Method Article

박테리아 글리코겐 입자의 분자 구조 특성화를 위한 비분해성 추출 방법

DOI:

10.3791/63016

⸱

February 18th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioinformatics, School of Medical Informatics and Engineering, Xuzhou Medical University, 2Jiangsu Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, 3Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, 4Department of Biological Sciences, School of Life Sciences, Xuzhou Medical University, 5School of Chemistry and Molecular Biosciences, The University of Queensland, 6Centre for Nutrition and Food Sciences, Queensland Alliance for Agriculture and Food Innovation, The University of Queensland, 7Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety, College of Agriculture, Yangzhou University, 8State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicines, Macau University of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

박테리아 글리코겐 구조는 분자 분해 및/또는 편향된 샘플링을 초래할 수 있는 추출 방법의 영향을 크게 받습니다. 이러한 문제를 최소화할 수 있는 방법을 개발하는 것이 필수적입니다. 여기에서는 추출 아티팩트를 최소화하기 위한 핵심 기준으로 크기 분포 및 체인 길이 분포를 사용하여 4가지 추출 방법을 비교했습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

현재 글리코겐 공간 구조를 손상시키거나 글리코겐을 부분적으로만 추출하는 다양한 글리코겐 추출 방법이 존재하여 글리코겐 미세 분자 구조의 편향된 특성화를 초래합니다. 박테리아에서 글리코겐 구조의 역동적인 변화와 글리코겐 입자의 다양한 기능을 이해하려면 분해를 최소화하면서 글리코겐을 분리하는 것이 필수적입니다. 이 연구에서는 당 밀도 구배 초원심분리(SDGU-CW) 를 통한 냉수(CW) 침전을 사용하여 가벼운 글리코겐 분리 방법을 입증했습니다. 비교를 위해 기존의 트리클로로아세트산(TCA) 방법과 수산화칼륨(KOH) 방법도 수행했습니다. 일반적으로 사용되는 실험실 균주인 Escherichia coli BL21(DE3)은 이 연구에서 시연 목적으로 모델 유기체로 사용되었습니다. 다양한 방법을 사용하여 글리코겐 입자를 추출한 후, 입자 크기 분포를 위한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)와 선형 사슬 길이 분포를 위한 형광단 보조 모세관 전기영동(FACE)을 통해 구조를 분석하고 비교했습니다. 분석 결과 SDGU-CW를 통해 추출된 글리코겐은 분해가 최소화된 것으로 확인되었습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

글리코겐은 글루코실 잔기와 작지만 상당한 양의 단백질로 구성된 고도로 분지된 다당류로, 모든 글루코실 잔기는 선형 사슬의 α-1,4-글리코시드 결합과 분지 점에서 α-1,6-글리코시드 결합을 통해 함께 연결됩니다 1. 글리코겐 입자의 구조는 일반적으로 1) 단쇄 올리고머, 2) 구형 β 입자(직경 ~20nm), 3) 직경이 대략 최대 300nm인 β 입자로 함께 응집된 큰 장미 모양의 α 입자의 세 가지 계층으로 나뉩니다. 최근에는 글리코겐 α 입자가 진핵생물에서 두 가지 구조적 상태, 즉 취약한 상태와 안정적인 상태를 가지고 있음이 밝혀졌습니다. 여기서 취약성은 DMSO2와 같은 카오트로픽 물질이 존재할 때 큰 α 입자가 더 작은 β 입자로 해리되는 것을 의미합니다. 추가 분석에 따르면 당뇨병이 있는 간의 글리코겐 α 입자는 일관되게 취약하며3 취약한 α 입자는 안정적인 α 입자보다 훨씬 빠르게 분해됩니다4. 따라서 글리코겐의 구조적 취약성은 당뇨병의 고혈당 상태를 악화시킬 수 있으며, 이는 취약한 α입자를 분자 수준에서 당뇨병의 잠재적인 병리학적 바이오마커로 만듭니다. 그러나 원핵생물 내 글리코겐 α 입자의 존재는 산발적으로만 보고되었으며5 박테리아에서 글리코겐 α 입자의 두 가지 다른 구조 상태에 대한 보고는 없습니다.

