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방법 논문

다낭성 난소 증후군 마우스 모형에 있는 간 포도당 생산의 평가

2.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/62991

⸱

2022년 3월 5일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Reproductive Endocrinology and Infertility, Baylor College of Medicine, 2Family Fertility Center, Texas Children’s Hospital, 3Children’s Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine, 4Critical Care Medicine, Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine

이 논문에서

요약

이 연구는 다낭성 난소 증후군 마우스 모델에서 간 포도당 생산의 직접적인 측정을 설명하며, 꼬리 정맥을 통해 안정적인 동위 원소 포도당 추적자를 사용하여 단식과 포도당이 풍부한 상태 모두에서 함께 한다.

초록

다낭성 난소 증후군(PCOS)은 인슐린 저항성 및 포도당 편협과 같은 포도당 대사 장애를 초래하는 일반적인 질병입니다. Dysregulated 포도당 물질 대사는 질병의 중요한 표현이고 그것의 병기발생의 열쇠입니다. 따라서, PCOS에서 포도 당 물질 대사의 평가와 관련 된 연구는 가장 중요 한. 비 방사성 포도당 추적기를 사용하여 PCOS 모델에서 직접 간 포도당 생산을 정량화한 연구는 거의 없습니다. 이 연구에서는, 가스 크로마토그래피를 통해 안정적인 동위원소 포도당 추적자인 [6,6-2H2]포도당의 M+2 농축을 측정하여 PCOS 마우스 모델에서 간 포도당 생산 속도의 정량화에 대한 단계별 지침을 논의합니다- 질량 분광법 (GCMS). 이 절차는 안정적인 동위원소 포도당 추적제 의 생성을 포함, 꼬리 정맥 카테터 배치의 사용과 함께 같은 마우스에서 금식과 포도당이 풍부한 상태 모두에서 포도당 추적자의 주입. [6,6-2H2]의 농축은 GCMS에서 펜타아세테이트 유도체를 사용하여 측정된다. 이 기술은 간 포도당 생산의 비율의 직접 측정을 관련시키는 연구의 다양한에 적용될 수 있습니다.

서론

다낭성 난소 증후군 (PCOS)은 생식 노인 여성의 12%-20%에서 발생하는 일반적인 장애입니다1,2. 다낭성 난소, 불규칙한 수막 및 고안드로제네미아의 임상 또는 실험실 증거를 포함하는 가변 표현형을 초래하는 복잡한 질환이며, 여성이 3가지 기준 중 2개를 만날 때 전형적으로 진단된다3. PCOS의 주요 한 측면, 그리고 그것의 병인에 있는 중요한 요인은, 질병이 있는 여자에서 찾아낸 신진 대사 혼란입니다. PCOS를 가진 여자는 인슐린 저항의 더 높은 부각이, 포도당 편협, 비만, 및 대사 증후군3,4,5,6. 인슐린 저항은 질병의 표현일 뿐 아니라 난소에 있는 황호르몬을 전형화하여 그것의 병기 생성에 기여하는 것으로 생각됩니다 7,8 증가한 안드로겐 생산으로 이끌어 냅니다. 인슐린 저항은 몇몇 가능한 기원이 있기 위하여 생각됩니다 그러나 연구 결과는 인슐린 수용체 신호의 이상한 패턴 때문일 지도 모르다 건의합니다9,10. 연구는 고인슐린 -유글리세믹 클램프의 금 표준 기술을 사용하여 PCOS 환자에서 인슐린 저항성을 평가11,12,13,14,15. PCOS를 가진 여자는, BMI에 관계없이, 통제에 비해 인슐린 저항의 상부가 있습니다. 포도 당 생산에 인슐린 제어 는 과잉 포도 당 생산으로 이어지는 인슐린 저항의 장애에 손상. 예를 들면, 당뇨병 환자는 글루코네오발생의 비율을 증가하고 글리코게놀리시스16의 손상한 억제가 있습니다. 더욱이, 포도당 생산의 손상된 억제는 당뇨병 쥐17에서 관찰되었습니다. 클램프 연구는 인슐린 저항의 측정을 줄 수 있지만, PCOS에서 몇 가지 연구는 금식 및 공급 상태에서 포도당 생산의 직접 측정에 초점을 맞추고. 이를 위해서는 방사성 이소성 포도당 추적기 주입 및 질량 분석법을 통한 측정의 사용이 필요합니다.

