방법 논문

성인 돼지 섬 격리

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DOI:

10.3791/63017

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2021년 10월 21일

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1Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, Shenzhen Institute of Translational Medicine, The First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 2Shenzhen Xenotransplantation Medical Engineering Research and Development Center, Shenzhen Institute of Translational Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 3Imaging Department, Shenzhen Institute of Translational Medicine, The First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 4Faculty of Science, University of Waterloo, 5School of Life Science, The Chinese University of Hong Kong, 6General Surgery, The First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College, 7Director Islet Programs, Imagine Pharma

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 상세한 프로토콜은 소화 단계부터 정제를 거쳐 섬의 최종 기능 평가에 이르기까지 성체 돼지 섬을 분리하는 방법론적 단계를 다룹니다. 이 개요는 연구 기관에서 성체 돼지 섬 격리에 대한 지침으로 사용할 수 있습니다.

초록

제1형 당뇨병(T1DM)은 췌장 β세포의 자가면역 파괴로 인해 인슐린 생산이 거의 또는 전혀 이루어지지 않아 발생합니다. 섬 이식은 전통적인 인슐린 요법과 비교할 때 당 대사 조절 개선, 합병증 진행 감소, 저혈당 에피소드 감소와 함께 T1DM 치료에 중요한 역할을 합니다. 3상 임상시험 결과에서도 T1DM에서 섬 동종이식의 안전성과 효능이 입증되었습니다. 그러나 췌장 기증자의 부족으로 인해 광범위한 사용이 제한됩니다. 돼지와 같은 작은 섬의 공급원으로서의 동물은 대안적인 선택을 제공합니다. 돼지 췌장의 구조가 생쥐나 인간의 섬과 다르기 때문에 돼지 췌장 격리 절차는 여전히 까다롭습니다. 세포 이식을 통해 T1DM을 치료하기 위한 임상 환경으로 대체 돼지 섬 공급원(이종발생)을 번역하는 것이 매우 중요하기 때문에 돼지 섬을 분리하기 위한 비용 효율적이고 표준화되며 재현 가능한 프로토콜이 시급히 필요합니다. 이 원고는 인간이 아닌 영장류에 돼지 섬을 성공적으로 이식한 이전 프로토콜을 기반으로 성체 돼지 섬을 분리하고 정제하는 간단하고 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 이것은 COBE 2991 Cell Processor와 같은 특수 장비를 사용하지 않는 초보자 가이드가 될 것입니다.

서론

제1형 당뇨병(T1DM)은 베타 세포의 자가면역 파괴로 인해 인슐린 생산이 거의 또는 전혀 이루어지지 않는 심각한 질환입니다 1,2,3. 상당수의 T1DM 환자는 인슐린 요법으로 혈당 불안정을 안정화할 수 없으며 생명을 위협하는 저혈당 삽화를 경험합니다. 섬 이식은 성공적일 때 그렇게 할 수 있습니다. 전 세계적으로 1,500명 이상의 당뇨병 환자가 섬 이식을 성공적으로 받았으며, 이는 췌장 이식보다 위험은 낮지만 장기적인 결과 성공을 보여주고 있다4.

인슐린 요법과 비교했을 때, 섬 이식은 합병증의 진행을 줄이는 데 더 나은 결과를 보인다5. 3상 임상시험 결과에서도 T1DM 6,7에 대한 섬 동종이식의 안전성과 효능이 입증되었습니다. 섬 이식은 생명을 위협하는 저혈당 증상을 경험하는 T1DM 환자에게 현재 이용 가능한 최상의 치료 옵션일 수 있습니다.

그러나 인간 동종 공여자 섬의 부족으로 인해 섬 이식의 광범위한 사용이 제한됩니다 8,9. 그러므로, 동물섬을 대체품으로 사용하는 것이 바람직하다10. 돼지는 전임상 이종이식에서 섬세포의 기증자로 선정되었으며, 1) 가용성, 2) 인간과의 대사 유사성, 3) 다소 큰 베타 세포 질량, 4) 인간과의 면역학적 호환성을 개선하기 위한 유전자 조작의 가능성으로 인해 임상에 잠재적으로 번역될 수 있습니다11.

