진핵 글리코겐 대사 연구를위한 분광 광도법

요약

글리코겐 대사의 주요 효소의 활성을 측정하는 기술은 가시 범위에서 작동하는 간단한 분광 광도계를 사용하여 제시됩니다.

초록

글리코겐은 박테리아에서 동물에 이르기까지 다양한 유기체에 의해 포도당의 저장 형태로 합성됩니다. 분자는 α1,6- 결합의 추가를 통해 도입 된 가지를 갖는 α1,4- 연결된 포도당 잔기의 선형 사슬로 구성됩니다. 글리코겐의 합성 및 분해가 어떻게 조절되고 글리코겐이 특징적인 분지 구조를 얻는 방법을 이해하려면 글리코겐 저장 효소에 대한 연구가 필요합니다. 그러나 이러한 효소 활성을 연구하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법은 일반적으로 모든 연구자가 사용할 수 없는 시약 또는 기술을 사용합니다. 여기에서는 기술적으로 간단하고 비용 효율적이면서도 글리코겐 저장 제어에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있는 일련의 절차에 대해 논의합니다. 이 기술은 330에서 800 nm 범위에서 작동하는 분광 광도계에 대한 액세스가 필요하며 사용자가 일회용 플라스틱 큐벳을 사용한다고 가정하여 설명됩니다. 그러나 절차는 쉽게 확장 가능하며 마이크로 플레이트 리더에서 사용하도록 수정할 수 있으므로 고도의 병렬 분석이 가능합니다.

서론

글리코겐은 자연에 널리 분포되어 있으며 화합물은 박테리아, 많은 원생 생물, 곰팡이 및 동물에서 발견됩니다. 미생물에서 글리코겐은 영양소가 제한적일 때 세포 생존에 중요하며 포유류와 같은 고등 유기체에서는 글리코겐의 합성 및 분해가 혈당 수치를 완충하는 역할을합니다 ^1,2,3. 따라서 글리코겐 대사에 대한 연구는 미생물학 및 포유류 생리학과 같은 다양한 분야에서 중요합니다. 글리코겐 대사를 이해하려면 글리코겐 합성(글리코겐 합성효소 및 분지 효소)과 글리코겐 분해(글리코겐 인산화 효소 및 탈분지 효소)의 핵심 효소를 연구해야 합니다. 글리코겐 합성 효소, 인산화 효소, 분지 효소 및 분지 효소 활성의 황금 표준 분석은 방사성 동위 원소를 사용합니다. 예를 들어, 글리코겐 합성 효소는 일반적으로 UDP- [14 C] 포도당 (동물 및 곰팡이 효소의 경우) 또는 ADP- [¹⁴C] 포도당 (박테리아 효소의 경우)의 포도당을 글리코겐 ^4,5로 통합 한 후 중단 된 방사 화학 분석에서 측정됩니다. 유사하게, 글리코겐 인산화 효소는 [¹⁴C] 포도당 -1- 인산에서 글리코겐⁶으로 포도당을 통합 한 후 글리코겐 합성 방향으로 측정됩니다. 분지 효소는 글리코겐 인산화 효소⁷에 의해 포도당 -1- 인산에서 α1,4- 연결된 사슬로 [14C] 포도당의 혼입을 자극하는이 효소의 능력을 측정하여 분석되며, 탈 분지 효소 활성은 [^14C] 포도당을 글리코겐⁸에 통합하는 효소의 능력에 따라 결정됩니다. . 방사성 기질은 매우 민감하여 효소 활성이 낮은 조세포 추출물에 사용할 수 있지만 고가이며 방사성 동위 원소 사용에 수반되는 규제 요구 사항이 적용됩니다. 이러한 장벽으로 인해 특정 분석법을 사용하는 것이 많은 작업자의 손이 닿지 않는 곳에 있습니다. 그러나, 수년에 걸쳐, 이들 효소의 측정에 대한 인상적인 다양한 분광 광도계 접근법이 기술되었다. 일반적으로 이러한 접근법은 궁극적으로 NADH / NADPH의 생산 또는 소비 또는 글리코겐과 요오드 사이의 착색 된 복합체 생성을 측정하는 데 의존합니다. 따라서 간단하며 텅스텐 또는 크세논 플래시 램프 만 장착 된 간단한 분광 광도계를 사용하여 수행 할 수 있습니다.

글리코겐 합성 효소의 분광 광도계 분석은 포도당이 성장하는 글리코겐 사슬 ^9,10에 첨가됨에 따라 당 뉴클레오티드 공여체로부터 방출되는 뉴 클레오 시드 디 포스페이트를 측정하는 것에 의존합니다. 아래 프로토콜의 섹션 1에 설명된 글리코겐 합성효소 활성을 측정하는 절차는 Wayllace et ^al.11에 의해 요약된 것을 수정한 것이며 결합 계획은 다음과 같습니다.

