마우스 심근 세포를 일관되게 분리하는 간단하고 효과적인 방법

Summary

세포 및 분자 기능 실험을 위한 심장학의 황금 표준은 심근 세포입니다. 이 기사에서는 마우스 심근 세포를 분리하기 위한 비 Langendorff 기술에 대한 적응에 대해 설명합니다.

Abstract

고품질 심근 세포를 생성하는 재현 가능하면서도 기술적으로 간단한 방법의 필요성은 심장 생물학 연구에 필수적입니다. 심근 세포에 대한 세포 및 분자 기능 실험(예: 수축, 전기생리학, 칼슘 순환 등)은 질병의 메커니즘을 확립하기 위한 황금 표준입니다. 마우스는 기능 실험을 위해 선택되는 종이며 설명된 기술은 특히 마우스 심근 세포의 분리를 위한 것입니다. Langendorff 장치가 필요한 이전 방법은 대동맥 캐뉼라 삽입을 위해 높은 수준의 훈련과 정밀도가 필요하며 종종 허혈을 초래합니다. 이 분야는 단순하고 재현 가능하며 생리학적 데이터 수집 및 배양을 위한 생존 가능한 근세포를 생성하는 Langendorff-free 분리 방법으로 이동하고 있습니다. 이러한 방법은 대동맥 캐뉼라 삽입에 비해 허혈 시간을 크게 줄이고 안정적으로 얻은 심근 세포를 생성합니다. Langendorff-free 분석법에 대한 당사의 적응에는 얼음처럼 차가운 투명 용액을 사용한 초기 관류, 관류 중 안정적인 바늘을 보장하는 안정화 플랫폼 사용, 기능 측정 및 배양에 사용하기 위해 안정적으로 얻은 심근 세포를 보장하기 위한 추가 분해 단계가 포함됩니다. 이 방법은 간단하고 빠르게 수행할 수 있으며 기술이 거의 필요하지 않습니다.

Introduction

수십 년 동안 심장 생물학 문헌에서 필수적인 아이디어는 분자 작용 메커니즘입니다. 신뢰할 수 있는 연구를 발표하기 위해서는 행동 메커니즘을 확립해야 합니다. 분자 메커니즘을 결정하기 위한 잘 확립된 전략은 신뢰할 수 있는 데이터를 얻기 위해 고품질 심근 세포가 필요한 분리된 심근 세포 연구입니다. 작용 기전을 결정하기 위해 심근 세포에서 수행되는 세포 및 분자 실험은 수축¹, 전기 생리학², 칼슘 (^Ca2+) 사이클링³, 근섬유 Ca²⁺ 민감도⁴, 세포 골격⁵, 대사⁶, 호르몬 효과⁷, 신호 분자⁸, 약물 연구⁹를 조사하기 위한 황금 표준이다 등. 마우스는 유전자 조작의 용이성, 작은 크기, 상대적으로 짧은 수명, 저렴한 비용 등으로 인해 대부분의 심장 생물학 실험에서 선택되는 종이 되었습니다¹⁰. 그러나 고품질 마우스 심근 세포의 안정적인 분리는 현재 기술로는 간단하지 않습니다.

실험실은 거의 70년 동안 심근 세포를 분리해 왔습니다¹¹. 심근 세포를 분리하는 거의 모든 기술은 다양한 효소 (콜라겐 분해 효소, 프로테아제, 트립신 등)를 통한 심장 소화에 의존합니다. 초기(1950년대-1960년대)에는 심장을 제거하고 훨씬 더 작은 조각으로 자르고 콜라게나제/프로테아제/트립신¹²와 함께 용액에서 배양하는 청크 방법이 사용되었습니다. 1970년대에 실험실은 관상동맥 관류 기반 격리 기술(Langendorff 장치를 통한 효소로 역행 관류)을 사용하여 심근 세포를 분리하는 개선된 "Langendorff" 방법(¹³)을 구현했습니다. 이 기술은 ~50년 후인 오늘날에도 현장에서 근세포 분리의 지배적인 방법으로 남아 있습니다^14,15,16. 최근 연구는 저산소증 시간과 허혈성 손상을 제한하기 위해 생체 내에서 심장을 캐뉼라화하는 것으로 전환되어 우수한 심근 세포 분리(더 나은 수율 및 더 높은 품질)를 초래했습니다¹⁷. 최근에, 이것은 생체 내에서, 랑겐도르프가 없는 심장 관류 18,19,20,21,22를 수행하는 것으로 발전하였다. 우리는 Ackers-Johnson et ^al.18 기술을 기반으로 Langendorff-free 심근 세포 분리 기술을 발전시켰고 이전의 많은 분리 기술에서 다양한 구성 요소를 채택했습니다. 이러한 주요 적응에는 얼음처럼 차가운 제거 완충액을 주입하고 바늘을 안정화하기 위한 지지 플랫폼을 통합하여 심장 조작을 줄이는 것이 포함됩니다. 또한 이 기술에서 상세히 기술된 것은 주입된 완충액(37°C)의 온도 제어이며, 이는 이전에 발표된 바와 같이 더 적은 EDTA 관류로 인해 생체 내 주입과 소화 사이의 시간을 감소시켰다¹⁸. 심장의 조작을 줄이고 천자 부위 크기를 최소화함으로써 관상 동맥의 철저하고 지속적인 관류가 이루어집니다. 우리는 또한 2차 청크 분해법으로 기술을 정제하고, 주입된 투명 완충액 중의 EDTA의 양을 측정하고, pH를 변화시켰다. 설명된 기술은 Langendorff 장치를 사용하는 것에 비해 더 안정적이고 효율적이며 광범위한 교육/실습이 필요하지 않습니다(표 1).