섬의 높은 순도와 생존력은 이종 이식의 성공을 위한 핵심 단계입니다. 그러나 성체 돼지 기증자로부터 섬을 분리하는 절차는 췌장 자체의 구조로 인해 까다롭고, 췌장 자체가 생쥐 또는 인간의 섬과 다르기 때문에12. 일반적으로 돼지 췌장 섬의 모양은 조밀하지 않다12. 인간과 설치류의 췌장섬과 비교했을 때, 돼지섬은 더 쉽게 해리된다12. 그러나 긴 배양 시간을 동반한 섬 세포의 바깥층의 자발적인 해리는 췌장 섬 크기10의 상당한 감소로 이어집니다.

섬 분리 과정에서 많은 요인이 섬의 품질에 영향을 미치는데, 예를 들어 기증자의 나이, 따뜻한 허혈 시간, 효소 활성, 효소 주입에 의한 팽창13,14. 이전의 많은 연구에서 돼지섬 분리 방법을 제공했지만, 연구자를 위한 효과적인 지침으로 상세한 단계별 비디오 프로토콜은 없습니다 10,15,16,17,18,19,20,21,22,23.

이를 위해 이 상세한 프로토콜은 장기 채취부터 섬의 분리 후 기능 평가에 이르기까지 모든 격리 단계를 다루며, 쉽게 적용할 수 있도록 프로세스에 대한 간단하고 이해하기 쉬운 개요를 제공하기를 희망합니다. 이 프로토콜은 수정10,11과 함께 이전에 발표된 방법을 기반으로 합니다.

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프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 심천 제 2 인민 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았으며 모든 국가 규정을 준수합니다. 이 프로토콜에서는 시장에서 구입한 Duroc-Landrace-Yorkshire 돼지(~6개월)를 췌장 기증자로 사용했습니다. 채취한 췌장의 무게는 123.63g± 22.50g이었다. 실험 중에는 보호복, 마스크, 장갑, 모자를 포함한 개인 보호 장비를 착용합니다.

1. 배지 준비

  1. 세척 매체: 세척 매체 100mL를 준비하려면 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS), 2% 돼지 혈청, 20mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid(HEPES) 및 1% Penicillin-Streptomycin(P/S)을 혼합합니다.
  2. 수집 배지: RPMI 1640을 5% 돼지 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S)과 혼합합니다.
  3. 배양 배지: CMRL 1066을 10% 돼지 혈청, 10mmol/L 니코틴아미드, 1% P/S 및 2mmol/L L-글루타민과 혼합합니다.
  4. 효소 용액: HBSS에서 1mg/mL 콜라겐분해효소 V형(활성: 918단위/mg 고체) 용액을 준비합니다.
  5. 저포도당 농도 용액: 저포도당 농도 용액을 준비하려면 0.5% 소 혈청 알부민(BSA) 및 2.8mM D-글루코스를 Kreb의 Ringer 중탄산염 완충액(KRBB) 1mL에 첨가합니다.
  6. 고포도당 농도 용액: 고포도당 농도 용액을 준비하려면 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)과 28mM D-포도당을 1mL의 Kreb's Ringer bicarbonate buffer(KRBB)에 첨가합니다.

