Focused-Ion Beam Scanning Electron Microscopy Data를 사용한 얇은 세포 이하 신경 구조의 3D 재구성 및 분석

Summary

사용자 친화적인 오픈 소스 소프트웨어 패키지를 사용하여 집속 이온 빔 주사 전자 현미경 이미지 볼륨 내에서 얇은 세포 내 뉴런 프로세스를 식별, 시각화 및 정량화하는 유연한 방법론적 파이프라인입니다.

Abstract

최근 주사 전자 현미경 기술의 발전으로 이제 초박형 세포 내 과정의 신속한 3차원(3D) 분석이 가능해졌습니다. 여기에서는 다른 뉴런의 시냅스전 부톤('spinules'라고 함)으로 돌출되는 것과 같은 얇은 뉴런 프로세스를 식별, 시각화 및 분석하기 위한 방법론적 파이프라인을 제시합니다. 이 프로토콜은 무료로 사용할 수 있는 소프트웨어 패키지를 사용하여 집속 이온 빔 주사 전자 현미경(FIB-SEM) 이미지 볼륨 내에서 형태학적 기준을 사용하여 일반적인 신경 세포 하부 구조를 식별하기 위해 의사 결정 트리를 사용하는 방법을 보여주며, 특히 시냅스전 부톤으로 돌출된 다양한 척추를 식별하는 데 중점을 둡니다. 특히, 이 프로토콜은 뉴런 시냅스 내의 척추를 추적하여 이러한 얇은 세포 내 돌기, 부모 신경돌기 및 시냅스후 파트너의 3D 재구성을 생성하는 방법을 설명합니다. 또한 이 프로토콜에는 FIB-SEM 데이터를 분석하기 위해 무료로 사용할 수 있는 오픈 소스 소프트웨어 프로그램 목록이 포함되어 있으며 시각화 및 게시를 위한 3D 재구성을 개선하기 위한 팁(예: 스무딩, 조명)을 제공합니다. 이 적응형 프로토콜은 FIB-SEM 이미지 볼륨 내에서 세포 내 구조의 신속한 나노 단위 분석에 대한 진입점을 제공합니다.

Introduction

나노미터 두께의 세포 내 구성 요소의 구조-기능 관계에 대한 조사는 종종 3D 시각화 및 분석¹의 이점을 얻습니다. 그러나 연속 단면 투과 전자 현미경 연구는 수백에서 수천 개의 ≥40nm 연속 초박형 단면을 절단하고 정렬하기 위해 다이아몬드 나이프를 사용해야 하기 때문에 시간적으로나 공간적으로 제약을 받았습니다. 이러한 제약으로 인해 얇은(직경 <40nm) 세포 내 구조를 샘플링하고 효과적으로 분석할 수 있는 능력이 제한되었으며, 초박형 연속 절편에 능숙해져야 할 필요성으로 인해 3D 구조 분석 ^2,3의 적용이 저해되었습니다. 그러나 최근 집속 이온 빔 주사 전자 현미경(FIB-SEM)의 발전으로 얻을 수 있는 이미지 볼륨의 속도와 해상도에 혁명이 일어났으며 이제 부드러운 소포체^4,5, 신경 시냅스 ^3,6 및 시냅스 소포 ^7,8

Protocol

1. 이미지 볼륨 데이터 및 세포 내 개체 크기: 고려 사항 및 등록

1. 관심 있는 세포 이하 물체를 포함하는 관심 영역의 고품질 FIB-SEM 이미지 볼륨을 얻습니다.
   참고: 이 프로토콜은 청소년기 후반 흰족제비 1차 시각 피질(24.2 x 16.2 x 2.4 μm, 4 nm 등방성 복셀)의 FIB-SEM 이미지 볼륨 세그먼트와 Knott 실험실(https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/)에서 제공하는 성체 쥐 CA1 해마(10.2 x 7.7 x 5.3 μm, 5 nm 등방성 복셀)에서 자유롭게 액세스할 수 있는 FIB-SEM 볼륨을 사용합니다. FIB-SEM 이미징 조건에서 초구조적 세부 사항을 보존하고 높은 대비를 생성하는 프로토콜을 사용하여 FIB-SEM을 위한 조직 블록을 준비하는 것이 중요합니다^23,24. 중요한 것은 결과 FIB-SEM 이미지 복셀 해상도가 관심 있는 가장 작은 세포 내 구조의 직경 크기<0.5×이 되도록 조직을 이미지화해야 한다는 것입니다. 예를 들어, 시냅스전 부톤으로 척추 돌출 부위는 직경이 30nm만큼 작을 수 있기 때문에 <15nm....

Results

Quantifying the percentage of synaptic spinules within the excitatory presynaptic bouton population in ferret primary visual cortex(페럿 1차 시각 피질에서 흥분성 시냅스전 부톤 개체군 내 시냅스 척추의 백분율 정량화)
신경돌기에서 흥분성 시냅스전 부톤으로의 가시돌림(spinule-like protusion)이 수십 년 동안 관찰되어 왔지만,^19,26 시냅스 기능에 대한 잠재적인 중요성은 여전히 불분명합니다. 이러한 실험은 발달 이정표와 관련하여 시냅스 기능에 대한 척추의 잠재적 중요성을 확인하기 위해 페럿 1차 시각 피질(V1)에서 출생 후 발달 전반에 걸쳐 척추를 포함하는 흥분성 시냅스전 부톤의 비율을 결정하기 위해 고안되었습니다. 따라서, 정렬된 4nm/voxel 등방성 FIB-SE.......

Discussion

이 FIB-SEM 이미지 볼륨 분석 파이프라인은 얇은 세포 내 구조에 대한 신뢰할 수 있는 3D 재구성 및 정량적 측정을 생성할 수 있습니다. 심층 신경망(deep neural network) 및 세분화(segmentation) 알고리즘을 사용하는 현재의 반자동 기법은 큰 이미지 볼륨 내에서 상대적으로 높은 막 대비를 갖는 세포 구조를 재구성하는 속도와 효율성을 높일 수 있지만(³³), 많은 세포 내 구조(예: spinules, smooth endoplasmic reticula, endosomes)는 낮은 막 대비 및/또는 비틀림으로 인해 자동화된 방법을 사용하여 안정적으로 캡처하기 어렵습니다. 새로운 방법이 더 높은 대비의 미토콘드리아와 거친 소포체를 포착하기 시작했지만,^34,35. 더욱이, 표지되지 않은 세포 내 구조.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
피지 (ImageJ)			https://imagej.net/software/fiji/downloads
Reconstruct			https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0
Blender	Blender Foundation		https:/www.blender.org