Protocol

이 연구에서 수행된 모든 절차는 NIH 지침에 따라 오하이오 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 용액 준비

참고: 버퍼 농도는 표 2 를 참조하십시오.

1. 사전 격리(근세포 분리 최대 2주 전)
   1. 관류 완충액 염기: 1L의 초순수 18.2MΩ·cm H 2O에 1L의 관류 완충액 염기(NaCl, KCl, NaH 2PO₄, HEPES, 포도당 및 BDM)를 준비합니다._0.22μm멸균 여과 전에 pH 7.4로 조정합니다. 격리 당일까지 4 °C에서 보관하십시오.
   2. 클리어링 버퍼: 초순수 18.2MΩ·cm H2O 1L에 클리어링 버퍼(NaCl, KCl, NaH 2PO₄, HEPES, Glucose, EDTA, BDM) 1L를 준비합니다._0.22μm멸균 여과 전에 pH 7.4로 조정합니다. 격리 당일까지 4 °C에서 보관하십시오.
   3. 100mM CaCl2 원액:_CaCl2 1.11g을 칭량하여 초순수 18.2MΩ·cm_H2O100mL에 녹인다.
   4. 리베라아제 분취량: 소화 효소 5mg을 RNase가 없는 멸균수 5mL에 녹입니다. 0.8mL 분취량을 준비하고 분리일까지 -20°C에서 보관한다.
   5. 접시 라미네이트: 40μg/mL 마우스 라미닌 100μL를 멸균된 유리 바닥 30mL 페트리 접시에 바릅니다. 30분 동안 그대로 두었다가 과도한 라미닌을 제거합니다. 실온에서 30분 동안 UV 인큐베이션하는 페트리 접시에 라미닌을 설정합니다. 격리 당일까지 4 °C에서 보관하십시오 (라미네이트 페트리 접시는 최대 2 주 동안 사용할 수 있음).
   6. DMEM 배지: 생물 안전 캐비닛에 FBS 2.5mL, 페니실린-스트렙토마이신 0.5mL(50U/mL-50μg), 500mM BDM 1mL를 DMEM 46mL에 추가합니다. 격리 당일까지 4 °C에서 보관하십시오 (배지는 최대 2 주 동안 사용 가능).
   7. M199 배지: 1L의 초순수 18.2MΩ·cm H 2O에 1L의 M199 배지(NaHCO₃, HEPES, L-글루타티온, M199, BDM 및 BSA)를 준비합니다. 멸균 여과(_0.22μm필터) 전에 pH 7.4로 조정합니다. 격리 당일까지 4 °C에서 보관하십시오.
   8. 500 mM BDM 스톡: 0.5 g의 BDM을 10 mL의 초순수 18.2 MΩ·cm H₂O에 첨가하고, 격리 당일까지 4 °C에서 보관한다.
   9. 플랫폼 생성 안정화: Luer 마개에 나사로 고정된 바늘 바닥 주위에 플레이도우를 성형합니다. 심장을 담을 페트리 접시에 곰팡이를 만들고 바늘이 심실 주입을 위한 적절한 높이(접시 바닥에서 ~5mm)에 있는지 확인합니다.
2. 고립의 날
   1. 관류 완충액: 분리 당일 9.5mg의 MgCl₂ 를 100mL의 관류 완충액 염기에 추가합니다. 완성된 관류 완충액 30mL를 제거하기 전에 완전히 혼합하고 스크류 캡 뚜껑(소화 완충액)이 있는 깨끗하고 입이 넓은 100mL 유리병에 넣습니다.
      알림: 이러한 추가는 추가 pH를 무시할 수 있을 정도로 변경하기 때문에 추가 pH 조정 없이 분리 당일에 수행할 수 있습니다.
      1. 12 mL의 관류 완충액을 제거하고 측면으로 세팅한다(정지 완충액). 나머지 58mL의 관류 완충액을 나사 뚜껑이 있는 다른 깨끗하고 입이 넓은 100mL 유리병에 붓습니다. 나머지 관류 완충액을 단리 전체에 걸쳐 37°C에서 보관한다.
   2. 분해 완충액: 7.5μL의 100mM CaCl₂ 를 30mL의 관류 완충액에 추가하여 최종 농도가 25μM인 경우 분리 직전에 770μL의 Libraase를 분해 완충액에 추가하여 최종 농도가 26μg/mL가 되도록 합니다.
   3. 정지 완충액: BSA 240mg을 관류 완충액 12mL에 녹입니다. 격리하는 동안 37°C에서 보관하십시오.
   4. 클리어링 버퍼: 클리어링 버퍼 3mL 주사기를 준비하고 바늘에서 기포를 제거합니다. 격리 될 때까지 얼음에 보관하십시오.