2. 췌장 회수

  1. 돼지 마취 및 피부 준비
    1. 기증자 돼지를 마취제 Lumianning(2.5-5 mg/kg) 및 Profopol(2-3 mg/kg)의 근육 주사로 마취합니다(자세한 내용은 재료 표 참조).
    2. 가스 마취 마스크로 1-1.5L/min 환기량에서 1%-3% 이소플루란으로 마취를 유지합니다.
    3. 심박수를 모니터링하여 적절한 마취를 확인하십시오. 마취 상태에서 건조함을 방지하기 위해 수의사 연고를 눈에 사용하십시오.
    4. 복부를 면도하고 요오드로 세척한 다음 멸균 수술용 드레이프로 돼지를 적절하게 덮습니다.
  2. 복부 열기
    1. 멸균 상태를 확인한 후 꼬리에 약간 가까운 xipoid에서 배꼽까지 정중선 절개를 만듭니다.
    2. 횡격막을 절개합니다.
    3. 혈관 겸자를 사용하여 간상대동맥과 간상대정맥(IVC)을 분리한 다음 동일한 방법으로 대동맥상과 간하정맥을 분리합니다.
    4. 혈액 응고를 방지하기 위해 돼지에게 헤파린(100U/kg)을 정맥 주사합니다.
    5. 소장과 대장을 밖으로 내밀고 간과 위를 머리 쪽으로 밀어 췌장을 완전히 드러냅니다.
  3. 췌장 관류
    1. 혈관 겸자로 횡격막 위의 대동맥을 고정하고 대동맥 캐뉼라(16G)를 통해 신장 대동맥 분기 위의 대동맥을 삽관하고 2-0 봉합사로 묶습니다.
    2. 대동맥 캐뉼러(16G)를 통해 동물에게 2-3리터의 차가운 HBSS 용액(이전에는 4°C에서 포장 및 유지)을 주입합니다. 중력에 의해 대동맥 캐뉼라를 통해 HBSS 용액을 주입하고, 간상IVC와 IVC를 transexection하여 관류액을 방출합니다.
      참고: IVC 유출이 명확해질 때까지 주입을 계속합니다.
  4. 췌장 절제술
    1. 망막을 벗겨내고 비장과 함께 췌장과 비장엽을 찾아 분리합니다.
    2. 췌장의 연결된 엽을 인접한 조직과 분리합니다.
    3. 십이지장의 하강 부분에서 주요 췌장을 찾으십시오. 담관을 봉합사(2-0)로 접합하고 췌관 근처에서 가위로 절제합니다.
    4. 췌장 머리 양쪽에 Vater의 앰풀라를 포함하는 십이지장의 일부를 혈관 겸자로 고정한 다음 가위로 십이지장을 절제합니다.
    5. 췌장 전체를 꺼내 차가운 HBSS에 담근 후 즉시 섬 격리 시설로 운반합니다.
      참고: 돼지는 펜토바르비탈 나트륨(100-200mg/kg)을 사용하여 안락사되었습니다. HBSS의 관내 주입 또는 보존 용액은 지역 도살장에서 췌장을 조달하는 경우 장기 조달 현장에서 췌장을 팽창시키는 데 사용할 수 있습니다.

3. 다음 실험을 위해 3개의 생물 안전 캐비닛을 준비합니다.

  1. 췌장 청소를 위한 신장 세면대, 수술 기구 및 비커가 있는 생물 안전 캐비닛 #1을 설정합니다(섹션 4, 그림 1A).
  2. 수조, 연동 펌프, 재순환 튜브가 있는 튜브 스탠드 및 섬 소화를 위한 소화실이 있는 생물 안전 캐비닛 #2를 설정합니다(섹션 5, 그림 1B).
  3. 효소 준비, 섬 정제 및 다음 단계를 위한 일회용 필터와 원심분리 튜브가 있는 생물 안전 캐비닛 #3을 설정합니다(섹션 6-8, 그림 1C).

4. 췌장 청소

  1. 췌장을 청소하고 무게를 잰다.
    1. 생물안전성 캐비닛 #1에서 200mL의 요오드로퍼에 췌장을 3분 동안 헹굽니다. 차가운 HBSS 200mL에 췌장을 각각 2분씩 2회 헹굽니다.
    2. 세척한 췌장을 얼음 위에 100mL의 세척 매체가 들어 있는 신장 세면대에 넣습니다.
    3. 앰풀라를 고정하고 십이지장을 절제합니다. 외부 지방과 결합 조직의 췌장을 청소합니다.
    4. 췌장의 무게를 잰다.