동물 모델은 PCOS 연구에 광범위하게 사용되어 왔습니다. 마른 모델과 비만 형 PCOS 뮤린 모델 모두 안드로겐을 prenatally 투여하여 만들어졌으며, preubertally 또는 사춘기 후18. 설치류 PCOS 모델은 또한 각각의 대조군과 비교하여 신진 대사 차이를 보여줍니다. 우리의 실험실에서 이전 데이터는 PCOS 마우스 모델 (린 및 비만)에서 비정상적인 포도당 내성 테스트 (GTT)를 입증, 인간의 PCOS 문학과 일치19. 마른 동물 모델의 사용은 신진 대사 차이에 추가 조사를 할 수 있습니다. 구체적으로, 본 모델은 동위원소 포도당 추적기를 직접 사용하여 포도당 생산 속도를 평가할 수 있게 한다. 가장 일반적으로 사용되는 안정동위피 포도당 추적기 중 하나는 [6,6-2H2]포도당입니다. [6,6-2H2]포도당 농축은 이전에 설명된 바와 같이 펜타아세테이트 유도체를 사용하여 측정될 수 있다20.

이 연구에서는, 우리의 목표는 동위원소 포도당 주입을 사용하여 PCOS 마우스에 있는 금식 및 포도당 이풍부한 상태에서 간 포도당 생산의 비율을 측정하는 것이었습니다. 이러한 기술은 포도당 운동과 관련된 광범위한 실험에 적용될 수 있습니다.

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프로토콜

모든 동물 절차는 베일러 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. [6,6-2H2]포도당 준비

  1. 시술 하루 전에, 정상 식염수에 안정된 동위원소 포도당 추적자를 준비합니다. 이 실험을 위해, [6,6-2H2]포도당은 혈장 포도당 외관 비율을 측정하는 트레이서로서 사용되었다.
    참고: 이 실험에서는 금식 과 포도당이 풍부한 조건 동안 포도당 생산을 측정했기 때문에 포도당 동위원소는 두 가지 다른 제제로 제조되었습니다. 최종 주입 용량이 각각 1 mg /(kg·min) 및 2 mg /(kg·m)에 가까우게 될 정도로 솔루션을 준비하십시오. 이러한 농도는 여러 사전 파일럿 연구에 의해 최적화되었다.
  2. 멸균 염화 나트륨 용액에서 멸균 및 파이로겐 무료 [6,6-2H2]포도당을 용해시켜 단식 상태를 나타내는 트레이서로서 [6,6-2H2]의 포도당만으로 첫 번째 인후식을 준비한다.
  3. 염화 나트륨 용액0.9%의 염화나트륨 용액에 비등포성 포도당(~20 mg/kg·min)과 함께 [6,6-2H2]의 포도당 추적기를 모두 용해시켜 두 번째 비분리액을 준비한다.
    참고: 본 실험에서, [6,6-2H2]포도당에서 (~) 1.08 mg/(kg·kg·min) (금식 조건) 및 (~) 1.9 mg/kg·min(포도당 풍부한 상태)의 프라이밍 상수주입이 사용되었다. '포도당 풍부한 상태'를 모방하기 위해 D-포도당 주입률은 (~) 18.8 mg/(kg·min)으로 설정되었다.
  4. 솔루션이 준비되면 0.22 μm 필터로 솔루션을 걸레로 처리하여 4°C에 저장합니다. 주입 전에 실온에 대한 솔루션을 따뜻하게하십시오. 미리 레이블이 지정된 1mL 주사기에 솔루션을 로드합니다.
  5. 트레이서만 함유한 첫 번째 인퓨서(기저 상태의 경우)의 프라이밍 상수 주입을 용이하게 하기 위해 펌프를 설치하고, 3h에 대해 150 μL/h에서 동위원소의 일정한 속도 주입을 위한 펌프를 프로그래밍한다.
  6. 3h 금식 설정의 끝에서, 동위원소 트레이서 및 D-포도당을 포함하는 두 번째 비화제 주사기로 제1 중식 주사기를 교체하고(시뮬레이션 된 공급 상태의 경우), 600 μL/h에서 15 분 주입을 프라임하십시오. 펌프를 추가 3h에 대해 150 μL/h의 일정한 속도 주입으로 설정합니다.