(포도당) n + UPD- 포도당 → (포도당) _n + _{1 +} UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + 포스포에놀피루브산→ 피루브산 + ATP

피루 베이트 + NADH + H + → 젖산 + NAD ⁺

글리코겐 합성 효소는 UDP- 포도당의 포도당을 글리코겐에 추가합니다. 이 과정에서 생성 된 UDP는 ADP를 생성하는 반응에서 뉴 클레오 시드 디 포스페이트 키나아제 (NDP 키나아제)에 의해 UTP로 전환됩니다. ADP는 차례로 포스포에놀피루베이트를 인산염 공여체로 사용하여 ADP를 인산화하는 피루브산 키나아제의 기질 역할을 합니다. 생성 된 피루 베이트는 NADH를 소비하는 반응에서 효소 락 테이트 탈수소 효소에 의해 락 테이트로 전환됩니다. 따라서 분석은 NADH가 소비됨에 따라 340nm에서 흡광도 감소를 모니터링하면서 연속적인 방식으로 수행될 수 있습니다. 포도당 공여체로서 ADP- 포도당을 필요로하는 효소와 함께 사용하기에 쉽게 적응할 수 있습니다. 여기서, 글리코겐 합성 효소의 작용에 의해 방출 된 ADP가 피루 베이트 키나아제에 의해 직접 작용하기 때문에 결합 단계가 더 간단하다.

글리코겐 인산화 효소 활성의 측정에 사용할 수있는 다양한 분광 광도계 분석이 있습니다. 고전 버전에서 효소는 아래와 같이 글리코겐 합성 방향으로 뒤로 구동됩니다.

(포도당) n + 포도당 -1- 인산염 → (포도당) _n + _{1 + 피}

시간 간격에서, 반응 혼합물의 분취량이 제거되고, 유리된 인산염의 양이 정량화된다(^12,13). 우리의 손에서이 분석은 포스 포릴 라제 작용에 필요한 고농도의 글루코스 -1- 포스페이트와 결합 된 글루코스 -1- 포스페이트의 많은 상업적 제제에서 쉽게 측정 할 수있는 유리 포스페이트의 존재로 인해 제한적으로 사용되었습니다. 오히려, 우리는 글리코겐이 포스포릴라제¹³에 의해 분해됨에 따라 방출되는 포도당-1-인산을 측정하는 대체 분석을 일상적으로 사용했습니다. 아래에 예시된 결합 반응 반응이 사용된다.

(포도당) n + P_i → (포도당) _n-1 + 포도당 -_1- 인산염

포도당 -1- 인산 → 포도당 -6- 인산

포도당 -6- 인산 + NADP + → 6- 포스 포 글루코노 락톤 + NADPH + H ⁺

포도당 -1- 인산은 포스 포 글루코 뮤 타제에 의해 포도당 -6- 인산으로 전환되고, 포도당 -6- 인산은 6- 포스 포 글루코노 락톤으로 산화되어 NADP ⁺가 NADPH로 환원됩니다. 아래 프로토콜의 섹션 2에 자세히 설명된 절차는 Mendicino et al.14 및 Schreiber & Bowling ¹⁵에 설명된 방법에서 파생됩니다. 분석은 시간이 지남에 따라 340nm에서 흡광도가 증가하여 연속적인 방식으로 쉽게 수행할 수 있어 반응 속도를 결정할 수 있습니다.

탈분지형 효소 활성의 분광광도 측정은 인산화 효소 한계 덱스트린¹⁶에 대한 효소의 작용에 의해 방출되는 포도당의 측정에 의존한다. 이 화합물은 글리코겐을 글리코겐 인산화 효소로 철저히 처리하여 만들어집니다. 글리코겐 인산화 효소 작용은 α4 분기점에서 떨어진 1,6 개의 포도당 잔기를 멈추기 때문에 한계 덱스트린에는 글리코겐이 포함되어 있으며 그 외부 사슬은 ~ 4 개의 포도당 잔기로 단축되었습니다. 포스포릴라제 리미트 덱스트린의 제조는 Taylor et al.17 및 Makino & Omichi ¹⁸에 의해 개발된 것으로부터 유도된 절차를 사용하여 본원에 기재되어 있다.

디브랜칭은 2단계 프로세스입니다. 이관능성 탈분지 효소의 4-α-글루카노트랜스퍼라제 활성은 먼저 분기점에서 근처의 α1,4-연결된 포도당 사슬의 비환원 말단으로 3개의 포도당 잔기를 전달합니다. 분기점에 남아있는 단일, α1,6-연결된 글루코스 잔기는 이어서 α1,6-글루코시다제 활성(¹⁹)에 의해 가수분해된다. 분석은 전형적으로 중지된 방식으로 수행되며, 주어진 시간(또는 일련의 시간) 후에 방출된 포도당은 아래와 같이 결합된 효소 분석에서 측정된다:

(포도당) n → (포도당) _n-1 + 포도당

포도당 + ATP → 포도당 -6- 인산 + ADP

포도당 -6- 인산 + NADP + → 6- 포스 포 글루코노 락톤 + NADPH + H ⁺

생성 된 NADPH의 측정은 포도당 생산의 척도를 제공합니다. 아래 프로토콜의 섹션 3에 설명된 절차는 Nelson et ^al.16에 의해 설명된 절차를 기반으로 합니다. NADH / NADPH의 소비 또는 생성에 의존하는 다른 방법과 마찬가지로 분석은 매우 민감합니다. 그러나, 아밀라아제 또는 다른 글루코시다아제의 존재는 또한 포스포릴라제 한계 덱스트린으로부터 유리 글루코스를 유리시킬 수 있으며, 이는 상당한 간섭을 일으킬 것이다(토론 참조).