5. 췌장 소화

  1. 콜라겐 분해 효소의 주입
    1. 췌장의 환형 가지 중 하나의 단면을 자르고 18G 혈관 (관 직경이 더 작은 경우 20G 혈관 고려)을 췌관에 삽입하고 2-0 꼰 실크 봉합사로 제자리에 봉합합니다.
    2. 췌장 머리 부근의 연결엽을 통과하는 조직 다리를 절제하고, 췌장 머리 부근의 절개 부위 측면에 카테터를 고정하여 효소 누출을 줄입니다.
    3. 더 나은 관내 효소 주입을 위해 여러 개의 혈관을 배치합니다. 이를 위해 췌장 기관을 절제하여 관을 노출시킨 후 추가 혈관(크기 20-22G)을 삽입합니다.
    4. Luer-lock 커넥터가 있는 1m 실리콘 튜브(16#)를 포함한 충전 파이프라인을 설치합니다. 튜브의 중간 부분은 연동 펌프 헤드에 내장되어 있습니다.
    5. 연동 펌프를 켜서 튜빙 시스템(튜브 크기 16#) 300mL의 1mg/mL, 24°C로 예열된 콜라겐분해효소 V형(활성: 918단위/mg)을 채우고 배관의 기포를 제거합니다.
    6. 관류 튜브를 혈관관에 연결하고 20mL/분의 속도로 연동 펌프를 켭니다.
    7. 대부분의 효소가 주입되고 췌장이 잘 팽창하면 관류를 중지합니다(그림 2B).
    8. 관류하는 동안 췌장 주위에 형성되는 투명한 젤라틴 조직을 자릅니다.
      참고: 겔이 챔버의 필터를 막고 소화된 조직을 수집하기 어렵게 만들 수 있기 때문에 이 단계는 매우 중요합니다(그림 2B).
    9. 주입 후 혈관을 제거하십시오.
  2. 조직 소화
    1. HBSS 용액 1L를 36°C로 예열합니다. 밀폐 된 시스템에 연결된 소화 챔버와 튜브로 구성된 소화 시스템을 미리 준비하고 회로의 가열 코일을 36 ° C 수조로 옮깁니다.
    2. 췌장을 3-4등분으로 자르고 콜라겐분해효소 V형을 500mL 비커에 붓습니다.
    3. 비커를 멸균 페트리 접시 뚜껑으로 덮고 생물 안전 캐비닛 #2로 옮긴 다음 비커의 내용물을 4개의 실리콘화된 유리 구슬과 500μm 메쉬가 들어 있는 소화실에 넣습니다.
    4. 챔버를 닫고 나사를 조입니다. 남은 효소를 순환 비커에 넣고 연동 펌프를 80mL/분의 속도로 켭니다.
    5. 5.2.1단계에서 예열된 따뜻한 HBSS 용액(일반적으로 약 150mL)을 추가하여 회로를 채웁니다. 챔버를 부드럽게 흔들고 뒤집어서 실리콘화된 유리 구슬이 조직에 부딪히도록 합니다.
      참고: 돼지섬은 인체 조직보다 더 섬세하기 때문에 손상을 방지하기 위해 흔들림이 균일하고 느려야 합니다. 조직이 소화됨에 따라 조직이 떨어져 나가기 시작하고 챔버 밖으로 흘러나옵니다.
    6. 2분마다 회로에서 샘플(약 1mL)을 채취하여 1분 동안 흔든 후 빈 섬을 확인합니다.
    7. 샘플을 80μL의 디티존(DTZ)이 있는 6웰 플레이트에 넣습니다. 인산염 완충 식염수(PBS) 2mL를 추가하고 40배 배율로 현미경으로 샘플을 검사합니다. DTZ는 섬을 빨간색으로 염색합니다.
  3. 다이제스트의 수집
    1. 자유 섬이 관찰될 때까지 소화를 계속하십시오(많은 섬이 여전히 외분비에 부분적으로 갇혀 있더라도).
      참고: 섬 방출에는 약 10-15분이 소요되지만 소화 시간은 종종 공여자의 나이, 효소 로트, 효소 농도 등에 영향을 받습니다.
    2. 회로를 열고 방출된 조직을 1L 병에 모으십시오. 수집하는 동안 병을 얼음 위에 두어 콜라겐분해효소 유형 V를 비활성화하는 데 도움이 됩니다.
    3. 남은 따뜻한 HBSS 용액(~850mL, 5.2.1단계)을 재순환 비커에 넣고 분해실에서 나머지 소화된 조직을 수집합니다.
    4. 챔버에 차가운 수집 매체를 추가합니다(재순환 비커를 통해 ).
      알림: 조직 펠릿이 작아지면 수집을 중지하십시오. 수집 단계(단계 5.3.2-5.3.3)는 최대 40-75분과 5-8L의 배지 수집이 소요될 수 있습니다.
    5. 채취 병의 조직을 250mL 코니컬 원심분리 튜브로 옮기고 4°C에서 3분 동안 200 x g 로 원심분리합니다.
    6. 상층액을 버리고 500mL의 새로운 수집 배지에 조직을 재현탁합니다.
    7. 모든 분해물이 수집될 때까지 세포 펠릿을 저온 수집 매체(500mL)에 계속 결합합니다.
    8. 차가운 매체에 현탁된 세포 펠릿을 원심분리(200 x g, 4°C에서 3분)로 세척합니다.
    9. 상등액을 버리십시오. 섹션 6-8에 언급된 단계에 따라 세포 펠릿을 평가하고 정량화합니다.
      참고: 최종 부피는 췌장 크기에 따라 다르지만 40-80mL 이내일 것으로 예상됩니다.

