이 프로토콜은 빠른 세포 롤링 접착 중에 접착 이벤트를 이미지화하기 위해 접착 발자국 분석기를 수행하는 실험 절차를 제시합니다.
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방법 논문
접착 발자국 분석에 의한 세포 압연의 이미징 분자 접착
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
셀렉틴 매개 상호 작용에 의해 촉진되는 압연 접착은 염증 부위에 백혈구를 모집하는 데 매우 역동적이고 수동적인 운동성입니다. 이 현상은 혈액 흐름이 내피 세포에 압연 운동에 백혈구를 밀어 하는 포스트 모세관 정맥에서 발생합니다. 안정적인 롤링은 접착 결합 형성과 기계적으로 구동되는 해리 사이의 섬세한 균형을 필요로 하며, 이는 셀이 흐름 방향으로 굴러가면서 표면에 부착된 상태를 유지할 수 있도록 합니다. 상대적으로 정적 환경에서 발생하는 다른 접착 공정과 달리 압연 세포가 초당 수십 미크론에서 수천 미크론을 이동함에 따라 압연 접착력이 매우 역동적입니다. 따라서, 견인력 현미경검사법과 같은 종래의 메카노생물학 방법은 짧은 시간 스케일 및 고감도로 인해 개별 접착 이벤트 및 관련 분자력을 측정하기에 적합하지 않다. 여기서는 P-selectin: PSGL-1 상호작용을 분자 수준에서 롤링 접착을 이미지화하기 위한 접착 발자국 분석의 최신 구현을 설명합니다. 이 방법은 돌이킬 수 없는 DNA 기반 장력 게이지 테더를 사용하여 형광 트랙의 형태로 분자 접착 이벤트의 영구 역사를 생성합니다. 이 트랙은 두 가지 방법으로 이미지화 될 수있다 : (1) 큰 시야를 생성하기 위해 회절 제한 이미지의 수천을 함께 스티치, 길이의 수천 미크론을 통해 각 롤링 셀의 접착 발자국의 추출을 가능하게, (2) DNA-PAINT를 수행하여 작은 시야 내에서 형광 트랙의 초해상도 이미지를 재구성. 이 연구에서는, 접착 발자국 분석은 다른 전단 응력에서 압연하는 HL-60 세포를 연구하기 위하여 이용되었습니다. 이 과정에서 우리는 P-셀렉틴의 공간 분포를 이미지화할 수 있었습니다: PSGL-1 상호 작용및 형광 강도를 통해 그들의 분자 력에 대한 통찰력을 얻을 수 있었습니다. 따라서, 이러한 방법은 분자 수준에서 압연 접착에 관여하는 다양한 세포 표면 상호작용의 정량적 조사를 위한 기초를 제공한다.
서론
롤링 접착 캐스케이드는 순환 세포가 혈관 벽을 따라 밧줄을 타고 굴리는 방법을 설명합니다1. 수동 압연은 주로 셀룰러 접착 분자 (CAM)1의 주요 클래스인 셀렉틴에 의해 매개됩니다. 혈액의 전단 흐름하에서, P-셀렉틴 당단백질 리간드-1(PSGL-1)을 발현하는 백혈구는 염증이 있는 내피 세포의 표면에 발현될 수 있는 P-selectin과 매우 일시적인 결합을 형성한다. 이 과정은 백혈구가 염증의 사이트로 이동하는 것이 중요합니다2. 또한, PSGL-1은 P-selectin3와의 교전시 압연 접착의 후속 회사 접착 단계를 발동할 수 있는 메카노감감충수용체이다.
CAM 기능에 영향을 미치는 유전 돌연변이는 백혈구 접착 결핍 (LAD)의 희귀 질환과 같은 면역 체계에 가혹하게 영향을 미칠 수 있으며, 압연을 중재하는 접착 분자의 오작동이 심각하게 면역 손상 된 개인4,5,6로 이어집니다. 또한, 순환 종양 세포....
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프로토콜
1. 올리고뉴클레오티드 라벨링 및 혼성화
- 단백질 G 이황화물 결합 감소
- 1mL의 초순수에 10 mg의 단백질 G(ProtG)를 녹입니다.
참고: 여기에 단백질 G는 C-terminus및 N-종자 폴리 히스티딘 꼬리표에 있는 단 하나 시스테인 잔류물로 변형됩니다. - 완충 교환≥20 μL 의 ProtG (10 mg/mL)를 P6 컬럼이있는 1 x PBS (pH 7.2)로 합니다.
- 완충교환 후 단백질 농도를 측정한다.
