millipore 시그마179124
브러시 with soft bristlesAmazon (SN NJDF) 디테일 페인트 브러시 세트B08LH63D89
커버 슬립 (22 x 50 mm)VWR48393-195
DAPI (DNA)ThermoFisher ScientificD1306
에틸 알코올 200 proofMillipore SigmaEX0276
Gilson Pipetman P200 피펫GilsonP200
빙하 아세트산시그마 Aldrich695092
보석상 겸자, Dumont No. 5Millipore 시그마F6521
KClMillipore 시그마58221
메탄올Millipore 시그마1414209
매니큐어아마존 (샐리 한센)B08148YH9M
나일 레드 (지질)ThermoFisher ScientificN1142
종이 타월 / 물티슈ULINES-7128
페트리 플레이트 (퍼티 플레이트 만들기)ThermoFisher ScientificFB0875712
피펫 팁Gilson팁 E200ST
플라스틱 전사 피펫Fisher 과학적S304671
일차 항체 (예: Crb, Rab11)발달 연구 하이브리도마 은행(DSHB); Andrew LabMouse anti-Crb (Cq4) 또는 Rabbit anti-Rab11
형광 태그가 있는 2차 항체 (예: Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit)ThermoFisher ScientificA11008
퍼티 플레이트용 실리콘 수지 및 경화제Dow Chemicals - Ximeter SiliconePMX-200
슬라이드, 한쪽 끝에 서리 덥음, VWR 라벨링용20 X 50 mm48393-195
밀 배아 AgglutininThermoFisher ScientificW834

참고문헌

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  15. Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Scientific Reports. 7 (1), 601(2017).
  16. Wells, M. B., Andrew, D. J. Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission. mBio. 10 (4), 01238(2019).
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  21. Linser, P. J., Smith, K. E., Seron, T. J., Neira Oviedo, M. Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1662-1671 (2009).
  22. Linser, P. J., et al. Slc4-like anion transporters of the larval mosquito alimentary canal. Journal of Insect Physiology. 58 (4), 551-562 (2012).

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