박테리아 글리코겐 입자의 생리학적 기능을 이해하기 위해서는 글리코겐 분자의 미세 구조를 결정하는 것이 필수적이며, 이를 위해서는 최대 수율과 최소한의 분해로 글리코겐 분리가 필요합니다1. 지금까지 글리코겐 추출을 위해 온수 추출, 트리클로로아세트산(TCA) 추출, 고온 알칼리(수산화칼륨, KOH) 추출을 포함하되 이에 국한되지 않는 다양한 기술이 개발되었습니다6. 또한, 진핵 글리코겐 분리에 일반적으로 사용되는 또 다른 방법인 당 밀도 구배 초원심분리(SDGU) 방법도 셀레노모나스 루미난티움(Selenomonas ruminantium) 및 피브로박터 숙시노겐(Fibrobacter succinogenes)에서 박테리아 글리코겐 분리에 대해 보고되었습니다 7,8. 이러한 방법의 장단점은 진핵생물 연구에서 널리 논의되어 왔지만9,10, 글리코겐 입자 구조의 관점에서 박테리아에서 다른 추출 방법을 통해 분리된 글리코겐 미세 구조에 대한 비교 연구는 거의 없습니다.

본 연구에서는 대장균 BL21(DE3)을 모델 유기체로 사용하여 이 문제를 다루었습니다. 총 4가지 글리코겐 추출 방법, 즉 TCA 침전 온수 추출(TCA-HW), TCA 침전 냉수 추출(TCA-CW), 고온 30% KOH 용액 추출(KOH-HW) 및 자당 밀도 구배 초원심분리(SDGU-CW)를 사용한 냉수 추출을 비교했습니다. 그런 다음 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 글리코겐 입자 크기 분포를 측정하고 사슬 길이 분포는 형광단 보조 탄수화물 전기영동(FACE)을 통해 감지했으며, 둘 다 추출 방법의 품질을 평가하는 데 사용되었습니다. 또한, 일반적으로 사용되는 카오트로픽제인 DMSO(Dimethyl sulfoxide)로 처리하기 전과 후의 입자 크기 분포를 비교하여 다양한 추출 방법 중에서 박테리아 글리코겐 α 입자의 안정성과 취약성을 비교했습니다. 글리코겐 추출 및 구조적 특성화를 위한 자세한 절차는 다음과 같습니다. 요약하면, SDGU-CW 방법은 글리코겐 구조적 무결성 측면에서 전반적으로 가장 좋은 효과를 보이므로 향후 관련 연구에서 박테리아 글리코겐 추출에 권장됩니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 박테리아 배양 및 수집

  1. 멸균 LB 한천 플레이트(10g/L 트립톤, 5g/L 효모 추출물, 10g/L NaCl 및 15g/L 한천)를 접종하여 박테리아 글리세롤 스톡(-80 °C)에서 E. coli BL21(DE3)을 소생시킵니다. 플레이트를 표준 인큐베이터에 넣고 37 ° C에서 밤새 배양합니다.
  2. 단일 콜로니를 선택하여 10mL 멸균 LB 액체 배지(10g/L 트립톤, 5g/L 효모 추출물 및 10g/L NaCl)에 접종합니다. 37°C에서 하룻밤 동안 220rpm으로 진탕하면서 와류와 배양을 통해 잘 혼합합니다.
    참고: 달리 명시되지 않는 한, 모든 액체 배양 조건은 220rpm 진탕 속도로 37°C였습니다.
  3. 하룻밤 동안 배양한 E. coli 1mL를 100mL의 멸균 LB 액체 배지로 옮기고 5시간 동안 배양합니다. 0.8% D-(+)-포도당을 포함하는 1x M9 최소 배지(3g/L KH2PO4, 0.5 g/L NaCl, 6.78 g/L Na2HPO4 및 1 g/L NH4Cl) 1 mL를 50 mL로 옮깁니다. 잘 섞고 20 시간 동안 배양하십시오.
    참고: 1x M9 최소 배지 및 포도당을 별도로 멸균한 다음 실온으로 무균 냉각할 때 혼합했습니다.
  4. 20시간 배양 후 6,000 x g 에서 4°C에서 15분 동안 박테리아 용액을 원심분리합니다. 상등액을 버리십시오. 셀 펠릿을 -80°C에서 밤새 보관한 다음 펠릿을 동결 건조합니다.
  5. 동결건조된 박테리아 분말을 밀봉하여 나중에 사용할 수 있도록 냉장고(-20°C)에 보관하십시오.