참고: 7-8 mg/mL의 전형적인 농도. - 120mM Tris(2-carboxyethyl)인 포스핀(TCEP)을 1x PBS(pH 7.2)의 90 μL로 3mg의 TCEP를 용해한 다음 0.5M EDTA의 10μL을 준비한다.
참고 : TCEP는 갓 준비해야합니다. - 120mM TCEP(480nmol)의 4μL을 프로트G(4-5nmol)의 20μL에 추가합니다.
참고: 단백질에 ~100:1 TCEP의 어금니 비율을 목표로 합니다. - 상온(RT)에서 30분 동안 반응을 진행할 수 있도록 한다.
- P6 열(1x PBS, pH 7.2로 교환된 버퍼)을 통해 감소된 ProtG에서 초과 TCEP를 제....
- 1mL의 초순수에 10 mg의 단백질 G(ProtG)를 녹입니다.
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결과
위의 프로토콜은 접착 발자국 분석기의 실험 적 절차를 설명합니다. 일반적인 실험 워크플로우는 도 1, 유량 챔버 어셈블리(도 1A)에서 표면 기능화(도 1B) 및 실험 및 이미징 단계(도 1C)에 도시되어 있다.
도 2 는 ProtG-ssDNA 생체 경련 특성화에 대한 대표적인 결과입니다. 최종 제품, 즉 ProtG, 말-sdna 및 imidazole 용출 버퍼에서 3개의 성분의 UV/Vis 스펙트럼은, 공지된 농도에 대응하는 최종 컨쥬게이션(Figure 2A) 전에 수집되었다. 이러한 스펙트럼은 세 가지 알 수없는 매개 변수가 농도인 바이오 컨쥬게이션 제품 스펙.......
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토론
접착 발자국 분석은 세포 압연 접착 시 PSGL-1과 P-selectin 사이의 분자 접착 이벤트를 시각화할 수 있습니다. 이 과정은 P-selectin 매개 캡처에 의해 시작되며 유체 전단 응력하에서 압연됩니다. 실험 도중 잠재적인 문제점은 일반적으로 세포가 잘 굴러도 가난한 세포 압연 또는 누락된 형광 선트랙을 관련시킵니다. 이러한 문제는 문제 해결 테이블(표 1)에 나열된 프로토콜의 중요한 단계에서 품질 제어로 인해 발생하는 경우가 많습니다.
표면 준비는 여러 단계를 수반하기 때문에 생체 분자 및 완충체는 오염을 방지하기 위해 4 °C에서 필터링하고 저장해야합니다. 고품질 표면 패시베이션은 적절한 표면 기능화 밀도를 달성하고 생체 분자의 비특이적 결합을 감소시키는 요구 사항입니다. 표면에 생체 분자의 비특이적 결합은 단일 분자 형광 화상 진찰 및 통계 데이터 분석을 방해하는 높은 형광 배경을 만들 수 있습니다. 여러 요인이 표면 통과에 영향을.......
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 캐나다 혁신 재단 (CFI 35492), 캐나다 디스커버리 그랜트의 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (RGPIN-2017-04407), 연구 기금의 뉴 프론티어 (NFRFE-2018-00969), 건강 연구를위한 마이클 스미스 재단 (SCH-2020-0559), 및 브리티시 컬럼비아 대학의 대학에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 4채널 드릴 가이드 | ABS 필라멘트로 맞춤 제작된 | ||
| 4홀 슬라이드 | 알루미늄 클램프의 8-32 나사 구멍 중심과 일치하는 레이아웃이 있는 4채널 드릴 가이드에 다이아몬드 코팅된 드릴 비트가 있는 Dremel을 사용하여 맞춤형 드릴 클린 현미경 슬라이드. | ||
| 아세톤 | VWR | BDH1101-4LP | |
| 아크릴 스페이서 | 맞춤 제작 | 40mm x 30mm x 2.5mm 크기의 아크릴 시트 두 블록을 자릅니다. 각 블록에 알루미늄 홀더의 3-40 구멍과 정확하게 정렬된 두 개의 40mm 구멍을 뚫습니다. | |
| 알루미늄 칩 홀더 | 맞춤형 | 기계 양극 산화 처리 된 알루미늄 블록을 외부 치수가 640mm x 500mm x 65mm이고 개구부 치수가 400mm x 380mm x 65mm 인 C 자형 홀더로 만듭니다. 입구와 출구는 8-32 나사로 두드립니다. | |
| 아미노실란 | AlfaAesar | L14043 | CAS 1760-24-3 |
| 항생제/항진균 용액 | Cytiva HyClone | SV3007901 | 펜/스트렙/Fungiezone |
| 비드, ProtG 코팅 폴리스티렌 | Spherotech | PGP-60-5 | |
| 소 혈청 알부민 | VWR | 332 | |
| 버퍼, DNA 페인트 | 0.05% Tween-20, 5mM Tris, 75mM MgCl2, 1mM EDTA | ||
| 완충액, T50M5 | 10mM Tris, 50mM NaCl, 5mM MgCl> | ||
| Buffer, | 2mM CaCl2, 2mM MgCl2, 10mM Hepes, 0.1% BSA | ||
| 완충액, 세척 | 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 및 2 mM CaCl2, 0.05% 트윈 20 | ||
| 염화칼슘 | VWR | BDH9224 | |
| 세포 배양 플라스크 | VWR | 10062-868 | |
| 진한 황산 | VWR | BDH3072-2.5LG | 95-98% |
