방법 논문

지방 조직에서 중간엽 줄기세포를 얻는 기술 및 장기 냉동 보존에서 기질 혈관 분획 특성 분석

DOI:

10.3791/63036

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2021년 12월 30일

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1Genetics Division, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2TechLife Biotech, São Lucas Cell Therapy Group, 3Division of Plastic Surgery, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)

이 논문에서

요약

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본 프로토콜은 ADSC 단리를 위한 개선된 방법론을 기술하여 문헌에 비해 시간 이득과 함께 엄청난 세포 수율을 초래한다. 이 연구는 또한 장기 동결보존 후 비교적 많은 수의 생존 가능한 세포를 얻기 위한 간단한 방법을 제공합니다.

초록

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지방 조직에서 유래한 인간 중간엽 줄기세포는 적절한 특징을 보여주고 재생 임상 적용을 위한 접근 가능한 공급원이 됨에 따라 점점 더 매력적이 되고 있습니다. 지방 유래 줄기 세포를 얻기 위해 다른 프로토콜이 사용되었습니다. 이 기사에서는 더 많은 양의 ADSC를 얻기 위해 개선된 시간 절약 프로토콜의 여러 단계를 설명하고 배양 확장을 위한 생존 가능한 세포를 얻기 위해 ADSC를 냉동 보존 및 해동하는 방법을 보여줍니다. 26cm 3 구멍 및 3mm 구경 주사기 지방 흡입술을 사용하여 선택적 복부 성형술을받은 9 명의 환자의 복부에서 100 밀리리터의 지방 흡인물을 수집했습니다. 줄기 세포 분리는 칼슘이 보충 된 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (DPBS) 용액과 콜라게나 제를 사용하여 일련의 세척으로 수행되었습니다. 기질 혈관 분획 (SVF) 세포를 냉동 보존하고 면역 표현형으로 생존력을 확인했습니다. SVF 세포 수율은 15.7 x 105 세포 / mL, 6.1-26.2 세포 / mL 범위였습니다. 부착 SVF 세포는 평균 7.5 (±4.5) 일 후에 합류에 도달했으며 평균 세포 수율은 12.3 (± 5.7) x 105 세포 / mL입니다. 8 개월, 1 년 및 2 년 후 해동 된 SVF의 생존력은 23.06 % -72.34 % 사이였으며 평균 47.7 % (±24.64)로 2 년 동결 사례와 관련하여 가장 낮은 생존력을 보였다. 칼슘이 보충 된 DPBS 용액과 콜라게나제 소화 시간이 짧은 지방 침전을위한 가방 휴식 시간을 사용하면 줄기 세포의 최종 세포 수율이 증가했습니다. 생존 가능한 줄기 세포의 높은 수율을 얻기위한 상세한 절차는 이전 연구의 기술보다 시간과 세포 수율과 관련하여 더 효율적이었습니다. 장기간의 동결 보존 후에도 SVF에서 생존 가능한 ADSC 세포가 발견되었습니다.

서론

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인간 중간엽 줄기세포는 기초 및 응용 연구 모두에서 유리합니다. 이 성체 세포 유형의 사용은 배아 또는 다른 세포의 사용과 비교하여 윤리적 문제를 능가하며, 신생물 영역, 퇴행성 질환 치료 및 재건 수술 영역의 치료 응용 분야와 같은자가 조직 재생 공학 및 세포 치료1에서 가장 유망한 연구 분야중 하나입니다 2,3,4, 5. 지방 조직의 기질 혈관 세포 분획에 중간엽 다능성 및 만능 줄기 세포의 풍부한 공급원이 있다고 이전에 보고되었습니다 6,7. 이러한 ADSC는 최소 침습적 절차5,8에서 높은 수율로 생체 외 확장 능력을 가진 상당한 수의 세포를 쉽게 얻을 수 있기 때문에 세포 치료 및 이식/주입에 사용하기에 훌륭한 후보로 간주됩니다.

또한 지방 ....

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프로토콜

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본 연구는 UNIFESP 윤리위원회 (프로토콜 번호 : 0029/2015 CAAE : 40846215.0.0000.5505)의 승인을 받았으며, 헬싱키 선언 (2004)에 따라 환자로부터 서면 동의를받은 후 수행되었습니다. 본 연구의 샘플은 33-50 세 (평균 연령 41.5)이고 평균 초기 체질량 지수 (BMI)가 24.54 (22.32-26.77 사이) (표 1)의 9 명의 여성 환자로 구성되어 있으며, 상파울루 연방 대학교 (UNIFESP)의 성형 외과 부서에서 임신 후 피부 과잉으로 미적 복부 성형술을받은 사람, 브라질. 비뚤림을 줄이기 위해 환자는 성별, 연령 및 BMI를 고려한 동종 그룹으로 선택되었습니다. 이 연구 중에 사용 및/또는 분석된 데이터 세트는 합리적인 요청에 따라 교신 저자로부터 구할 수 있습니다.