2. 주입 실험 의 설정

  1. 그들의 홈 케이지에서 마우스를 제거하고 실험의 시작 하기 전에 그들의 금식 케이지에 3 시간. 이 실험을 위해, C57BL/6J 균주로부터 4개월 된 암컷 마우스가 사용되었다.
    참고: 이 절차는 최소 침습적 특성을 감안할 때 절차 이전 이나 절차 중에 항성 게증을 필요로 하지 않습니다.
  2. 인슐린 펌프당 마우스의 집합 수로 마우스를 그룹화하여 caging 장비를 조립한다. 평평하고 안정적인 베이스 위에 파티션을 배치하여 생쥐의 개별 노점을 만듭니다. 주입이 실행되기 위해 꼬리 정맥 카테터에 액세스 할 수 있도록하는 것이 중요합니다, 그래서 케이지 도어의 바닥에 노치가 있는지 확인.
    참고: 비디오에 표시된 케이지는 이 실험을 위해 특별히 만들어졌습니다. 케이지는 명확하고 플렉시 유리로 만들어집니다. 파티션이 있는 평평하고 안정적인 베이스(표준 caging 장비)가 있습니다. 이 설정은 테이블의 높이와 실험자의 요구에 따라 여러 가지 환경에서 쉽게 설정할 수 있도록 여러 조각으로 구성됩니다. 케이지의 문이 닫히고 꼬리가 들어갈 수 있도록 바닥에 노치가 있습니다.
  3. 1mL 의 기저 분리를 포함하는 1mL 주사기를 조립한 다음, 0.28mm ID x 0.61mm를 사용하여 주입 펌프 튜브에 연결한다.
  4. 속도를 150 μL/h로 설정하여 주입 펌프를 준비합니다.
  5. 수조를 48°C로 가열합니다.
  6. 30 G 0.5 인치 바늘, 0.3mm ID x 0.64mm silastic 튜브 및 1 인치 투명 트랜스 포어 테이프가 들어있는 수조에 인접한 카테터 삽입 스테이션을 준비하십시오.
  7. 3 h의 금식 후, 아래에 자세히 설명된 카테터 삽입 과정을 시작합니다.

3. 카테터 삽입

  1. 마우스 하나를 선택하고 꼬리에 액세스 할 수있는 보안 홀더에 배치합니다. 사용 내용의 예는 꼬리에 대한 노치와 반으로 잘라 병입니다. 홀더를 평평한 베이스에 놓습니다. 조각 테이프를 꼬리의 근위 부분에 놓고 카테터 삽입공간을 더 이상 탈량적으로 채우도록 합니다.
    참고: 이 작업에 선택한 테이프 유형에는 강도와 접착제가 적당해야 합니다. 다목적, 종이 기반 라벨 테이프는 부드럽고 벗겨지기 쉽기 때문에 이 실험에서 사용되었습니다.
  2. 카테터(0.3mm 실체 튜브및 PE-10에 부착된 30G 바늘은 가스 살균하였다)를 멸균 염식식세액을 함유한 1mL 주사기에 부착하여 준비한다. 카테터를 부드럽게 씻어내십시오.
  3. 마우스를 수조에 가져와 서 약 30-45 s에 대 한 수 조에 꼬리를 삽입 합니다. 이것은 카테터 배치를 위한 꼬리 혈관을 넓이시키는 것을 돕습니다.
  4. 멸균 조건에서 카테터 삽입을 수행합니다. 꼬리가 따뜻해지면 꼬리를 벤잘코늄 물티슈로 청소하고 꼬리의 근간이 되는 지혈대로 꼬리 모양으로 윤곽을 그리던 작은 구리, 이빨없는 악어 클램프를 놓습니다. 돋보기 아래에 측면 꼬리 정맥을 시각화한 다음 카테터를 테일 정맥에 조심스럽게 삽입하고 바늘을 철회합니다. 카테터의 간결성을 보장하기 위해 용액을 부드럽게 플러시하십시오.
  5. 카테터를 고정하기 위해 삽입 부위 주위에 1인치 트랜스포어 테이프 조각을 감쌉니다. 꼬리에서 작은 지혈대를 제거합니다.

4. 주입 설정 및 첫 번째 주입

  1. 마우스를 개별 케이지에 놓고 슬라이딩 도어를 닫아 꼬리가 노치를 통해 튀어 나와 케이지 외부에 남아 있는지 확인합니다.
  2. 카테터 전체와 꼬리에 테이프를 추가하여 케이지의 베이스 플레이트에 고정합니다. 이 단계에는 다목적 색상, 레이블 테이프가 사용되었습니다.
  3. 꼬리 정맥 카테터에서 플러시를 분리하고 펌프에서 인퓨세이트 라인을 연결하는 동안 역류를 방지하기 위해 카테터의 silastic 튜브에 작은 클램프를 배치합니다.
  4. 단단히 연결되면 클램프를 제거하고 분리된 액수로 구성된 프라이밍 용액으로 플러시합니다. 용액이 튜브에 명확하고 혈액 얼룩이 아닌지 확인하십시오.
  5. 주입개시 시간을 기록하여 총 시간 약 3시간 동안 실행되도록 합니다. 여러 케이지를 동시에 사용하는 경우 주입 시간을 효과적으로 관리하기 위해 엇갈려야 합니다.
  6. 주입 선이 제대로 작동하도록 되면 마우스에서 덮개를 제거합니다. 표준 침구를 마우스 주위에 놓습니다.
  7. 추적자를 포함하는 첫 번째 주입으로 주입을 시작하고 3 h 연속으로 실행합니다. 주입 의 기간 동안, 주입 라인뿐만 아니라 마우스 웰빙을 확인 계속. 주입 튜브가 제대로 고정되어 있고 라인 연결 지점에서 누출이 없는지 확인합니다.