분지 효소 활성의 비색 측정은 포도당의 α1,4- 연결된 사슬이 요오드에 결합하여 착색 된 복합체²⁰을 형성하는 나선형 구조를 채택한다는 사실에 의존한다. 형성된 복합체의 색상은 α1,4- 연결된 사슬의 길이에 따라 다릅니다. 따라서, α1,4- 연결된 포도당의 길고 분지되지 않은 사슬로 구성된 아밀로스는 요오드와 진한 파란색 복합체를 형성합니다. 대조적으로, 외부 사슬이 일반적으로 6 내지 8 개의 포도당 잔기 길이의 순서 인 글리코겐은 오렌지-레드 복합체를 형성한다. 아밀로오스 용액을 분지 효소와 함께 배양하면 아밀로오스에 가지를 도입하면 α1,4- 연결된 포도당 사슬이 더 짧아집니다. 따라서 아밀로스 / 요오드 복합체의 흡수 최대치는 더 짧은 파장으로 이동합니다. 여기에서 논의 된 절차는 Boyer & Preiss²¹ 에 의해 자세히 설명 된 것에서 파생되며 분지 효소 활성은 시간 경과에 따라 660nm에서 아밀로스 / 요오드 복합체의 흡수 감소로 정량화됩니다.

위의 논의에서 쉽게 알 수 있듯이 요오드와 α1,4- 포도당 사슬 사이에 형성된 복합체의 색상이 사슬 길이에 따라 달라진다는 사실은 글리코겐 / 요오드 복합체의 흡광도 스펙트럼이 글리코겐 분지 정도에 따라 달라야한다는 것을 의미합니다. 이것은 실제로 사실이며, 더 긴 외부 사슬을 가진 덜 분지형된 글리코겐/글리코겐은 더 분지되거나 더 짧은 외부 사슬을 가진 글리코겐보다 더 긴 파장에서 빛을 흡수합니다. 따라서 요오드 염색 반응은 글리코겐 분지 정도에 대한 신속하고 정성적 데이터를 얻는 데 사용될 수 있습니다(²²). 오렌지 브라운은 요오드와 글리코겐 복합체가 특별히 강하지 않을 때 형성됩니다. 그러나, 발색은 포화 염화칼슘 용액(²²)의 포함에 의해 향상될 수 있다. 이것은 방법의 감도를 약 10 배 향상시키고 글리코겐의 마이크로 그램 양을 즉시 분석 할 수있게합니다. 아래 프로토콜의 섹션 4에 설명된 분기 결정을 위한 분석은 Krisman²²에 의해 개발된 절차에서 채택됩니다. 글리코겐 샘플을 요오드 용액 및 염화칼슘과 큐벳에 결합하고 330nm에서 800nm까지의 흡수 스펙트럼을 수집하여 간단히 수행됩니다. 흡광도 최대값은 분기 정도가 감소함에 따라 더 긴 파장으로 이동합니다.

종합적으로, 여기에 설명 된 방법은 글리코겐 대사의 주요 효소의 활성을 평가하고 글리코겐 분기 정도에 대한 질적 데이터를 얻기위한 간단하고 신뢰할 수있는 수단을 제공합니다.

프로토콜

1. 글리코겐 합성 효소 활성의 결정

1. 표 1에 표시된대로 필요한 시약의 저장 용액을 준비하십시오 (실험 일 이전).

구성 요소	방향
50 mM 트리스 pH 8.0	0.61 g의 트리스 염기를 ~ 80 mL의 물에 녹입니다.  4 ° C로 식히십시오.   HCl로 pH를 8.0으로 조정하고 물로 부피를 최대 100mL로 만듭니다.
20 mM 헤페스 버퍼	0.477g의 헤페스를 ~ 80mL의 물에 녹입니다.  NaOH로 pH를 7.0으로 조정하고 물로 부피를 100mL로 구성합니다.
132 mM 트리스/32 mM KCl 버퍼 pH 7.8	1.94g의 트리스 염기와 0.239g의 KCl을 ~90mL의 물에 녹입니다.  HCl로 pH를 7.8로 조정하고 물로 부피를 100mL로 구성합니다.
0.8% w/v 굴 글리코겐	굴 글리코겐 80mg의 무게를 측정하고 물에 첨가하십시오.  최종 부피를 물로 최대 10mL까지 만들고 부드럽게 데우거나 혼합하여 글리코겐을 완전히 용해시킵니다.
100 mM UDP- 포도당	0.31g의 UDP- 포도당을 물에 녹이고 최종 부피를 1mL까지 만듭니다.  분취량에 보관하고 -20 °C에서 냉동합니다.   몇 달 동안 안정적입니다.
50 mM ATP	0.414g의 ATP를 ~ 13mL의 물에 녹입니다.  NaOH로 pH를 7.5로 조정하고 물로 부피를 15mL로 구성합니다.  -20 ° C에서 냉동 된 부분 표본에 보관하십시오.   몇 달 동안 안정적입니다.
100 mM 글루코스-6-포스페이트 pH 7.8	0.282g의 포도당-6-인산을 ~7-8mL의 물에 녹입니다.  NaOH로 pH를 7.8로 조정하십시오.  물로 최대 10mL까지 부피를 만드십시오.  -20 ° C에서 분취량으로 냉동 보관하십시오.   최소 6 개월 동안 안정적입니다.
40 mM 포스포에놀피루베이트	4mg의 포스포에놀피루베이트를 20mM HEPES 완충액 pH 7.0의 0.5mL에 녹입니다.  -20 °C에서 보관하십시오.   최소 1 주일 동안 안정적입니다.
0.5 MMnCl2	9.90 g의 MnCl2를 100 mL의 최종 부피의 물에 용해시킨다.
NDP 키나아제	동결건조된 분말을 충분한 물로 재구성하여 1U/μl 용액을 제공합니다.  분취액을 준비하고 액체 질소에서 동결하고 -80 °C에서 보관하십시오.   최소 1 년 동안 안정적입니다.