6. 섬 정화

  1. pig islets를 density gradient separation으로 정제합니다.
    참고: 사용된 밀도 구배 솔루션에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
    1. 50mL 원뿔형 튜브에 췌장 조직 2mL를 추가합니다.
    2. 12mL의 1119 폴리슈크로오스 구배(1.119g/cm3)를 추가하여 각 2mL의 췌장 조직을 재현탁합니다.
    3. 1083 폴리수크로오스 용액 10mL(1.083 g/cm3), 1077 폴리수크로오스 용액(1.077 g/cm3) 10mL, 1037 폴리수크로오스 용액(1.037 g/cm3) 10mL, HBSS 5mL를 연속적으로 첨가합니다.
      참고 : 1037 폴리 자당 용액 (1.037 g / cm3 )은 1077 폴리 자당 용액 (1.077 g / cm3 )과 고긴장 시트레이트 퓨린 용액 (38.5 mL : 11.5 mL)을 혼합하여 제조됩니다.
    4. 900 x g 에서 4°C에서 10분간 브레이크 없이 원심분리기.
    5. 1077 폴리자당 용액과 1037 폴리자당 용액의 층 사이에 있는 섬을 흡인합니다.
    6. 섬을 50mL 원심분리 튜브로 옮기고, 각 튜브에 액체를 고르게 분배하고, 원심분리 전에 균형을 맞춥니다.
  2. 돼지 섬을 씻으십시오.
    1. 200 x g 에서 4 °C에서 3 분 동안 원심 분리기, 상층액을 버립니다. 수집 매체를 추가하여 부피를 45mL로 높입니다.
    2. 200 x g 에서 4°C에서 3분 동안 원심분리기, 약 2mL의 상등액을 남기고; 부드럽게 흔들어 섞습니다.
    3. 모든 펠릿을 동일한 50mL 원심분리 튜브에 결합합니다. 수집 매체를 추가하여 부피를 45mL로 높입니다.

7. IEQ(islet equivalents) 및 섬 양식 계산

  1. 섬의 DTZ 염색
    1. 섬을 함께 모으고, 더 많은 수집 매체를 추가하여 부피를 최대 250mL까지 끌어올린 다음 섬을 다시 현탁시킵니다.
    2. 대표 샘플 500μL를 취하여 80μL의 DTZ가 있는 35mm 접시에 넣습니다. 실온에서 1-2분 동안 배양한 다음 PBS 2mL를 추가합니다.
    3. 도립 현미경으로 40배 배율로 검사합니다. 섬 응집체는 DTZ에 의해 빨간색으로 염색됩니다.
  2. 스테인드 된 섬 계산
    1. 염색된 섬을 표 1에 나열된 크기 범주로 나누어 세십시오. 변환 계수를 사용하여 크기에 따라 섬 등가물(IEQ)을 결정합니다.
      참고: IEQ 변환은 DTZ 양성 응집체의 직경이 대다수가 50μm 이상일 때 수행됩니다(성체(>2세) 및 일부 성체(6-12개월) 제제의 경우 7.2.4단계로 진행). 다른 모든 경우(생후 6개월 미만의 어린 돼지와 나머지 어린 성체 돼지의 경우)에서는 입자 부피 또는 DNA 함량을 기준으로 섬의 수를 추정했습니다(7.2.2-7.2.3 단계에 따름).
    2. (선택 사항) 팔레트를 측정하기 위해 200 x g , 4°C에서 2분 동안 원심분리기.
    3. (선택 사항) cell proliferation assay kit를 통해 단일 섬과 섬 세포 펠릿의 DNA 함량을 평가합니다. DNA 함량 및 면역세포화학 분석에서 돼지 베타 세포 수를 외삽합니다.
    4. 모든 범주를 추가하고 샘플에 대한 총 IEQ를 확인합니다. 그 숫자에 분수의 부피를 곱하십시오. (예: 250mL 분획의 500μL에서 200 IEQ = 200 x 2 x 250 = 100,000 IEQ).
  3. 섬 문화
    1. 섬을 200 x g 에서 4 °C에서 1 분 동안 원심 분리; 상등액을 버리십시오.
    2. 예열된 배양 배지 5mL를 추가하여 섬을 재현탁시키고 150mm 페트리 접시에 옮깁니다.
      참고: 10,000개의 섬/접시를 다시 현수합니다.
    3. 더 많은 배양 배지를 추가하여 150mm 페트리 접시에서 최대 30mL의 부피를 가져옵니다.