5. 혈액 샘플링

  1. 첫 번째 주입이 완료된 후 주입을 중지하고 카테터에 슬래스티브 튜브에 클램프를 놓아 다시 흐름을 방지합니다. 혈액을 수집하기 위해 카테터를 방해하지 않고 인클로저에서 마우스를 부드럽게 제거합니다. 피 그리기 위해 케이지 근처의 한 자리에 놓습니다. 이 실험을 위해, 마우스는 4mm 랜싯을 사용하여 뺨 venipuncture를 겪었습니다.
  2. 원하는 유리병에 - 75 μL의 혈액을 수집합니다. 질량 분광법을 준비하기 위해 시료를 단백질화하려면 약 15μL의 혈액을 아세톤 500 μL에 추가합니다. 나머지 혈액은 향후 호르몬 분석용 플라즈마를 분리하기 위해 글루코프터 및/또는 원심분리를 통해 혈당 수준을 확인하는 데 사용할 수 있습니다.

6. 두 번째 주입

  1. 주사기에서 튜브를 분리하여 주사기 펌프에서 인퓨아를 제거하고 포도당과 함께 추적자를 포함하는 두 번째 비혼액으로 대체하십시오. 반복 단계 4.2 ~ 4.7 포도당이 풍부한 동위 포도 당 주입을 사용 하 여.
    1. 안정된 상태에 도달하려면 두 번째 불투포의 볼러스를 600 μL/h에서 15분 동안 실행합니다. 각 케이지 그룹의 시작 시간을 기록합니다. 주입 속도를 150 μL/h로 줄여 총 주입 시간의 3h를 완료합니다.
  2. 5.1 및 5.2 단계를 반복합니다.
  3. 주입 펌프를 중지하고 꼬리 정맥 카테터를 부드럽게 제거하고 출혈이 멈출 때까지 카테터 부위에 압력을 가하고 마우스를 홈 케이지로 돌려놓습니다.
  4. 표준 비누와 물로 코이징 설정을 완전히 소독합니다.
    참고 : 이것은 생존 절차입니다. 마우스는 케이지로 반환하고 필요한 경우 추가 흥분을 위해 보관 할 수 있습니다. 적절한 동물 복지를 보장하기 위해이 절차에 따라 적어도 일주일 동안 더 이상 흥분을 수행하지 않는 것이 좋습니다.

7. 질량 분석

  1. 질량 분석용 샘플을 보냅니다.
  2. 분석
    1. [6,6-2H2]포도당의 등소 농축을 가스크로마토그래피에 의한 - 펜타아세테이트 유도체21,22를 이용한 질량 분석법(GCMS)을 측정한다. 간단히, 이 방법은 GCMS 20,22를 사용하여 샘플 분석 에 이어 포도당의 펜타세테이트 유도체의 준비를 포함한다.
  3. 계산
    1. 안정된 상태 조건에서 모든 운동 측정을 수행합니다. 총 혈장 포도당 외형율(glucose Ra)은 확립된 동위원소 희석 방정식을 사용하여 플라즈마내의 [6,6-2H2]의 M+2 농축으로부터 계산되었다21. 꾸준한 상태 조건하에서, 포도당의 외관의 비율은 포도당의 실종의 비율과 동일하다는 것을 가정합니다. 내인성 포도당 생산속도(mg/(kg·m)) =포도당- 외인성 포도당.

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결과

이전에 설명된 동위원소 희석 방정식을 사용하여, 총 혈장 포도당 비율(glucoseRa)은 펜타아세테이트 유도체21을 이용하여 금식 및 포도당이 풍부한 조건에서 [6,6-2H2]포도당의 M+2 농축으로부터 계산되었다. 꾸준한 상태 조건에서, 포도 당의 외관의 비율은 포도 당의 실종의 비율과 동일하다는 것을 가정합니다. 대조군에서, 총 포도당Ra는 포도당이 풍부한 조건 동안 6h 금식 및 25.80 ± 1.76 mg/(kg·km)± 2.53 mg/(kg·min)이었다. 위에 나열된 계산을 사용하여 GPR은 포도당 이풍부한 조건에서 6h 금식 후 19.08 ± 2.53 mg/(kg·min)과 8.56 ± 1.40 mg/(kg·kg·분)이었다.