2. 글리코겐 추출

  1. 트리클로로 아세트산 침전 온수 추출 (TCA-HW)
    1. 동결 건조 대장균 BL21(DE3) 분말 500mg의 무게를 정확하게 측정하고 얼음처럼 차가운 0.05M 트리에탄올아민(TEA) 완충액 20mL에 재현탁합니다. 초음파 세포 분쇄기(25% 에너지, 4°C)를 사용하여 3분(30초 작업 주기 및 2초 간격) 동안 박테리아 세포를 파괴합니다. 용액에 명백한 펠릿이 없는지 확인하십시오.
      참고: 세포 파괴는 얼음 위에서 수행되었습니다. TEA 완충액의 pH를 HCl 첨가로 pH 7로 조절하고 실온에서 보관합니다.
    2. 모든 박테리아 균질액을 두 개의 10.4mL 초원심분리기 튜브(10mL/튜브)로 옮깁니다. 튜브에 탈이온수를 끝까지 채우고 104,000°C의 초원심분리기에서 90분 동안 90 x g 으로 원심분리합니다. 상등액을 버리십시오.
    3. 탈이온수 2mL를 추가하여 각 튜브에 펠릿을 재현탁시킵니다. 현탁액을 50mL 원심분리 튜브로 옮기고 최종 부피 20mL에 탈이온수를 추가합니다. 가열하고 5분 동안 끓여 모든 단백질을 변성시킵니다.
    4. 18,000 x g 에서 10분 동안 현탁액을 원심분리하고 상층액(S1)을 유지합니다. 2.1.3 단계와 동일한 방식으로 침전물을 처리하십시오. 새로운 상층액(S2)을 S1과 풀링합니다.
    5. 상등액(S1+S2)에 50% TCA(0.1 부피)를 첨가하고 혼합물을 얼음에 10분 동안 올려 DNA, RNA, 단백질 등과 같은 거대분자를 침전시킵니다. 혼합물을 18,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 상등액을 1.5부피의 절대 에탄올과 혼합합니다.
      참고: TCA의 농도는 50% v/v입니다. 보관을 위해 빛에서 멀리 보관하십시오.
    6. 얼음에 글리코겐을 20분 동안 침전시키고 18,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상등액을 붓습니다.
    7. 펠릿을 5mL의 ddH2O에 용해시킨 다음 5mL의 얼음처럼 차가운 절대 에탄올을 첨가합니다. 용액을 4°C에서 밤새 배양하고 18,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리고 펠릿을 보관하십시오.
    8. 2.1.7단계와 같이 "세척 및 강수" 단계를 두 번 더 반복합니다.
    9. 마지막으로, 침전된 글리코겐을 2mL 튜브에 400μL의 ddH2O에 용해시키고 -80°C에서 예비동결한 후 동결건조하여 건조 글리코겐 분말을 얻습니다.
  2. 트리클로로아세트산 침전 냉수 추출(TCA-CW)
    참고: TCA-CW 방법은 상등액을 버린 후 펠릿을 끓이지 않고 처리하고(2.1.3 단계 참조) 1mg/mL 프로테아제 억제제 칵테일을 함유한 20mL의 ddH2O에 재현탁한다는 점을 제외하고는 TCA-HW 방법과 동일합니다.
    1. 1mg/mL 프로테아제 억제제 칵테일 용액을 준비하려면 50mg의 프로테아제 억제제 칵테일을 탈이온수 1mL에 용해시키고 50:1의 비율로 희석합니다(탈이온수: 프로테아제 억제제 칵테일 용액).
  3. SDGU-CW(sucrose density gradient ultracentrifugation)를 사용한 냉수 추출
    1. 1 mg/mL 프로테아제 억제제 칵테일을 사용하여 4 mL의 글리코겐 추출 버퍼(GEB)에 1 g의 동결 건조 대장 균 분말을 용해하고 균질화합니다.