표 1: 글리코겐 합성효소 활성의 분석에 필요한 스톡 용액.

2. 분석 당일에, 4.5 mg의 NADH를 50 mM Tris-HCl, pH 8.0의 1.5 mL에 용해시킴으로써 4 mM NADH의 새로운 작업 용액을 제조한다. 빛으로부터 보호되는 얼음 위에 보관하십시오.
3. UDP- 포도당, ATP, 포스 포에 놀 피루 베이트 및 NDP 키나아제의 저장 용액을 얼음에서 해동합니다.
4. 수조를 30°C로 예열한다.
5. 표 2에 나열된 반응 혼합물 시약을 추가하여 1.5mL 튜브에 각 글리코겐 합성효소 분석을 설정합니다.

구성 요소	부피 (μl)
160 mM 트리스/32 mM KCl 버퍼 pH 7.8	250
물	179
100 mM 글루코스 -6- 포스페이트, pH 7.8	58
0.8 % w/v 굴 글리코겐	67
50 mM ATP	80
4 mM 나드	80
100 mM UDP- 포도당	28
40 mM 포스포에놀피루베이트	20
0.5 MMnCl2	8
최종 볼륨	770

표 2: 글리코겐 합성효소 활성의 분석을 위한 반응 혼합물 조성.

참고: 설정을 용이하게 하기 위해 계획된 분석 수를 완료하기에 위에 나열된 각 시약을 충분히 포함하는 마스터 믹스를 만들 수 있습니다.

6. 상기 혼합물의 NADH가 물로 대체되는 빈 반응을 준비한다. 일회용 메타크릴레이트 큐벳으로 옮기고 이를 사용하여 분광 광도계의 영점을 340nm로 설정합니다.
7. 1.5 mL 튜브에 반응 혼합물의 분취량 770 μL를 취한다. 2μL의 NDP 키나아제 및 2μL의 피루브산 키나아제/젖산 탈수소효소 혼합물을 첨가하고, 부드럽게 혼합하고, 30°C에서 3분 동안 배양하여 반응 혼합물을 예열합니다.
8. 글리코겐 합성 효소를 함유하는 샘플 30 μL를 20 mM 트리스 완충액, pH 7.8에 첨가하고; 혼합하고, 반응 혼합물을 일회용 메타크릴레이트 큐벳으로 옮긴다.
9. 큐벳을 분광 광도계에 넣고 340nm에서 10-20 분 동안 시간 간격으로 흡광도를 기록합니다. 시간에 대해 얻은 흡광도를 플로팅합니다.
   참고: 글리코겐 합성효소 샘플을 20mM 트리스 완충액으로 대체하는 반응은 NADH의 비효소적 산화를 제어하기 위해 수행되어야 합니다. 샘플의 순도에 따라 다른 제어 반응이 필요할 수 있습니다. 자세한 내용은 토론을 참조하십시오.
10. 반응 속도를 결정합니다(자세한 내용은 결과 참조).

2. 글리코겐 인산화 효소 활성의 결정

1. 표 3에 표시된대로 저장 용액을 준비하십시오 (실험일 이전).

구성 요소	방향
125 mM 파이프 pH 6.8	3.78g의 파이프를 물에 녹입니다.  NaOH로 pH를 6.8로 조정하고 물로 부피를 100mL로 구성합니다.
굴 글리코겐 8%	굴 글리코겐 0.8g을 계량하여 물에 첨가하십시오.  최종 부피를 물로 최대 10mL까지 만들고 부드럽게 데우거나 혼합하여 글리코겐을 녹입니다.  -20 °C에서 냉동 보관하십시오.
200 mM 인산 Na pH 6.8	2.63 g의 Na2HPO4.7H2O 및 1.41 g의NaH2PO4를 용해시킨다. 물 속의 H2O.  물과 함께 최대 100mL까지 가져옵니다.
1 mM 포도당-1,6-비스포스페이트	2mg의 포도당-1,6-비스포스페이트를 4mL의 물에 녹입니다.  분취량을 -20°C에서 냉동 보관한다.   적어도 몇 달 동안 안정적입니다.
10 mM NADP	23mg의 NADP를 3mL의 물에 녹입니다.  분취량을 -20°C에서 냉동 보관한다.   적어도 몇 달 동안 안정적입니다.

표 3: 글리코겐 인산화 효소 활성의 분석에 필요한 스톡 용액.

2. 수조를 30°C로 예열
3. 아래 나열된 반응 혼합물 시약을 추가하여 1.5mL 튜브에 각 글리코겐 인산화효소 분석을 설정합니다(표 4).

