이 프로토콜은 식물 숙주를 사용하여 딱정벌레의 타액 단백질을 검출하고 딱정벌레 벡터에 의해 방출되는 식물 바이러스 단백질을 검출하는 방법을 보여줍니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
곤충 벡터는 농업적으로 중요한 많은 식물 바이러스를 수평으로 전염시킵니다. 식물 바이러스의 절반 이상이 입 부분을 뚫고 빠는 반구 곤충에 의해 전염됩니다. 바이러스 전파 동안 곤충 타액은 타액 벡터 바이러스와 곤충 단백질이 곤충에서 식물 숙주로 식물의 면역 반응을 유발하거나 억제하기 때문에 바이러스 벡터 숙주를 연결합니다. 타액 단백질의 식별 및 기능 분석은 아르보 바이러스-숙주 상호 작용 연구 분야에서 새로운 초점 영역이 되고 있습니다. 이 프로토콜은 식물 숙주를 사용하여 딱정벌레의 타액에서 단백질을 검출하는 시스템을 제공합니다. 벼난쟁이 바이러스(RDV)에 감염된 딱정벌레 벡터 Nephotettix cincticeps 가 그 예입니다. N. cincticeps 의 타액에 의해 매개된 RDV의 비텔로제닌과 주요 외부 캡시드 단백질 P8은 N. cincticeps 가 먹는 벼에서 동시에 검출될 수 있습니다. 이 방법은 곤충 먹이 후 식물 숙주에 일시적으로 남아 있는 타액 단백질을 테스트하는 데 적용할 수 있습니다. 이 검출 시스템은 헤미프테란-바이러스-식물 또는 헤미프테란-식물 상호작용 연구에 도움이 될 것으로 믿어집니다.
서론
근본적인 문제인 아르보 바이러스의 벡터 숙주 전파 방식은 생물학의 최전선에 있습니다. 농업적으로 중요한 많은 식물 바이러스는 곤충 매개체에 의해 수평으로 전염된다1. 식물 바이러스의 절반 이상이 진딧물, 흰파리, 딱정벌레, 식물벌레 및 총채벌레를 포함한 반구 곤충에 의해 매개됩니다. 이 곤충들은 식물 바이러스를 효율적으로 전염시킬 수 있는 뚜렷한 특징을 가지고 있다1. 그들은 구멍을 뚫고 빨아들이는 입 부분을 가지고 있으며 체관부와 목부에서 수액을 먹고 타액을 분비합니다 1,2,3,4. 기술의 개발과 개선으로 타액 성분의 식별 및 기능 분석은 집중 연구의 새로운 초점이 되고 있습니다. 타액에 있는 알려진 타액 단백질에는 펙티에스테라제, 셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 알칼리성 포스파타제, 폴리페놀 산화효소 및 수크라제와 같은 수많은 효소가 포함되며, 그 중에서도 5,6,7,8,9,10,11,12,13
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
독성이 없는 성체 딱정벌레는 중국 푸젠 농림대학교의 벡터 매개 바이러스 연구 센터에서 전파되었습니다.
1. 무독성 곤충 사육
- 40cm x 35cm x 20cm(길이 x 너비 x 높이)의 큐브 케이지에서 벼 묘목에 성충을 올려놓습니다. 케이지의 한쪽을 환기를 위해 방충망으로 덮으십시오.
- 딱정벌레가 있는 케이지를 26°C의 내장 습도 조절기가 있는 인큐베이터에 보관하고 상대 습도는 60-75%이고 16시간 밝기와 8시간 어둠의 광주기에서 유지합니다.
- 흡인기 사용하여 케이지에서 모든 성인을 매주 신선한 벼 묘목이 들어있는 새 케이지로 부드럽게 옮깁니다.
- 200명 이상의 성인이 짝짓기를 하고 밥에 알을 낳게 하십시오.
- 님프가 나올 수 있도록 오래된 벼 묘목을 보관하십시오. 이 새로운 비독성 님프를 2-instar 단계로 후진시키십시오.
2. 바이러스 획득 및 독성 곤충 수집
- 흡인기 장치를 사용하여 굶주림을 위해 1-2 시간 동안 2-instar nonviruliferous 님프를 유리 배양 튜브 (직경 2.5cm, 높이 15cm)로 조심스럽게 옮깁니다....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
그림 1은 곤충 사육, 바이러스 획득, 벼 먹이를 통한 타액 단백질 수집 및 웨스턴 블롯과 같은 이 프로토콜의 모든 단계를 보여줍니다. 웨스턴 블롯 결과는 Vg에 대한 항체와 함께 배양된 막에서 벼와 곤충의 침샘을 먹이는 샘플에서 약 220kDa의 특정 및 예상 밴드가 관찰되었음을 보여주었습니다. 대조적으로, 비사료 쌀 샘플에서는 밴드가 관찰되지 않았습니다. 그림 2의 결과는 Vg가 타액 단백질로서 식물 숙주에게 방출되었음을 나타낸다. RDV P8에 대한 항체와 함께 배양 된 막에서, 먹이를 먹은 벼의 샘플과 독성 곤충 몸체의 몸체에서도 약 46 kDa의 특이적이고 예상되는 밴드가 관찰되었다. 대조적으로, 그림 3에서 볼 수 있듯이 먹이를 먹지 않는 벼 샘플과 독성이 없는 딱정벌레 몸체에서는 띠가 관찰되지 않았습니다. 이 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
꿰뚫는 곤충의 침샘에서 직접 분비되는 타액은 숙주 조직과 벡터의 왕국 간 생물학적 인자를 숙주로 미리 소화하고 해독하기 때문에 중추적인 역할을 합니다 1,3,4. 유도 인자, 이펙터 및 작은 RNA를 포함한 교차 왕국 생물학적 요인은 곤충-숙주 통신에 중요합니다14,15,16. 따라서 타액 성분의 더 많은 종류와 기능을 밝혀내면 곤충과 숙주 사이의 관계를 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 여기에서, 식물 숙주에서 타액 단백질에 대한 검출 시스템이 제공되었으며, 이는 식물 숙주에서 타액 단백질의 기능에 대한 추가 조사를 가능하게 할 것입니다.