      참고: GEB는 50mM Tris, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 50mM NaF 및 5mM 피로인산나트륨으로 구성됩니다. GEB는 HCl을 사용하여 pH 8로 조정해야 합니다.
    2. 초음파 세포 분쇄기(25% 에너지, 4°C)를 사용하여 3분(8초 작업 주기 및 9초 간격) 동안 박테리아 세포를 파괴합니다. 전체 과정이 얼음 위에서 수행되는지 확인하십시오. 초음파 처리 후 박테리아 균질액을 원심분리기 튜브로 옮기고 GEB로 최종 부피 10mL까지 채우고 튜브를 소용돌이하여 혼합합니다.
      알림: 발생하는 열은 글리코겐을 분해할 수 있으므로 너무 오랫동안 균질화하지 마십시오.
    3. 6,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리기. 상층액을 10.4mL 초원심분리 튜브에 옮기고 튜브를 GEB로 상단까지 채운 다음 4°C에서 2시간 동안 360,000 x g 로 원심분리합니다.
      알림: 튜브가 채워져 있고 기포가 없는지 확인하십시오.
    4. 원심분리 후 상등액을 버리고 침전물을 탈이온수 2mL로 재현탁합니다.
    5. 새 초원심분리 튜브에 4mL의 75% 자당 용액과 4mL의 37.5% 자당 용액을 천천히 겹칩니다. 그런 다음 2.3.4 단계에서 얻은 현탁액을 자당 용액 위에 층을 이루고 탈 이온수를 보충합니다 ( 그림 1 참조).
      참고 : 자당 농도는 75 % [v / v] 및 37.5 % [v / v]입니다. 슈크로스 밀도 구배를 만들 때 주의하고 두 슈크로스 용액 사이에 관찰 가능한 층이 있는지 확인하십시오. 또한 초원심분리기 튜브에 기포가 없는지 확인하십시오.
    6. 360,000 x g 에서 4°C에서 2.5시간 동안 원심분리기를 하고 상층액을 폐기합니다. 펠릿을 200μL의 탈이온수에 용해시킵니다. 글리코겐 침전을 위해 800μL의 절대 에탄올을 첨가합니다.
    7. -20 °C에서 밤새 글리코겐을 침전시킵니다. 4,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 버립니다.
    8. 생성된 펠릿을 2mL 튜브에 400μL의 ddH2O에 용해시키고 -80°C에서 사전 동결한 다음 동결 건조하여 건조 글리코겐 분말을 얻습니다. 구조 분석을 위해 건조 글리코겐 분말을 4°C에서 보존합니다.
      참고: 자세한 절차는 그림 1에 나와 있습니다.
  4. 고온 30% 수산화칼륨 용액 추출(KOH-HW)
    1. 동결 건조 대장균 분말(50mg)을 30%[w/v] KOH 1mL에 1시간 동안 끓입니다.
    2. -20°C에서 최소 1시간 동안 침전을 위해 15mM LiCl을 포함하는 67%[v/v] 에탄올을 추가합니다. 16,000 x g 에서 4°C에서 20분 동안 샘플을 원심분리합니다.
      참고: 15mM LiCl이 포함된 67%[v/v] 에탄올에는 0.6358g LiCl, 67mL의 절대 에탄올 및 33mL의 탈이온수가 포함되어 있습니다.
    3. 펠릿을 1mL의 ddH2O에 재용해시키고 간헐적 교반으로 95°C에서 10분 동안 가열합니다.
    4. 2.4.2단계에서 설명한 대로 에탄올 침전 단계를 세 번 더 반복합니다. 최종 펠릿을 2mL 튜브에 400μL의 ddH2O에 재용해하고 -80°C에서 사전 동결한 다음 동결 건조하여 건조 글리코겐 분말을 얻습니다.