구성 요소	부피 (μl)
125 mM 파이프 버퍼 pH 6.8	160
물	70
굴 글리코겐 8%	100
200 mM 인산 Na 6.8	400
1 mM 포도당-1,6-비스포스페이트	20
10 mM NADP	20
최종 볼륨	770

표 4: 글리코겐 포스포릴라제 활성의 분석을 위한 반응 혼합물 조성.

참고: 설정을 용이하게 하기 위해 계획된 분석 수를 완료하기에 위에 나열된 각 시약을 충분히 포함하는 마스터 믹스를 만들 수 있습니다.

5. 표 4에 열거된 성분을 함유하는 블랭크 반응을 준비하되 30 μL의 25 mM PIPES 완충액, pH 6.8 (125 mM PIPES 완충제 1/5를 물로 희석하여 제조됨)을 추가로 첨가한다. 일회용 메타크릴레이트 큐벳으로 옮기고 분광 광도계의 영점을 340nm로 설정하는 데 사용합니다.
6. 1.5mL 튜브에 반응 혼합물 770μL 분취량 1개를 취합니다. 1μL의 포도당-6-포스페이트 탈수소효소와 1μL의 포스포글루코뮤타제를 첨가하고 부드럽게 혼합한 다음 30°C에서 3분 동안 배양하여 반응 혼합물을 예열합니다.
7. 글리코겐 인산화 효소를 함유하는 샘플 30μL를 25mM PIPES 완충액, pH 6.8에 첨가한다. 반응 혼합물을 혼합하고 일회용 메타크릴레이트 큐벳으로 옮깁니다.
8. 큐벳을 분광 광도계에 넣고 340nm에서 10-20 분 동안 시간 간격으로 흡광도를 기록합니다. 시간에 대해 얻은 흡광도를 플로팅합니다.
   참고: 글리코겐 인산화 효소가 25mM PIPES 완충액으로 대체되는 반응이 포함되어야합니다. 글리코겐 인산화 효소 샘플의 순도에 따라 다른 대조군이 필요할 수도 있습니다 (자세한 내용은 토론 참조).
9. 반응 속도를 결정합니다(자세한 내용은 대표 결과 참조).

3. 글리코겐 탈분지 효소 활성의 결정

1. 표 5에 표시된대로 저장 용액을 준비하십시오 (실험일 이전).

구성 요소	방향
100mM 말레에이트 완충액	1.61g의 말레산을 ~80mL의 물에 녹입니다.  NaOH로 pH를 6.6으로 조정하고 물로 최종 부피를 최대 100mL로 만듭니다.
300 mM 트리에탄올아민 염산염/3 mM MgSO4 pH 7.5	27.85 g의 트리에탄올아민 염산염 및 0.370 g의MgSO4를 용해시킨다. ~ 400 mL의 물에 7H2O.  NaOH로 pH를 7.5로 조정하고 물로 최종 부피 500mL까지 만듭니다.
150 mM ATP / 12 mM NADP	1.24g의 ATP를 ~ 10mL의 물에 녹입니다.  pH를 모니터링하고 NaOH를 첨가하여 ATP가 용해됨에 따라 ~ 7.5의 pH를 유지합니다.  0.138g의 NADP를 첨가하십시오.  NaOH로 pH를 ~ 7.5로 조정하고 물로 최종 부피 15mL까지 만듭니다. – 20 °C에서 분취량에 보관하십시오. 몇 달 동안 안정적입니다.
50 mM Na 인산염 완충액 pH 6.8	32.81 g의 Na2HPO4.7H2O 및 17.61 g의NaH2PO4를 용해시킨다. 물 속의 H2O.  물을 사용하여 부피를 최종 부피 5L까지 가져옵니다.

표 5: 글리코겐 탈분지 효소 활성의 분석에 필요한 스톡 용액.

