여기에서는 앙상블 생화학적 분석을 수행하는 동안 생체 분자의 기계적 조작을 가능하게 하는 새로운 마이크로플레이트 분석의 사용에 대해 설명합니다. 이는 자석으로 수정된 마이크로플레이트 덮개를 사용하여 마이크로플레이트를 가로질러 여러 개의 정적 자기 핀셋을 생성함으로써 달성됩니다.
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여기에서는 앙상블 생화학적 분석을 수행하는 동안 생체 분자의 기계적 조작을 가능하게 하는 새로운 마이크로플레이트 분석의 사용에 대해 설명합니다. 이는 자석으로 수정된 마이크로플레이트 덮개를 사용하여 마이크로플레이트를 가로질러 여러 개의 정적 자기 핀셋을 생성함으로써 달성됩니다.
기계생물학은 생물학적 물질의 물리적 힘과 기계적 특성이 생리학과 질병에 어떻게 기여하는지 설명합니다. 일반적으로 이러한 접근법은 제한된 단일 분자 방법이므로 가용성이 제한됩니다. 이러한 요구를 해결하기 위해 표준 생화학 분석을 수행하는 동안 기계적 조작을 가능하게 하는 마이크로플레이트 분석이 개발되었습니다. 이는 마이크로플레이트 덮개에 통합된 자석을 사용하여 여러 개의 자기 핀셋을 생성함으로써 달성됩니다. 이 형식에서는 상자성 구슬에 연결된 생체 분자에 힘이 가해지며, 이는 일반적인 자기 핀셋과 같습니다. 이 연구는 단백질 구조를 모니터링하기 위해 FRET 기반 분석과 함께 이 도구를 적용하는 방법을 보여줍니다. 그러나 이 접근 방식은 효소 활성 측정에서 살아있는 세포의 신호 경로 활성화에 이르기까지 다양한 생물학적 시스템에 광범위하게 적용할 수 있습니다.
기계생물학은 세포 내부 및 세포 사이의 물리적 힘의 전파가 세포 활동을 어떻게 조절하는지, 1,2 그리고 이것이 단백질과 세포의 조직 및 역학과 어떤 상관관계가 있는지 이해하는 데 중점을 둡니다.
단일 분자 힘 측정은 단일 단백질에서 전체 세포 및 조직에 이르기까지 생물학적 시스템에서 힘이 어떻게 사용되는지 밝혀졌습니다 3,4,5,6,7. 이러한 까다로운 실험에는 특수 장비와 기술 전문 지식이 필요합니다. 반대로, 표준 생화학 분석은 쉽게 구할 수 있는 상용 장비에서 더 높은 처리량으로 수행할 수 있습니다.
여기에서 이 연구는 자기 핀셋 기반 조작과 생화학적 분석을 함께 수행할 수 있는 기계생물학 분석에 대해 설명합니다
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이 실험에 필요한 샘플 단백질과 시약 목록은 Table of Materials에서 확인할 수 있습니다. 형태 변화를 측정하기 위해 사용자의 연구 시스템에 대해 등가 단백질을 생산해야 합니다.
1. 3D 인쇄 된 마그네틱 뚜껑
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그림 2 는 GFP의 형광 강도가 마이크로플레이트 웰 전체에서 1mm 간격으로 기록된 웰 스캔 측정의 예를 보여줍니다. 일반적인 형광 측정은 마이크로플레이트 웰의 중앙 위치( 그림 2의 위치 8,8)에서 수행됩니다. 따라서 이 위치에 결합된 단백질이 있는 것이 중요합니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이 강도는 반경 수 밀리미터 이내의 우물 중앙에서 가장 높습니다. 일반적으로 고정은 우물의 가장자리에서 멀리 떨어져 있는 것이 더 좋은데, 이는 단백질이 측벽에 결합하기 때문일 수 있습니다. 단백질 결합의 부족 또는 비오틴-BSA 및/또는 스트렙타비딘의 결함으로 인한 불량한 신호는 여기에서 확인할 수 있습니다. 형광 스트렙타비딘 접합체를 사용하여 표면의 비오틴-BSA를 확인할 수 있습니다. 마찬가지로, 비오틴-GFP로 구성된 대조 단백질은 스트렙타비딘이 비오틴-BSA 표면에 결합.......
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이 접근 방식을 사용하면 형광판 판독기를 사용하여 force-based 측정을 microplate에 쉽게 적용할 수 있습니다. 중요한 것은 이 분석 형식이 표면에 결합할 때 기능적 단백질이 있다고 가정한다는 것입니다. 따라서 단백질 활성이 있는지 확인하기 위해 이러한 측정을 시작하기 전에 사전 지식이 필요합니다. 또한 상자성 비드 및 표면에 대한 분자의 결합이 각 시스템에 맞게 최적화되었는지 확인하는 것도 유용합니다.
이 개념은 모든 유형의 마이크로플레이트에서 작동하도록 수정할 수 있습니다. 그러나 자석이 웰에 들어갈 수 없으므로 24웰 이상의 마이크로플레이트에 맞게 자석 선택을 조정해야 합니다. 자석은 여전히 우물 위에 놓을 수 있습니다. 그러나, 24 웰 플레이트에서, 이것은 다른 웰8을 가로지르는 흩어진 필드로 이어지지 않는다; 96개의 웰 플레이트와 같은 더 작은 웰에.......
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저자는 경쟁 이익이 없음을 선언합니다.
자금을 지원해 주신 영국 암 연구소(Cancer Research UK, A26206), MRC(MR/M020606/1) 및 왕립학회(Royal Society, RG150801)에 감사드립니다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 24웰 유리 바닥 마이크로플레이트 | Cellvis | P24-1.5H-N | 다양한 소스를 사용할 수 있습니다. 필요한 경우가 아니면 처리된 표면을 피하는 것이 가장 좋으며 이미징 등급 유리 N1.5를 사용합니다. |
| Anti-RFP 항체 | Abcam | ab290 | 여러 소스를 사용할 수 있지만 GFP와의 반응성을 최소화해야 합니다. |
| 벤치 탑 광 현미경 | Optika | IM-3 | |
| 벤치 탑 로테이터 | Cole-Palmer-Stuart | SB3 | |
| Biotin-BSA | Sigma Aldrich | A8549 | |
| CAD 소프트웨어 - Sketch Up Educator | Sketch Up | 대체 CAD 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 사용자는 파일 형식이 3D 프린터와 호환되는지 확인해야 합니다. | |
| Dynabeads 단백질 A | Fisher Scientific | 10746713 | 2.8 µ m 재조합 단백질 A |
| 충격 접촉 접착제 | EVO-STIK | ||
| MagnaRack 자기 분리 랙 | ThermoFisher Scientific | CS15000 | 자기 절연체 |
| NaCl | Fisher Scientific | 10316943 | |
| 네오디뮴 N42 5mm 큐브 자석 | 슈퍼마그네틱 | W-05-N | |
| 플레이트 리더 - ClarioStar | BMG Labtech | 모든 플레이트 리더 시스템은 마이크로플레이트 아래에서 측정이 가능한 곳에 사용할 수 있습니다. 자석 뚜껑은 위의 표준 측정을 제외합니다 | |
| Streptavidin, | Sigma, Aldrich | 189730 | |
| Tris-HCl | , Fisher Scientific | 10142400 | |
| Ultimaker, PETG 필라멘트 | Ultimaker, Ultimaker | ||
| , S3 - 3D 프린터 | Ultimaker |
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