박테리아 글리코겐 입자의 분자 구조 특성화를 위한 비분해성 추출 방법

Jun-Jiao Wang; Meng-Meng Wang; You-Wei He; Zhang-Wen Ma; Zi-Yi Wang; Rui Qiao; Xin-Le Tan; Qing-Hua Liu; Liang Wang

doi:10.3791/63016

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방법 논문

박테리아 글리코겐 입자의 분자 구조 특성화를 위한 비분해성 추출 방법

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DOI:

10.3791/63016

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2022년 2월 18일

Jun-Jiao Wang^*¹ , Meng-Meng Wang^*²^,³ , You-Wei He⁴ , Zhang-Wen Ma²^,³ , Zi-Yi Wang⁵^,⁶^,⁷ , Rui Qiao²^,³ , Xin-Le Tan⁵^,⁶ , Qing-Hua Liu⁸ , Liang Wang¹^,²

¹Department of Bioinformatics, School of Medical Informatics and Engineering, Xuzhou Medical University, ²Jiangsu Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, ³Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, ⁴Department of Biological Sciences, School of Life Sciences, Xuzhou Medical University, ⁵School of Chemistry and Molecular Biosciences, The University of Queensland, ⁶Centre for Nutrition and Food Sciences, Queensland Alliance for Agriculture and Food Innovation, The University of Queensland, ⁷Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety, College of Agriculture, Yangzhou University, ⁸State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicines, Macau University of Science and Technology

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

박테리아 글리코겐 구조는 분자 분해 및/또는 편향된 샘플링을 초래할 수 있는 추출 방법의 영향을 크게 받습니다. 이러한 문제를 최소화할 수 있는 방법을 개발하는 것이 필수적입니다. 여기에서는 추출 아티팩트를 최소화하기 위한 핵심 기준으로 크기 분포 및 체인 길이 분포를 사용하여 4가지 추출 방법을 비교했습니다.

초록

현재 글리코겐 공간 구조를 손상시키거나 글리코겐을 부분적으로만 추출하는 다양한 글리코겐 추출 방법이 존재하여 글리코겐 미세 분자 구조의 편향된 특성화를 초래합니다. 박테리아에서 글리코겐 구조의 역동적인 변화와 글리코겐 입자의 다양한 기능을 이해하려면 분해를 최소화하면서 글리코겐을 분리하는 것이 필수적입니다. 이 연구에서는 당 밀도 구배 초원심분리(SDGU-CW) 를 통한 냉수(CW) 침전을 사용하여 가벼운 글리코겐 분리 방법을 입증했습니다. 비교를 위해 기존의 트리클로로아세트산(TCA) 방법과 수산화칼륨(KOH) 방법도 수행했습니다. 일반적으로 사용되는 실험실 균주인 Escherichia coli BL21(DE3)은 이 연구에서 시연 목적으로 모델 유기체로 사용되었습니다. 다양한 방법을 사용하여 글리코겐 입자를 추출한 후, 입자 크기 분포를 위한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)와 선형 사슬 길이 분포를 위한 형광단 보조 모세관 전기영동(FACE)을 통해 구조를 분석하고 비교했습니다. 분석 결과 SDGU-CW를 통해 추출된 글리코겐은 분해가 최소화된 것으로 확인되었습니다.

서론

글리코겐은 글루코실 잔기와 작지만 상당한 양의 단백질로 구성된 고도로 분지된 다당류로, 모든 글루코실 잔기는 선형 사슬의 α-1,4-글리코시드 결합과 분^{지 점에서} α-1,6-글리코시드 결합을 통해 함께 연결됩니다 1. 글리코겐 입자의 구조는 일반적으로 1) 단쇄 올리고머, 2) 구형 β 입자(직경 ~20nm), 3) 직경이 대략 최대 300nm인 β 입자로 함께 응집된 큰 장미 모양의 α 입자의 세 가지 계층으로 나뉩니다. 최근에는 글리코겐 α 입자가 진핵생물에서 두 가지 구조적 상태, 즉 취약한 상태와 안정적인 상태를 가지고 있음이 밝혀졌습니다. 여기서 취약성은 DMSO²와 같은 카오트로픽 물질이 존재할 때 큰 α 입자가 더 작은 β 입자로 해리되는 것을 의미합니다. 추가 분석에 따르면 당뇨병이 있는 간의 글리코겐 α 입자는 일관되게 취약하며3 취약한 α 입자는 안정적인 α 입자보다 훨씬 빠르게 분해됩니다⁴. 따라서 글리코겐의 구조적 취약성은 당뇨병의 고혈당 상태를 악화시킬 수