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토론

고혈당증 및 비정상적인 포도당 대사/항상성 PCOS의 특징입니다. 혈당 수준은 호르몬과 효소의 통제 하에 글리코게놀리시스와 글루코네오발생 및 글리코발생을 통해 식이요법과 포도당 생산에서 포도당의 조합에 의해 유지된다. 간 포도당 생산은 증가 순환 포도당 수준의 존재에 의해 억제된다. 비정상적인 포도당 대사의 장애에서, 포도 당 생산의 억제의 조절은 고혈당증으로 이어지는 손상. 많은 연구가 PCOS 동물 모델에서 간 포도당 생산의 간접 측정을 입증 하는 동안, 몇몇은 직접 간 포도당 생산을 측정 했다. 이 연구에서는 동시에 여러 마우스에서 간 포도당 생산 속도를 측정하는 간단한 방법을 설명합니다. 이 기술은 다양한 마우스 모형에 있는 포도당 물질 대사를 관련시키는 많은 연구 결과에 적용될 수 있습니다. 더욱이, 이 기술은 글루코네오네시스 및 글리코게놀리시스20,23의 측정과 같은 추가 측정이 적용될 수 있는 기...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 산부인과, 베일러 의과 대학 (ALG) 및 R-01 연구 보조금 (그랜트 # DK114689)의 국립 보건 원의 교육 보조금에 의해 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.9 % 염화나트륨 용액McKesson275595
10 mL BD Luer-Lok 팁 주사기VWR75846-756동물 당 주사기 2 개 (동위 원소 포도당 용액 용 1 개, 포도당이 풍부한 동위 원소 용액 용 1 개)
1 인치 투명 트랜스 포어 테이프3M70200400169
1 인치 라벨링 테이프FisherGS07F161BABrand가 그 예입니다.
헤파라닌 식염수 플러시McKesson191-MIH-2235헤파린 플러시 용액(0.9% 염화나트륨 중 10단위/mL 헤파린)도 준비할 수 있습니다.
5mm Medipoint Goldenrod animal lancetsFisher ScientificNC9891620동물이 2개월에서 6개월 사이인 경우 5mm
아세톤Sigma-Aldrich650501
Advanced 핫 플레이트 교반기VWR97042-602브랜드는
BD 27 게이지 0.5 인치 바늘Health WarehouseA283952
BD 30 게이지 0.5 인치 바늘Medvet305106
BD Intramedic 폴리에틸렌 (PE) 튜빙 0.28 mm ID x 0.61 mmVWR63019-004
BD Intramedic Polyethylene (PE) 튜빙 0.28 mm ID x 0.61 mmVWR63019-004
비커, 1000 mL모든 브랜드
케이지 펠릿
투명 VOA 유리 바이알과 닫힌 상단 캡Fisher Scientific05-719-120아세톤 및 혈액 채취 샘플 보관용
구리 이빨 없는 악어 클램프 지혈대용아마존모든 브랜드; 단단한 구리로 만든 부드러운 이빨 없는 악어 클립
D-(+)-포도당 >99.5%Sigma-AldrichG8270
D-포도당(6,6-D2, 99%)케임브리지 동위원소 연구소, Inc.DLM-349-PK
Dow Corning 실라스틱 튜빙 0.3 mm ID x 0.64 mm ODVWR62999-042
돋보기아마존모든 브랜드; LANCOSC 돋보기와 유사한 라이트 앤 스탠드
MicrobalanceOhaus Adventurer ProAV264C0.0001g 정확도를 가진 유사한 모델을 사용할 수 있습니다
Nalgene 병, 500 mLSigma-AldrichB0158-12EA또는 유사한 브랜드; 뚜껑을 반으로 자르고 바닥의 꼬리 크기 노치를 자릅니다.
PHD 울트라 멀티 주사기 펌프Harvard Apparatus70-3024A
플렉시 글라스 시트모든 브랜드; 카테터 삽입 중 마우스를 안정화하기 위해
플렉시 글라스 시트 및 칸막이모든 브랜드; 주입 중 마우스를 가두는 데 사용됩니다
를 함유한 5mL 주사기 입니다.. .

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