2. 매니폴드 준비

1. 새로 준비된 관류 버퍼로 온도 제어 매니폴드를 제거하고 기포가 남지 않도록 주의하십시오. 루어 잠금 커넥터를 사용하여 27G 바늘을 조이고 기포를 제거합니다. 클리어링된 매니폴드는 성공적인 분리를 위해 필수적입니다.

3. 동물 준비

1. 분리 직전에 체중 기준으로 100mg/kg 케타민과 20mg/kg 자일라진을 마우스에 복강 주사합니다. 이 절차에서는 4개월 된 수컷 C57Bl/6 마우스를 사용했습니다.
2. 필요한 경우 진정 작용을 촉진하기 위해 가열된 수술 패드에 마우스를 놓습니다. 쥐의 팔에 텐트를 치고 팔다리와 꼬리 밑 부분을 파란색 실험실 기저귀에 테이프로 붙입니다. 발가락 - 핀치 반사의 철회로 동물이 완전히 마취되었는지 확인하십시오. 수술 부위 주위에 멸균 드레이프를 바릅니다.

4. 심근 세포 분리 절차

1. 마우스의 흉골을 노출시키고 정중선 측면에서 갈비뼈와 겨드랑이를 통해 근위부로 자릅니다. 다이어프램을 부드럽게 완전히 절단하여 심장을 피하기 위해 얕은 절단을 보장합니다. 지혈제로 흉골을 고정하고 갈비뼈를 뒤로 접어 흉강을 노출시킵니다.
2. 심장에서 심낭을 부드럽게 제거하고 심장 원위부에 있는 하대정맥을 완전히 자릅니다. 27G 바늘이 있는 3mL 주사기를 사용하여 3mL의 얼음처럼 차가운 투명 완충액을 1분에 걸쳐 심장의 우심실에 빠르게 주입합니다.
3. 핀셋을 사용하여 심장을 부드럽게 잡고 몸에서 떼어내어 가능한 한 많은 대동맥을 노출시킵니다. 지혈제를 사용하여 상행 대동맥을 고정하고 심방을 고정하지 않도록주의하고 가슴에서 심장을 절제하십시오.
4. 약 10mL의 따뜻한 관류 완충액이 있는 폴리프로필렌 페트리 접시의 뚜껑에 클램핑된 심장을 빠르게 옮깁니다. 클램핑된 심장을 지지 플랫폼에 놓고 매니폴드에 부착된 안정화된 27G 바늘을 사용하여 온도 제어 37°C 관류 완충액 10mL를 5분에 걸쳐 좌심실에 주입합니다.
5. 클램핑된 심장과 지지 플랫폼을 약 5mL의 소화 완충액이 있는 페트리 접시로 옮깁니다. 입력 주사기를 50mL 주사기와 25mL의 소화 완충액으로 교환합니다.
6. 주입하기 전에 기포와 남아 있는 관류 완충액의 매니폴드를 제거합니다. 바늘을 좌심실 정점의 동일한 바늘 위치로 조심스럽게 교체하십시오.
7. 관류 펌프를 사용하여 50mL 주사기를 사용하여 15분 동안 온도 제어 37°C 소화 완충액을 좌심실에 주입합니다. 바늘 끝에서 37°C 용액을 배출하도록 미리 보정된 워터 재킷으로 용액의 온도를 제어합니다.
8. 심방에서 심실을 제거하고 10mL 비커로 옮깁니다. 비커에 소화 완충액 3mL를 넣고 날카로운 가위를 사용하여 심실을 큰 덩어리로 자릅니다. 알루미늄 호일로 비커를 덮고 37°C로 예열된 진탕 수조에 5분 동안 넣습니다.
9. 조직 덩어리가 제거되지 않도록 주의하면서 상청액을 버리십시오. 조직 덩어리를 3mL의 소화 완충액에 재현탁하고 약 4분 동안 또는 균질한 혼합물이 될 때까지 분쇄합니다.