2. 포스포릴라아제 한계 덱스트린 준비
   1. 굴 글리코겐 0.3g을 50mM 인산나트륨 완충액 10mL(pH 6.8)에 녹입니다.
   2. 충분한 동결건조된 인산화효소 A 분말을 용해시켜 50mM 포스페이트 완충액, pH 6.8에 60U의 활성을 수득한다.
      참고: 구입한 인산화효소 A의 로트에 따라 필요한 질량은 다양하지만 일반적으로 분말 5mg에서 10mg 사이입니다.
3. 60U의 인산화 효소 A를 글리코겐 용액에 첨가하고 투석 백으로 옮깁니다. 실온에서 50mM 인산나트륨 완충액 1L, pH 6.8에 대해 8시간 동안 투석합니다. 새로운 투석 완충액으로 변경하고 밤새 배양을 계속합니다.
4. 10U의 인산화 효소 A를 더 추가하고 새로운 투석 완충액으로 변경하십시오. 8시간 후, 다시 새로운 투석 완충액으로 변화시키고 밤새 배양을 계속한다.
5. 투석 백의 내용물을 원심 분리 튜브로 옮기고 10 분 동안 끓입니다. 얼음 위에서 식힌 다음 10,000 x g 에서 15분 동안 원심분리합니다.
6. 상청액을 투석 백으로 옮기고 2L의 증류수를 세 번 교체하는 것에 대해 8시간 동안 투석합니다.
7. 투석 백의 내용물을 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 부피를 측정하고 얼음처럼 차가운 무수 에탄올 2 부피를 첨가하여 한계 덱스트린을 침전시킵니다. 튜브를 얼음 위에 30분 동안 그대로 두십시오.
   알림: 에탄올을 첨가하는 즉시 백색 침전물이 형성되기 시작해야하지만, 그렇지 않은 경우 3M NaCl 한 방울을 첨가하십시오.
8. 15,000 x g 에서 15분 동안 원심분리하고 상청액을 버립니다. 각 헹굼에 대해 ~ 30mL를 사용하여 66 % v / v 에탄올로 한계 덱스트린의 흰색 펠릿을 두 번 헹굽니다.
9. 한계 덱스트린을 박격포로 옮기고 완전히 자연 건조시킵니다. 한계 덱스트린이 건조되면 유봉으로 분말로 갈아서 보관을 위해 적절한 용기로 옮깁니다. 4 °C에서 건조.
10. 탈분지 효소 기질로 사용하기 위해, 물에 1% w/v 용액을 준비하십시오.
11. 수조를 30°C로 예열한다.
12. 가열 블록 또는 수조를 95°C로 예열합니다.
13. 각각 100μL의 말레에이트 완충액, 80μL의 포스포릴라제 한계 덱스트린 및 10μL의 물을 포함하는 4개의 1.5mL 튜브를 준비합니다. 이 튜브는 탈분지 효소 분석을 수행하는 데 사용됩니다. 반응 튜브 중 두 개와 다른 두 개의 튜브 제어에 레이블을 지정합니다.
14. 시간 간격으로, 10 μL의 분지형 효소 샘플을 반응 튜브에 첨가하고 10 μL의 완충액을 첨가하여 분지형 효소 샘플을 대조 튜브에 준비시켰다. 30°C에서 배양한다.
15. 정의된 시점(예: 5분, 10분 및 20분 배양)에 각 반응 및 제어 튜브에서 50μL를 빼내고 즉시 95°C의 가열 블록 또는 수조에 넣습니다. 3 분 동안 가열하십시오.
16. 침전된 단백질을 제거하기 위해 15,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다.
    참고: 이 시점에서 필요한 경우 절차를 중지할 수 있습니다. 가열된 샘플은 방출된 글루코스의 측정을 진행할 때까지 -20°C에서 동결 저장될 수 있다(단계 17, 하기).
17. 방출 된 포도당의 측정
    1. 가열된 샘플에서 상청액 40μL를 일회용 메타크릴레이트 큐벳으로 옮기고 트리에탄올아민 염산염/황산마그네슘 완충액 833μL, NADP/ATP 혼합물 67μL 및 물 60μL를 추가합니다. 기포가 유입되지 않도록 주의하면서 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
       참고: 설정을 용이하게 하기 위해 계획된 분석 수를 완료하기에 위에 나열된 각 시약을 충분히 포함하는 마스터 믹스를 만들 수 있습니다.
    2. 100μL의 말레에이트 완충액, 80μL의 포스포릴라제 한계 덱스트린 및 20μL의 물을 조합하여 블랭크 반응을 준비합니다. 잘 혼합하고 40μL를 일회용 메타크릴레이트 큐벳으로 옮깁니다. 833μL의 트리에탄올아민 염산염/황산마그네슘 등을 단계 3.17.1에 설명된 대로 추가합니다.
    3. 블랭크 반응을 사용하여 분광 광도계의 영점을 340nm로 설정합니다.
    4. 각 큐벳에 0.5μL의 포도당-6-인산 탈수소효소를 추가합니다. 천천히 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 섞습니다. 실온에서 10분 동안 배양한 다음, 340 nm에서 흡광도를 기록한다.
       알림: 흡수 값은 낮아야 하며, 이는 샘플이 포도당-6-인산염으로 거의 오염되지 않았음을 의미합니다.
    5. 각 큐벳에 0.5μL의 헥소키나아제를 추가합니다. 천천히 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 섞습니다. 실온에서 15분 동안 배양한 다음, 340 nm에서 흡광도를 기록한다.
    6. 실온에서 5분 더 배양을 계속합니다. 다시 한번 340 nm에서의 흡광도를 기록한다. 흡수가 15분에 기록된 것보다 증가한 경우 추가 5분 동안 배양을 계속하고 흡수를 다시 확인합니다. 수득된 340 nm에서의 최종 흡수를 기록한다.
    7. 각 시료에 대해, 헥소키나아제 첨가 후 얻어진 최종 흡광도에서 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소를 첨가한 후 기록된 340 nm에서의 흡광도를 뺀다. 해당 샘플이 탈분지 효소와 함께 배양된 시간에 대해 얻은 값을 플로팅합니다.