이 프로.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 중국 국립 자연 과학 재단 (31772124 및 31972239)과 복건 농업 임업 대학 (보조금 KSYLX014)의 보조금으로 지원되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5× 트리스-글리신 완충액 및 10× TBS 완충기 준비 |
| 글리신 | 시그마 알드리치 | WXBD0677V | 5× 트리스 글리신 완충액 준비 |
| SDS | 시그마 알드리치 | SLCB4394 | 5× 트리스 글리신 완충기 준비 |
| NaCl | Sinopharm 화학 시약 Co., 주식 회사 | 10019318 | 10 회; TBS 완충기 준비 |
| KCl | Sinopharm 화학 시약 Co., 주식 회사 | 10016318 | 10× TBS 버퍼 준비 |
| ß-메르캅토에탄올 | Xiya 시약 | B14492 | 4× 단백질 샘플 버퍼 준비 |
| bromophenol 블루 | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | 4× 단백질 샘플 버퍼 준비 |
| 글리세롤 | Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd | 10010618 | 4× 단백질 샘플 버퍼 준비 |
| 메탄올 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | 전달 완충액 준비용 |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE& TeCHNoLoGY | CT30111220 | TBST 준비 |
| 용 무 지방 분유 | Becton.Dickinso 및 회사 | 252038 | 멤브레인 차단, 항체 희석 |
| 염소 안티 토끼 IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | 1 차 및 티바디 |
| ECL 웨스턴 키트 | 인식 ThermoFisher Scientific | 32209 | 화학 발광 기질 |
| 니트로 셀룰로오스 membrane | Pall Corporation | 25312915 | 단백질 전달 |
| <강한>완충액 및 용액 | |||
| Buffer | Composition | Comments/Description | |
| 5&타임스; 트리스-글리신 완충액 | 15.1 g 트리스 베이스 94 g 글리신 1L 멸균수에 | 재고 솔루션 | |
| 1× 트리스-글리신 완충액 | 200 mL 5회; Tris-glycine buffer 800 mL 멸균수 | 작업 용액, SDS-PAGE | |
| 10× Tris-buffered saline (TBS) 버퍼 | 80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile | solution | |
| TBS with Tween 20 (TBST) solution | 100 mL 10× TBS 용액 3 mL Tween 20 900 mL 멸균수 | 작업 용액 | |
| 4× 단백질 샘플 버퍼 | 8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL Tris-HCl (pH 6.8) | 단백질 추출용 | |
| Transfer buffer | 800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol | For 단백질 전달 | |
| Instruments | |||
| Bromophenol 파란 | 4x 단백질 표본 완충기 | 시그마 Aldrich | SHBL3668 |
| Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd. | PRX-1200B | 매미용 | |
| 전기영동 | 타논 사이언스 & Technology Co., Ltd. (테크놀로지 주식회사) | Tanon EP300 | SDS-PAGE |
| 전기 영동 전달 코어 모듈 | BIO-RAD | 1703935 | SDS-PAGE |
| 글리세롤 | Sinopharm 화학 시약 (주 | 10010618 4x 단백질 샘플 완충액 준비 | |
| 글리신 | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | 5x Tris-glycine 완충액 준비 |
| 염소 안티 토끼 IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | 1차 안티바디 |
| 고역 통과 조직 연삭 기기 | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | JXFSIPRP-24 | 식물 조직 연삭 용 |
| KCl | Sinopharm 화학 시약 (주 | 10016318 | 10x TBS 완충액 준비 |
| 용 메탄올 | Sinopharm 화학 시약 (주 | 10014118 | 전사 완충액 준비용 |
| 미니 습식 열전달 트로프 | BIO-RAD | 1703930 | SDS-PAGE |
| 용 NaCl | Sinopharm 화학 시약 (주 | )10019318 | 10x TBS 완충액 준비용 |
| 니트로셀룰로오스 멤브레인 | Pall Corporation | 25312915 | 단백질 전달 |
| 무지방 분유 | Becton.Dickinso 및 회사 | 252038 | 멤브레인 차단, 항체 희석용 |
| Pierce ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | 화학발광 기질 |
| 단백질 색소 기기 | GE 헬스케어 생명 과학 AB | Amersham lmager 600 | 단백질 검출용 |
| SDS | 시그마-알드리치 | SLCB4394 | 5x 트리스-글리신 완충액 제제 |
| 트리스 베이스 | 로슈 | D609K69032 | 5x 트리스-글리신 완충액 및 10배; TBS 완충액 제제 |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE& TeCHNoLoGY | CT30111220 | TBST 준비를 위해 |
| 수직 판 전기 이동법 탱크 | BIO-RAD | 1658001 | SDS-PAGE 목욕을 위해 |
| 상해 Jinghong 실험적인 장비 Co., 주식 회사. | XMTD-8222 | 단백질 샘플 종일 | |
| 베타;-메르캅토에탄올 | Xiya 시약 | B14492 | 4x 단백질 샘플 완충액 준비용 |
참고문헌
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Cranston, P. S., Gullan, P. J. Phylogeny of insects. Encyclopedia of Insects. Resh, V. H., Carde, R. T. , Academic. Amste....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