3. 글리코겐 구조 측정

  1. 투과 전자 현미경 (TEM)
    1. 글리코겐 분말을 50mM Tris-buffered saline(pH 7)에 1mg/mL의 최종 농도로 재현탁시킵니다.
    2. 현탁액을 10배 희석하고 희석된 현탁액을 글로우 방전 400메쉬 구리 그리드에 적용합니다.
    3. 2분 후, 여과지를 사용하여 그리드에서 초과 샘플을 추출하고 2% 우라닐 아세테이트 3-1방울로 그리드를 염색합니다.
    4. 75kV에서 작동하는 투과 전자 현미경을 사용하여 준비물을 검사합니다.
  2. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)
    1. 이동상 준비: 탈이온수에 0.02%(w/w) 아지드화나트륨 및 50mM 질산나트륨 용액을 준비하고 0.45μm 필터 멤브레인을 통해 여과합니다. 초음파 진동 수조를 사용하여 용액을 15분 이상 초음파 처리하여 기포를 제거합니다.
    2. 시료 전처리: 이동상을 사용하여 글리코겐 분말을 용해시켜 최종 농도가 1mg/mL가 되도록 합니다. 용액을 80°C에서 온도 혼합기에서 밤새 배양합니다. 용해된 시료를 6,000 x g 에서 실온에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 표준 SEC 바이알로 옮깁니다.
    3. DMSO 처리된 글리코겐 시료의 준비
      1. 1mg의 글리코겐 분말을 300μL의 DMSO에 용해시키고 써모믹서에서 80°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 글리코겐을 침전시키기 위해 4배 부피의 에탄올을 첨가하고 용액을 6,000 x g에서 원심분리합니다.
      2. 펠릿을 에탄올로 두 번 세척하고 펠릿을 ddH2O에 용해시키고 동결 건조합니다.
      3. 위에서 설명한 대로 샘플을 준비하여 SEC를 통해 동결 건조된 글리코겐 분말을 분석합니다.
    4. 사전 컬럼과 함께 SEC 시스템을 사용하고 1000 및 10000 컬럼을 사용하여 글리코겐 입자 크기 분포를 분석할 수 있습니다. 컬럼을 80°C로 유지하고 유속을 0.3mL/분으로 유지합니다.
  3. 형광단 보조 탄수화물 전기영동(FACE)
    1. 글리코겐 탈분지
      참고: FACE를 사용하여 사슬 길이 분포(CLD)를 감지할 때 테스트할 모든 샘플은 탈분기 전처리를 거쳐야 합니다.
      1. 시험관에 글리코겐 분말 0.5mg, 뜨거운 물(90°C) 90μL,NaN3 용액 1.5μL, 이소아밀라아제(200U/mL) 3.5μL, 아세트산-아세트산나트륨 완충액(pH 3.5) 8μL를 첨가합니다.
        참고: 이소아밀라아제(Isoamylase)를 첨가하여 테스트할 샘플의 분지사슬을 특이적으로 절단합니다. 이소아밀라아제(Isoamylase)는 α-(1-4) 결합을 파괴하지 않고 α-(1-6) 결합을 특이적으로 파괴할 수 있는 탈분지 효소로 주쇄의 구조를 파괴하지 않고 글리코겐 측쇄를 특이적으로 절단할 수 있습니다.
      2. 써모믹서에서 37°C에서 3시간 동안 혼합물을 배양합니다. 8 μL의 0.1 M NaOH 용액으로 pH 중성을 만든 후, 혼합물을 열 혼합기에서 80 ° C에서 1 시간 동안 배양한다.
      3. 글리코겐을 침전시키기 위해 혼합물에 4배 부피의 앱솔루트 에탄올을 첨가합니다. 그런 다음 실온에서 6,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 에탄올로 두 번 세척하고 펠릿을 ddH2O에 용해시키고 동결 건조합니다.
    2. 형광액의 제조
      1. APTS(8-Aminopyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt) 시약 병(각 병에는 5mg APTS가 들어 있음)을 4,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다. 15% 아세트산 용액 50μL를 첨가하여 분말을 용해시키고 잘 섞은 후 실온에서 4,000 x g 에서 2분 동안 원심분리하여 0.2M APTS 아세트산 용액을 얻습니다.
        알림: APTS 용액을 -20°C.It 의 냉장고에 보관하고 개봉 후 2주 이내에 완전히 사용해야 합니다. 그렇지 않으면 비활성화됩니다. APTS는 일반적으로 사용되는 음전하를 띤 염료로 글리코겐 사슬의 환원 말단에 결합합니다. 서로 다른 중합 정도(DP)를 가진 사슬은 모두 하나의 음전하만 전달하기 때문에 FACE는 서로 다른 질량 대 전하 비율에 따라 사슬을 분리할 수 있습니다. 이러한 방식으로 서로 다른 DP 값의 신호가 형광 검출기에 의해 감지됩니다.
    3. 분지가 제거된 글리코겐을 시험관에 옮기고 1.5μL의 APTS 용액과 1.5μL의 시아노보로수소화나트륨 용액을 추가합니다. 어둠 속에서 60 ° C에서 1.5 시간 동안 배양하십시오. 탈이온수 80μL를 넣고 실온에서 4,000 x g 에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 유지합니다.
    4. 0.5psi(대기압보다 3.4kPa 높음)에서 3초 동안 주입하여 샘플을 모세관 전기영동 시스템에 주입합니다.
      참고: 형광 표지된 선형 글루칸은 25°C에서 30kV의 인가 전압과 14mA의 대략적인 전류를 통해 분리되었습니다. 피크 면적은 질량이 다른 글루칸의 상대적인 양을 제공했습니다(인접한 피크에서 글루칸의 중합도(DP)가 1DP만큼 다름). 시료 온도는 18°C로 유지하였다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

