온칩 결정화 및 실온에서의 대규모 연속 회절

Summary

이 기고는 결정-온-크리스탈 장치에서 단백질 결정화를 설정하는 방법과 온칩 결정화 플랫폼을 사용하여 실온에서 자동화된 직렬 데이터 수집을 수행하는 방법을 설명합니다.

Abstract

생화학 반응과 생물학적 과정은 단백질이 기능적 상태 사이에서 어떻게 전환되는지 보여줌으로써 가장 잘 이해할 수 있습니다. 극저온은 비생리적이며 단백질 구조 역학을 방지, 억제 또는 변경할 수 있으므로 실온에서 일상적인 X선 회절 실험을 위한 강력한 방법이 매우 바람직합니다. 이 프로토콜에 사용되는 크리스탈 온 크리스탈 장치와 함께 제공되는 하드웨어 및 소프트웨어는 샘플 조작 없이 다양한 크기의 단백질 결정에 대해 실온에서 현장 X선 회절을 가능하게 하도록 설계되었습니다. 여기에서는 장치 조립, 온칩 결정화, 광학 스캐닝, 크리스탈 인식에서 X선 샷 계획 및 자동화된 데이터 수집에 이르는 주요 단계에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 플랫폼은 결정 수확이나 다른 샘플 조작이 필요하지 않기 때문에 칩에서 성장한 수백에서 수천 개의 단백질 결정을 프로그래밍 가능하고 처리량이 높은 방식으로 X선 빔에 도입할 수 있습니다.

Introduction

X 선 방사선의 이온화 효과로 인해 단백질 결정학은 지난 30 년 동안 극저온 조건으로 제한되었습니다. 따라서 기능 중 단백질 운동에 대한 현재의 지식은 주로 극저온 조건에서 다른 상태에서 관찰되는 정적 구조 간의 비교에서 비롯됩니다. 그러나 극저온 온도는 단백질 분자가 작동하는 동안 필연적으로 생화학 반응의 진행이나 서로 다른 구조적 상태 간의 상호 전환을 방해합니다. 결정학을 통해 원자 분해능에서 단백질 구조 역학을 직접 관찰하려면 실온에서 회절 실험을 수행하기 위한 강력하고 일상적인 방법이 필요하며, 이를 위해서는 샘플 전달, 데이터 수집 및 사후 데이터 분석의 기술 혁신이 필요합니다. 이를 위해 최근 연속 결정학의 발전은 실온 ^1,2,3에서 중간체 및 수명이 짧은 구조 종의 분자 이미지를 캡처하는 새로운 길을 제공했습니다. 기존의 저온 결정학에서 널리 사용되는 "1 결정 1 데이터 세트"전략과 달리 직렬 결정학은 단일 입자 초저온 전자 현미경과 유사한 데이터 수집 전략을 채택합니다. 특히, 연속 결정학의 실험 데이터는 많은 수의 개별 샘플에서 작은 분획으로 수집 된 다음 데이터 분획을 평가하고 3D 구조 결정을위한 완전....

Protocol

1. 장치 사전 조립

1. 샘플 식별을 위해 외부 링(직경 30mm)에 라벨을 붙입니다. 필요한 경우 프로젝트 이름, 장치 번호, 결정화 조건 및 날짜를 포함합니다(그림 1A). 깨끗한 표면에 외부 링을 거꾸로 놓고(그림 1B) 링 내부에 석영 웨이퍼 하나를 조심스럽게 놓습니다(그림 1C). 이 첫 번째 석영 웨이퍼는 입사 X선의 입구 창 역할을 합니다.
2. 소량의 현미경 침지 오일(점도 150cSt)을 페트리 접시에 붓습니다. 심이 오일에 담그고 심의 양쪽에 기름칠이 제대로 되었는지 확인합니다(그림 1D). 깨끗한 표면에 심을 두드려 여분의 오일을 제거하십시오.
3. 기름칠 된 심을 첫 번째 석영 웨이퍼 위에 놓습니다 (그림 1E).
   알림: 침지 오일은 잠재적인 증기 손실로부터 결정화 챔버를 보호하는 우수한 실란트입니다. 적절하게 조립 된 칩은 일반적으로 눈에 띄는 건조없이 몇 주 동안 지속됩니다. 이 사전 조립 단계는 실내 조명 아래에서 수행됩니다. ....

Results

지난 몇 년 동안 광수용체 단백질 및 효소, 예를 들어 식물 UV-B 광수용체 UVR8, 광 구동 DNA 복구 광분해효소 PhrB¹⁰, 다중 영역 감각 히스티딘 키나아제¹⁴로부터의 새로운 원적외혈 감지 단백질인 광적색 감지 단백질^{과 같은 다양한} 범위의 단백질 샘플로부터의 결정학적 결과 및 과학적 발견과^{함께 몇 가지} 대표적인 데이터 세트가 발표되었습니다. , 리간드/광 이중 센서 도메인 및 박테리오피토크롬¹²의 광감각 코어 모듈. 대표적인 결과로서 이들 단백질의 온칩 결정화 조건을 표 1에 나열하고 증기 확산법에 사용된 조건과 직접 비교한다. 여기에서는 온칩 결정화에 대한 4가지 추가 사례 연구(그림 2)와 영화의 <.......

Discussion

실온에서 수행된 초기 단백질 결정학은 X선 방사선 손상과 싸우는 데 엄청난 어려움을 겪었습니다. 따라서, 싱크로트론 X선 소스가 쉽게 이용 가능해짐에 따라 보다 강력한 저온결정학 방법으로 대체되었다²⁰. X 선 자유 전자 레이저의 출현으로 최근 몇 년 동안 실온 단백질 결정학이 부활했으며 생리 학적 관련 온도 ^2,21에서 단백질 구조 역학을 관찰하려는 욕구에 의해 많은 새로운 개발이 이루어졌습니다. 크리스탈 온 크리스탈 장치를 기반으로 하는 inSituX 플랫폼의 개발은 실온에서 동적 결정학 연구를 위한 일상적이고 강력한 데이터 수집 방법을 확립하려는 동일한 야망에 의해 동기가 부여되었습니다. 이 자동 직렬 X선 회절법은 동결(¹⁴)에 적용할 수 없는 단백질 결정에 대한 정적 구조 결정에도 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 이 플랫폼을.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
분석 소프트웨어	자체 개발
세륨 도핑 이트륨 알루미늄 가넷	MSE 공급		Ce : Y3Al5O12, YAG 단결정 기판
칩 홀더	자체 개발
제어 소프트웨어	자체 개발
침수 오일	Cargille Laboratories	16482	Type A 낮음 점도 150 cSt
inSituX 플랫폼	자체 개발
IR 광원	Thorlabs Incorporated	LED1085L	LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
microscope	Zeiss	SteREO Discovery V8
ring	자체 개발
페트리 접시	Fisher Scietific	FB0875713
피펫	Pipetman	F167380	P10
펌프 레이저	Thorlabs Incorporated	LD785-SE400	785 nm, 400 mW, Ø 9 mm, E 핀 코드, 레이저 다이오드
라즈베리 파이	라즈베리 파이 펀테이션
보유 링	Thorlabs Incorporated	SM1RR	SM1 보유 링 Ø 1" 렌즈 튜브 및 마운트
Seedless quartz crystal	University Wafers, Inc.	U01-W2-L-190514	직경 25.4 mm Z 컷 0.05 mm 두께 양면 연마 8mm 온 -X
심	자체 개발
X 선 빔 스톱	자체 개발