1. 지방 흡인물 수집

참고: 이 단계는 수술 센터에서 수행해야 합니다.

  1. 피부 준비 및 무균을 위해 4 % 클로르헥시딘 글루코 네이트 ( 재료 표 참조)를 사용하십시오.
    1. 2mm 피하 피부 절개 (진피하와 동맥 경화증 사이)를 수행하십시오. 26mm 3G....

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결과

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나이, 체중, 키 및 BMI를 포함하여 연구 된 9 명의 개인의 특성은 표 1에 나와 있습니다.

초기에 제시된 세포 수율에 따라, 배양물에 접종된 세포 부피는 75cm2 배양 플라스크의 용량에 가능한 한 근접한 것으로 계산되었다. 각 경우에 시딩된 샘플 부피는 표 2에 설명되어 있습니다. 그런 다음 초기 세포 수율에 따라 각 샘플에 대한 다양한 세포 부피를 결정했습니다 : 세포 수율이 높은 샘플의 경우 1mL, 중간 세포 수율을 갖는 샘플의 경우 1.1mL, 세포 수율이 낮은 샘플의 경우 2mL를 사용하여 사례간에 더 유사한 세포 파종을 수행합니다. 배양이 약 80%-90% 합류에 도달했을 때(도 2A)(약 7.5 ± 4.5일), 부착성 세포의 트립신화를 수행하였다(표 2 및 도 2B).

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토론

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절연 수율
세포 치료에 자주 요구되는 동결 보존 과정은 때로는 50 % 이상의 상당한 세포 손실을 초래한다는 것이 잘 알려져 있습니다.29,30,35. 따라서, 고립 된 상태에서 높은 초기 세포 수율을 얻기위한 기술적 개선이 기본이다. 지방 흡인물의 수집 방법과 세포의 분리 방법은 세포의 장기 배양 및 조작을 고려하면서 더 많은 수의 세포를 보존하고 높은 생존력을 유지하며 초기 물질에서 최대 세포 수를 추출하는 데 중점을 두어야합니다. 따라서 세포 요법이 환자에게 효과적이고 안전할 가능성이 높기 때문에 세포를 세포자멸사, 노화 또는 유전적 불안정성으로부터 멀리하기 위해 직선 배양 유지가 필요합니다.

우리가 아는 한, 지방 흡인물에서 유래 한 중간 엽 줄기 세포의 분리를 위해이 단.......

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

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참여에 자원한 환자들과 상파울루 병원의 의료 및 간호 직원들에게 감사드립니다. 이 연구는 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)와 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.8mL cryovialsNunc Thermo Fisher Scientific340711
150mL 폴리염화비닐 전사 백JP FARMA80146150059
2% Alizarin Red S 용액, pH 4.2Sigma AldrichA5533
아드레날린(1mg/mL)HipolaborNA
Alcian Blue 용액Sigma Aldrich1,01,647
항생제 - 항진균제 100xGibco15240062
BD FACSBD CellQues Pro 분석을 사용한 칼리버 유세포 분석기BD BioSciencesNA
염화칼슘 10 %Merck102379
Chlorhexidine gluconate 4% VIC PHARMANA
Collagenase, Type I, 분말Gibco17018029
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)11966025
DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)DPBS A1285801
(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)GibcoA1285601
Fetal bovine serumGibco10500056
포름알데히드 4%Sigma Aldrich1,00,496
도립광 현미경Nikon Eclipse TS100NA
라이브 및 데드 셀 분석Thermofisher01-3333-41 |01-3333-42
단클론 항체: CD105BD BioSciences745927
단클론 항체: CD11BBD BioSciences746004
단클론 항체: CD19BD BioSciences745907
Monoclonal 항체: CD34BD BioSciences747822
Monoclonal 항체: CD45DAKOM0701
Monoclonal 항체: CD73BD BioSciences746000
Monoclonal 항체: CD90BD BioSciences553011
Monoclonal 항체: HLA-DRBD BioSciences340827
Mr. Frosty 냉동 용기Thermo Fisher Scientific5100-0001
PBS (인산염 완충 식염수) 1x pH 7.4Gibco 
StemPro 지방형성 분화 키트GibcoA1007001
StemPro 연골형성 분화 키트GibcoA1007101
StemPro 골형성 분화 키트GibcoA1007201
바늘 주입 부위가 있는 하나의 스파이크가 있는 멸균 커넥터Origen Biomedical Connector, USANA코드 마크: IBS
트리판 블루 용액 0.4%시그마 알드리치93595
트립신-EDTA 0.25% 1x, 페놀 레드Gibco25200056
칼슘, 마그네슘 없음칼슘이 함유된 Gibco10010023

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose tissue-derived stem cells in regenerative medicine. Transfusion Medicina and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
  2. Alperovich, M., et al. Adipose stem cell therapy in cancer reconstruction: a....

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재인쇄 및 허가

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