글리코겐 입자의 크기 분포
일련의 연구에 따르면 당뇨병성 간의 글리코겐 α 입자는 취약하고 수소 결합 교란 물질 DMSO 11,12,13,14에서 쉽게 분해됩니다. 본 연구는 4가지 다른 방법을 통해 추출된 박테리아 글리코겐에 대해 입자 크기와 구조적 안정성이 어떻게 변화하는지 테스트했습니다. 4가지 방법의 모든 글리코겐 샘플을 각각 물(파란색 곡선) 및 DMSO(빨간색 곡선)로 처리했습니다. 가중치 분포 w(logRh )는 그림 2에 나와 있습니다. TCA-HW(그림 2A, 파란색 곡선) 및 TCA-CW(

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

글리코겐은 많은 박테리아에서 확인된 중요한 에너지 비축량입니다16. 글리코겐 입자의 생리학적 기능을 해부하기 위해서는 글리코겐 분자의 미세한 구조를 더 잘 이해하는 것이 필수적입니다. 지금까지 박테리아 배양에서 글리코겐을 추출하기 위한 다양한 방법이 개발되었습니다. 그러나 다양한 추출 방법에서 글리코겐 입자의 다양한 크기 분포가 관찰되었으며, 이는 손상된 글리코겐 구조를 시사합니다. 따라서 서로 다른 연구의 글리코겐 구조를 비교할 수 있도록 추출 절차를 비교하고 표준화해야 합니다. 이 연구에서는 E. coli 액체 배양에서 글리코겐을 추출하기 위해 일반적으로 사용되는 4가지 방법을 설명하는 자세한 프로토콜을 제시한 다음 글리코겐 입자의 구조적 특성화를 통해 평가합니다.