4. 글리코겐 분지 효소 활성의 결정

1. 실험일 전에 먼저 10mL의 물에 2.6g의 KI를 용해시켜 요오드/KI 용액을 준비합니다. 흄 후드에서 0.26g의 요오드를 계량하고 KI 용액에 첨가하십시오.
   주의: 요오드는 피부에 닿거나 흡입하면 유해합니다. 요오드를 용해시켜 혼합하고 빛으로부터 보호되는 4°C에서 보관한다. 또한 pH 6.8의 125 mM PIPES 완충액을 준비합니다 ( 표 3 참조).
2. 실험을 시작할 때 산성화 된 요오드 시약의 작업 재고를 만드십시오.
   1. 50mL 튜브에 물 45.7mL를 넣고 요오드/KI 용액 150μL를 추가한 다음 1M HCl 150μL를 추가합니다.
   2. 잘 섞어 빛으로부터 보호되는 4 ° C에서 보관하십시오. 용액은 이러한 조건에서 적어도 3 일 동안 안정적입니다.
3. 실험 당일에 새로운 10mg/mL의 아밀로스 용액을 만듭니다.
   1. 50mg의 아밀로오스를 칭량하고 15mL 튜브로 옮깁니다.
   2. 무수 에탄올 200μL를 넣고 부드럽게 흔듭니다.
   3. 2M KOH 500μL를 넣고 부드럽게 흔듭니다.
      주의: KOH는 심한 피부 화상과 눈 손상을 유발합니다. 적절한 개인 보호 장비를 사용하십시오.
   4. 부드럽게 흔들면서 물 0.5mL를 추가합니다. 아밀로오스가 완전히 용해되지 않으면 물 0.5mL를 추가로 추가합니다.
   5. 1M HCl로 pH를 ~6.5에서 7.0으로 조정합니다.
      주의: HCl은 눈, 피부 및 호흡기 자극을 유발할 수 있습니다. 적절한 개인 보호 장비를 사용하십시오.
   6. 최종 부피 5mL에 도달하기 위해 물을 추가합니다.
   7. 0.2μm 주사기 엔드 필터를 통과하여 소독하고 실온에서 보관하십시오. 식히거나 얼리지 마십시오.
4. 수조를 30°C로 예열한다.
5. 각각 1mL의 산성화 요오드 시약이 들어있는 12 개의 1.5mL 튜브를 준비하십시오. 벤치에 따로 보관하십시오. 이들은 분지 효소 반응을 멈추는 데 사용됩니다.
6. 각각 150μL의 아밀로스, 150μL의 PIPES 버퍼 및 45μL의 물을 포함하는 4개의 1.5mL 튜브를 준비합니다. 이 튜브는 분기 효소 분석을 수행하는 데 사용됩니다. 반응 튜브 중 두 개와 다른 두 개의 튜브 제어에 레이블을 지정합니다.
7. 시간 간격으로 5μL의 분지 효소 샘플을 반응 튜브에 추가하고 5μL의 완충액을 첨가하여 분지 효소 샘플을 대조 튜브에 준비했습니다. 30°C에서 배양한다.
8. 정의된 시점(예: 5분, 10분, 15분 배양)에 각 반응 및 제어 튜브에서 10μL를 빼내고 산성화된 요오드 시약 1mL가 들어 있는 1.5mL 튜브에 추가합니다. 140μL의 물을 추가로 넣고 잘 섞는다. 일회용 큐벳으로 옮깁니다.
   알림: 샘플은 파란색이어야 하며 용액에는 침전물이 없어야 합니다. 형성된 색상은 실온에서 적어도 2 시간 동안 안정하다.
9. 산성화된 요오드 시약 1mL와 물 150μL가 포함된 샘플을 준비합니다. 잘 섞어 큐벳으로 옮깁니다. 이 큐벳을 사용하여 분광 광도계의 영점을 660nm로 설정하십시오.
10. 660 nm에서 12개 샘플 각각의 흡광도를 판독한다. 각 시점에서 분지효소가 존재하지 않는 경우의 흡광도(Control)에서 분지효소의 존재 하에서 얻어진 흡광도(Reaction)를 뺀 분지효소 반응의 속도를 결정한다. 자세한 내용은 대표 결과를 참조하십시오.

5. 글리코겐 분지의 정성적 평가

1. ~40mL의 물에 무수 염화칼슘 74.5g을 넣고 교반하여 포화 염화칼슘 용액을 준비합니다. 물을 조금 더 넣고 계속 저어줍니다. 물로 부피를 100mL까지 만들고_CaCl2 가 완전히 용해될 때까지 계속 저어줍니다.
2. 50μL의 KI/요오드 원액(위의 4.1단계 참조)을 13mL 튜브의 포화_CaCl2 용액 13mL와 혼합하여 요오드/CaCl₂ 색 시약의 작업 재고를 준비합니다. 잘 섞어 빛으로부터 보호되는 4 ° C에서 보관하십시오. 용액은 이러한 조건에서 적어도 1 주일 동안 안정적입니다.
3. 분기 결정
   1. 1.5mL 튜브에 650μL의 요오드/_CaCl2 컬러 시약 스톡을 100μL의 물과 혼합하고 완전히 혼합합니다. 용액을 일회용 메타크릴레이트 큐벳으로 옮깁니다.
      알림: 큐벳의 용액은 투명하고 옅은 노란색이어야 합니다.
   2. 분광 광도계에 놓고 파장 스캐닝 모드에서 실행하여 330nm에서 800nm까지의 배경 스펙트럼을 수집합니다.
   3. 1.5mL 튜브에 650μL의 작동 요오드/_CaCl2 색 시약과 50μg의 굴 글리코겐을 결합합니다. 최종 부피를 물로 750μL로 가져오고 완전히 혼합합니다. 용액을 일회용 메타크릴레이트 큐벳으로 옮깁니다.
      알림: 큐벳의 용액은 투명하고 진한 주황색/갈색이어야 합니다.
   4. 분광 광도계에 넣고 330 nm에서 800 nm까지의 흡수 스펙트럼을 수집합니다.
   5. 50μg의 아밀로펙틴과 30μg의 아밀로스로 4.4.3-4.4단계를 반복합니다.
      참고: 아밀로펙틴 샘플은 노란색/녹색이어야 하며 아밀로오스 샘플은 녹색/파란색이어야 합니다. 두 샘플 모두 깨끗해야합니다. 형성된 착색 복합체는 실온에서 적어도 1 시간 동안 흡수 스펙트럼의 변화없이 안정적입니다.
   6. 특성화되지 않은 글리코겐 샘플의 분지 구조 표시를 얻으려면 25 μg에서 50 μg의 글리코겐을 650 μL의 작동 요오드 / CaCl₂ 색 시약과 결합하십시오. 위와 같이 진행하여 부피를 물로 750μL로 가져오고 완전히 혼합한 다음 메타크릴레이트 큐벳으로 옮깁니다.
      알림: 글리코겐 샘플은 존재하는 글리코겐의 분지 정도(외부 사슬의 길이)에 따라 노란색/주황색에서 주황색/갈색을 나타내야 합니다. 다시 말하지만, 샘플은 명확해야합니다. 자세한 내용은 대표 결과를 참조하십시오.
   7. 흡수 스펙트럼을 수집합니다.