8. 섬의 품질 평가

  1. Calcein AM (CA) - 섬의 Propidium Iodide (PI) 염색
    1. 50개의 섬을 48웰 플레이트에 직접 선택합니다. HBSS 1mL로 한 번 씻으십시오.
    2. 세포 생존율 염색 키트의 지침에 따라 1x CA 및 1x PI를 포함하는 혼합물 200μL를 추가합니다.
    3. 페트리 접시를 덮고 37°C의 인큐베이터에 30분 동안 넣습니다.
    4. 형광 현미경을 사용하여 섬을 시각화하고 이미지를 캡처합니다.
    5. CA-PI 염색 후 살아있는 세포(녹색)와 죽은 세포(빨간색)를 계수하여 생존율을 정량화합니다.
  2. 포도당 자극 인슐린 분비(GSIS)
    1. 저포도당 농도 용액 1mL를 24웰 플랜트의 웰 3개에 추가합니다.
    2. 적어도 하룻밤 동안 배양한 후 직경 100-200μm 범위에서 비슷한 크기의 섬 100개를 직접 골라 저포도당 농도 용액으로 미리 채워진 24웰 플레이트의 3개의 웰로 옮깁니다(8.2.1단계 참조).
      참고: 배양 배지를 씻어내기 위해 우물로 옮기기 전에 HBSS가 있는 중간 우물에서 섬을 세척하십시오.
    3. 37°C의 5% CO2 인큐베이터에서 30분 동안 섬을 배양합니다.
    4. 섬을 건드리지 않고 피펫으로 상등액을 조심스럽게 제거합니다.
    5. 새로운 저혈당 농도 용액 1mL를 추가합니다.
    6. 37°C의 5% CO2 인큐베이터에서 60분 동안 섬을 배양합니다.
    7. 상층액(섬 없음)을 수집하여 최소 500μL를 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 여기에는 저포도당 자극 하에서 분비되는 인슐린이 포함되어 있습니다.
    8. 고포도당 농도 용액 1mL를 동일한 웰에 조심스럽게 첨가합니다.
    9. 37°C의 5% CO2 인큐베이터에서 60분 동안 섬을 배양합니다.
    10. 또 다른 500μL의 배양 배지를 새로운 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 여기에는 고포도당 자극 하에서 분비되는 인슐린이 포함되어 있습니다.
    11. 돼지 인슐린에 대한 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA) 키트를 사용하여 저포도당 및 고포도당 자극 후 방출되는 인슐린의 농도를 측정합니다(단계 8.2.7 및 8.2.10).
      참고: 자극 지수(SI)는 고포도당 자극 후 측정된 인슐린 농도를 저포도당 자극 후 인슐린 농도로 나눈 비율로 계산됩니다.

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결과

생물 안전 캐비닛의 준비는 그림 1에 나와 있습니다. 3개의 독립적인 운영 공간이 설정됩니다. 생물안전성 작업대 #1에는 췌장 트리밍을 위한 신장 세면대, 수술 기구 및 비커가 설치되어 있습니다(그림 1A). 생물안전 캐비닛 #2에는 수조, 연동 펌프, 재순환 튜브가 있는 튜브 스탠드, 섬 소화를 위한 소화실이 설정되어 있습니다(그림 1B). Biosafety cabinet #3에는 효소 준비, 섬 정제 및 다음 단계를 위한 일회용 필터와 원심분리기 튜브가 설정되어 있습니다(그림 1C).

췌장(효소 관류 전후)은 그림 2에 나와 있습니다. 콜라겐분해효소 V형 용액은 췌장 머리에서 시작하여 췌관을 통해...