크기 분포와 관련하여, TCA-CW 및 TCA-HW의 글리코겐 입자는 Rh

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구를 완료하는 데 큰 도움이 된 통찰력과 전문 지식을 제공해 주신 퀸즐랜드 대학교(University of Queensland)와 양저우 대학교(Yangzhou University)의 로버트 길버트(Robert G. Gilbert) 교수에게 깊은 감사를 드립니다. 우리는 중국 국립 자연 과학 재단 (No. 31900022, No. 32171281), 장쑤성 자연 과학 재단 (No. . BK20180997), 쉬저우 의과대학의 젊은 과학 기술 혁신팀(No. TD202001), Jiangsu Qinglan Project(2020)가 있습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Agilent 1260 infinity SEC systemAgilent1260 infinity II입자 크기 분포
분석 컬럼PSS10-1000-Centrifuge
Eppendorf5420-Filter
membraneCambioKm-0220-
형광 보조 모세관 전기영동 시스템Beckman Coulter-Chain길이 분포
동결 건조기XinzhiSCIENTZ-10N박테리아 및 글리코겐의 동결 건조
FreezerThermo FisherForma 900시료 보관
가드 컬럼PSSSUPPERMA-Incubator
Thermo FisherPR505750R-CN-
저속 대용량 원심 분리기HexiHR / T20MM샘플 원심 분리
Multiskan FC 마이크로 플레이트 리더Thermo Fisher1410101-Optima
XPN 초 원심 분리기BeckmanXPN-100 / 90 / 80글리코겐
발진기XinbaoSHZ-82-PA-800
Plus 시스템Beckman CoulterA66528-pH
측정기Mettler ToledoFE28 -TRIS-
굴절률 검출기WyattOptilab T-rEX-
냉장고HaierBCD-406WDPD-Thermomixer
Shanghai JingxinJXH-100샘플 배양
투과 전자 현미경Hitachi CorporationH-7000글리코겐 입자 형태학
초원심분리기 튜브Beckman355651-
초음파 세포 분쇄기Ningbo XinzhiScientz-IID  박테리아 교란기
초음파 진동 수조JietuoJT-1027HTD-Vortex
믹서TiangenOSE-VX-01-Water
systemMerck MilliporeH2O-MM-UV-T탈이온수
<강>재료
8-아미노피렌-1,3,6-트리술폰산 트리소듐 염시그마 -알드리치196504-57-1-
절대 에탄올Guoyao10009228-
한천 분말SolarbioA1890
- 알파 - 아밀라아제메가 자임E-BLAAM-40ML-
아밀로 글루코시다제메가 자임E-AMGDF-40ML-
cOmplete 미니로슈4693159001-D
- (+)포도시그마-알드리치G8270-1kg-D
-포도당 분석 키트(GOPOD 형식)메가자임K-GLUC글리코겐 정량화
디메틸 설폭사이드VicmedVic147차트로픽제
E. coli BL21(DE3)TiangenCB105-02-Ethylene
diamine tetra-acetic acidVicmedVic1488-
빙초산Guoyao10000218-
글리세롤Guoyao10010618박테리아 저장
염산Guoyao10011008-Hydroxymethyl
aminomethaneSigma-AldrichV900483-500g-Isoamylase
MegaZyme9067-73-6글리코겐 탈분
리튬 클로라이드시그마-알드리치62476-100G-M9
, 최소 염, 5×시그마-알드리치M6030-1kg세균 배양
산화칼륨Guoyao10017008-Pullulan
표준PSS--
아세트산 나트륨 삼수화물Guoyao10018718-
아지드 나트륨그마-알드리치26628-22-8-
염화나트륨Guoyao10019318세균성 문화
시아노보로하이드라이드나트륨 화웨이루이hws001297-
디인산나트륨시그마 - 알드리치71515-250g-
플루오리드나트륨맥클린S817988-250g-
수산화나트륨Guoyao10019762-
질산나트륨Guoyao10019928-
피로인산나트륨시그마-알드리치V900195-500g-
수크로오스Guoyao10021463-
트리클로로아세트산Guoyao40091961-
트립톤옥소이드LP0042박테리아 배양
효모 추출물옥소이드LP0021세균 배양
당 수 시케

References

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