결과

글리코겐 합성 효소 활성의 결정
그림 1 은 정제된 효소를 사용한 글리코겐 합성효소 분석의 대표적인 결과를 보여줍니다. 패널 A에서, 약간의 지연에 이어서, 약 12분의 기간 동안 시간에 걸쳐 340nm에서의 흡수의 선형 감소가 있었다. 그림 1A 의 흡수 변화율은 ~0.12 흡광도 단위/분이었습니다. ~0.010에서 ~0.20 흡광도 단위/분 사이의 흡광도 변화율이 최적이며 첨가되는 글리코겐 합성효소의 양은 이 범위 내의 수율로 조정되어야 합니다. 패널 B에서, 분석에 너무 많은 글리코겐 신타제를 첨가한 결과가 도시되어 있다. 여기서, 반응은 처음 2분 이내에 완료되었다. 이러한 경우 글리코겐 합성 효소가 포함되지 않은 대조 반응은 시간이 지남에 따라 흡광도의 측정 가능한 감소를 나타내지 않았습니다. 논의에서 자세히 설명했듯이 이 분석에서 조직 균질액의 사용은 추가 제어 반응이 필요하지...

토론

일반적으로 제시된 모든 방법의 주요 장점은 저렴한 비용, 용이성, 속도 및 특수 장비에 대한 의존도가 없다는 것입니다. 모두 공유하는 주요 단점은 사용 가능한 다른 방법에 비해 민감도입니다. NADH / NADPH의 생산 또는 소비와 관련된 절차의 민감도는 쉽게 추정 할 수 있습니다. NADH / NADPH의 흡광 계수가 6.22 M이라는 것을 감안할 때-1 cm-1, 간단한 산술은 ~ ^10-20 μM 농도의 변화를 쉽게 감지 할 수 있음을 나타냅니다. 현재 기사에 설명 된 분석 부피를 사용하면 ~ 10-20 nmol 범위의 양을 측정 할 수있는 능력에 해당합니다. 틀림없이 이것은 상당히 민감합니다. 그러나, 방사성 표지 기판의 특정 활성을 조절하여 감도가 분광 광도계 분석의 한계를 넘어 매우 쉽게 증가 될 수 있습니다. 분지 효소 분석과 글리코겐 분지의 정성 평가는 모두 요오드와 α1,4-연결된 포도당 중합체 사이의 복합체 형성에 의존하지만 각 분석의 출력은 다르며 감도도 마찬가지로 다릅...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
밀랍 옥수수의 아밀로펙틴(아밀로스 무함유)	피셔 사이언티픽	A0456
아밀로스	바이오신스 카르보신스	YA10257
ATP, 다이소듐 솔	밀리포어시그마	A3377
D-글루코스-1,6-비스포스페이트, 칼륨 솔	밀리포어시그마	G6893
D-글루코스-6-포스페이트, 나트륨 염	밀리포어시그마	G7879
글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, 등급 I, 효모	MilliporeSigma	10127655001
글리코겐, 굴	MilliporeSigma	G8751
Hexokinase	MilliporeSigma	11426362001
메타크릴레이트 큐벳, 1.5mL	Fisher Scientific	14-955-128	메타크릴레이트는 다음과 같은 절차가 필요하기 때문에 필요합니다. 340nm 이하에서 수행
β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산나트륨 염	MilliporeSigma	N0505
&베타;-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 감소된 디소듐 염	MilliporeSigma	43420
뉴클레오시드 5'-디포스페이트 키나아제	MilliporeSigma	N0379
포스포에노피루베이트, 모노칼륨염	MilliporeSigma	P7127
토끼 근육의 포스포글루코무타제	MilliporeSigma	P3397
토끼 근육의 포스포릴라아제 A	MilliporeSigma	P1261
토끼 근육의 피루브산 키나아제/젖산 탈수소효소	MilliporeSigma	P0294
UDP-포도당, 다이소듐 염	MilliporeSigma	U4625