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토론

돼지를 섬의 공급원으로 사용하는 섬 이종 이식은 인간 섬의 부족을 극복하기 위한 유망한 접근 방식입니다. 성체 돼지 섬을 격리하는 것은 쉽지 않지만, 몇몇 그룹은 지속적으로 돼지 섬을 성공적으로 격리하기 위한 프로토콜을 수립했습니다10,11. 방법에 관계없이, 제품의 높은 품질을 확인하기 위해 섬의 생존 가능성과 기능적 특성을 입증해야 합니다. 이 프로토콜은10,11 비디오 형식으로 게시 된 프로토콜을 기반으로하여 쉽게 이해하고 재현 할 수 있습니다.

이전 보고서와 우리의 경험에 따르면, 성체 돼지 섬13,14

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공개 사항

저자는 이해 상충을 보고하지 않습니다.

감사의 글

전체 이종 이식 시스템을 설정하는 데 도움을 주신 David K. C. Cooper 교수(매사추세츠 종합병원 이식 과학 센터)에게 감사드립니다. 도움이 되는 토론과 제안을 해주신 Miss Xingling Hu (Shenzhen Second People's Hospital), Miss Xiaohe Tian (University of California, Berkeley), Mr. Bo Zhou (Boston University)에게 감사드립니다. 이 연구는 중국 국가핵심연구개발프로그램(2017YFC1103701, 2017YFC1103704), 광둥성 고급병원 건설을 위한 특별기금(2019), 선전시 싼밍 의학사업 (SZSM201812079)의 지원으로 이루어졌다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.22 & 마이크로; m 500 mL 일회용 필터Corning431097
1 L 플라스틱 파란색 캡 병CelltransYKBH1
10 mL, 25 mL 일회용 피펫CORNING4488
150 mm 페트리 접시BIOLGIX66-1515
1x HBSS basicGIBCOC14175500BT
200 mL 원뿔형  원심 분리기 병Falcon
50 mL  원심분리기 튜브NEST602052/430829
500 mL Ricordi ChamberBiorep600-MDUR-03
500-micron meshYikangYKBE
6 웰 플레이트COSTAR3511
Angiocatheter (16G, 18G, 20G)BD682245, 383005, 383012
마취기RWDR620-S1
마취제 A: 루미안닝 (2.5– 5 mg/kg)Huamu, 중국동물 약물 GMP (2015)
070011777
마취제 B: 프로포폴 (2– 3 mg/kg)Sigma AldrichS30930-100g
비커(500mL, 1000mL)ShuniuSB500ml, SB1000ml
혈당 측정기Sinocare2JJA0R05232
혈당 검사 스트립Sinocare41120
Calcein/PI 세포 생존력 분석 키트BeyotimeC2015M
CMRL 1066Thermo Fisher 과학11530037
Collagenase VSigma AldrichC9263
CyQUANT 세포 증식 분석 키트분자 프로브C7026
소화관CelltransYKBAO
일회용 혈액 채혈 바늘FKE20153152149
DithizoneSigma AldrichD5130
드레이프Xinwei20182640332
플랫 섀시JinzhongR0B010
경막외 카테터AoocnNo. 20163661148
Heparin SodiumChinawanbang99070
HEPESGIBCO15630-080
Histopaque 1077Sigma Aldrich1077-100ml1077 Polysucrose 용액
Histopaque 1083Sigma Aldrich10831-100ml1083 폴리자당 용액
Histopaque 1119Sigma Aldrich11191-100ml1119 폴리자당 용액
주입 튜브BOON20163660440
요오드LIRCONQ/1400ALX002
이소플루란RwdlsR510-22-16
No. 0-2 봉합JinhuanNo. 20142650770
No. 22 수술 블레이드Lianhui2011126
페니실린/스트렙토마이신GIBCO15140-122
연동 펌프LongerPumpBT300-2J
돼지 혈청Kangyuan20210601
RPMI-1640 미디엄GIBCOC1875500BT
샘플링 주사기YikangYKBB0
메스JinzhongJ11030
질화 규소 구슬CelltransYKBI0
스트레이트 혈관 겸JinzhongJ31120
스트레이트 사이드 항아리Nalgene2118-0001
조직 핀셋JinzhongJ41010
조직 가위JinzhongJ21210
이가 있는 집게JinzhongJD1060
수건 집게Shinva154285
Vacutainer 혈액 채취 관Sanli20150049
목욕YihengHWS-12
352075사 자

참고문헌

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