| 커버슬립 홀딩 핀셋 | Techni-Tool | 758TW150 | |
| 다이아몬드 코팅 드릴 비트 | 연마 기술 | C5250510 | 0.75mm 다이아몬드 드릴 |
| DNA, 아민-ssDNA(상단 가닥) | IDT DNA | 맞춤형 올리고 | CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/ |
| DNA, 비오틴-ssDNA(하단 가닥) | IDT DNA | 맞춤형 올리고 | /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG |
| DNA, DNA-PAINT | IDT DNA | 맞춤형 올리고 | GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/ |
| DNA, 영구 라벨링용 이미저 가닥 | IDT DNA | 맞춤형 올리고 | CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/ |
| 양면 테이프 | 스카치 | 237 | 3/4인치 너비, 영구 양면 테이프 |
| EDTA | Thermofisher | 15575020 | 0.5M EDTA, pH 8.0 |
| 에폭시 | 고릴라 | 42001 | 5분 경화 시간 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
| GelGreen | Biotium | 41005 | |
| 빙하 아세트산 | VWR | BDH3094-2.5LG | |
| 유리, Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 유리, 현미경 슬라이드 | VWR | 48300-026 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| 유리, 염색 용기 | VWR | 74830-150 | Wheaton 염색 항아리 (900620) |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS) | Lonza | 04-315Q | |
| 혈구계 | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | |
| HL-60 셀 | ATCC | CCL-240 | |
| 습도 챔버 슬라이드 지원 | ABS 필라멘트로 맞춤형 3D 인쇄 | ||
| 과산화수소 | VWR | BDH7690-1 | 30% |
| 이미다졸 | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| 흡입구/배출구 | 맞춤형 | 코발트 드릴 비트를 사용하여 8개의 8-32 세트 나사를 뚫습니다. 1.5 cm 삽입 각 중공 고정 나사에 폴리에틸렌 튜브(Tygon, I.D. 1/32" O.D. 3/32") | |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | Lonza | 12-722F | |
| 염화마그네슘 | VWR | BDH9244 | |
| 자성 Ni-NTA 비드 | Invitrogen | 10103D | |
| 메일러 튜브 | EMS | EMS71406-10 | |
| 메탄올 | VWR | BDH1135-4LP | |
| Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns | Biorad | 7326200 | In SSC 버퍼 |
| PEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| PEG-비오틴 | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| 수산화칼 | VWR | 470302-132 | |
| 단백질, 단백질 G | Abcam | ab155724 | N-terminal His-Tag 및 C-terminal 시스테인 |
| 단백질, P-selectin-Fc | R& D 시스템 | 137-PS | 재조합 인간 P-Selectin/CD62P Fc 키메라 단백질, CF |
| 단백질, Streptavidin | Cedarlane | CL1005-01-5MG | |
| 펌프 주사기 | 하버드 장치 | 704801 | |
| 중탄산나트륨 | 병동' s Science | 470302-444 | |
| 염화나트륨 | VWR | 97061-274 | |
| Sulfo-SMCC | Thermofisher | 22322 | |
| 주사기 | Hamilton | 81520 | PTFE 루어 잠금 장치가 있는 주사기, 5mL |
| 주사기 바늘 | BD | 305115 | Precision Glide 26G, 5/8인치 길이 |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| 트리스 | VWR | BDH4502-500GP | |
| 튜빙, 어댑터 | Tygon | ABW00001 | 제형 3350, I.D. 1/32"; O.D. 3/32" |
| 튜브, 폴리에틸렌 | BD Intramedic | 427406 | Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |
참고문헌
- McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Revie....
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재인쇄 및 허가