10. 70μm 나일론 셀 스트레이너를 통해 50mL 폴리프로필렌 튜브에 세포를 여과합니다.
11. 여과액을 14mL 둥근 바닥 폴리프로필렌 튜브로 되돌리고 100rpm에서 1분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 펠릿을 3mL의 정지 완충액에 재현탁합니다.
12. 1.8 mM의 최종_CaCl2 농도를 위해 재현탁된 세포에 54 μL의 100 mM_CaCl2 스톡을 첨가한다. 이 단계는 세포 수율을 증가시키기 위해 단계적으로 수행될 수도 있다.
13. 죽은 세포가 포함된 상청액을 제거하기 전에 살아있는 세포가 중력에 의해 10분 동안 침전되도록 합니다. 펠렛을 저장 용액(200 μM_CaCl2를 사용한 관류 용액)에 재현탁합니다. 이 세포는 이제 기능 실험(예: 칼슘 이미징/수축, 패치 클램프 등), 배양 등에 사용할 수 있습니다.
    참고: 세포는 실험실 또는 실험 의존적 용액에서 재현탁될 수도 있습니다.

5. 세포 배양

1. 혈구계를 사용하여 세포를 계산하거나 격자 덮개 슬립을 사용하여 현장 보기 계산으로 계산합니다. 근세포가 매우 크기 때문에 혈구계를 사용하여 계산하는 것이 항상 정확한 것은 아닙니다. 이것은 분리에서 얼마나 많은 세포가 얻어졌는지에 대한 아이디어를 얻는 데 사용됩니다.
2. DMEM 배지를 사용하여 세포를 ~25,000 cells/mL로 희석합니다. 각 웰에 1mL의 세포 용액을 첨가한다.
3. 37°C, 95% O2, 5%_CO2에서 2시간 동안 배양한다.
4. 각 웰에서 DMEM 배지를 부드럽게 흡입하고 M199 배지 2mL를 추가합니다.
5. 37°C, 95% O2, 5%_CO2에서 최대 24시간 동안 배양합니다.

Results

격리의 성공 여부를 결정할 때 검토해야 할 몇 가지 요소가 있습니다. 첫째, 심근 세포는 그림 1에서 분리된 세포와 같이 막 기피가 없는 막대 모양이어야 합니다. 전형적인 분리는 근세포의 ~80%가 막대 모양이 됩니다. 분리 결과 막대 모양의 세포가 50% 미만이면 실패한 분리로 간주되며 심근 세포는 사용되지 않습니다. 마지막으로 심근 세포는 정지 상태여야 합니다. 자발적으로 수축하는 근세포는 Ca2+ 불내성을 나타내며 신뢰할 수 없는 데이터를 생성합니다. 위의 기술을 사용하여 수행된 모든 격리 중에서 거의 모든 격리가 성공한 것으로 간주됩니다. 배양된 심근 세포는 막 블랩이 없는 막대 모양이거나 생존율이 높은 둥근 모서리인 경우 성공적인 것으로 간주됩니다(그림 2).

표 1. 우리의 방법, Langendorff 방법 및 이전에 발표된 Langendorff-f...

Discussion

Langendorff-free 심근세포 분리 기술의 주요 장점은 Langendorff 장치에 캐뉼러를 삽입할 필요가 없어 저산소증과 허혈 시간을 제한한다는 것입니다. 심장을 제거, 세척 및 매달아 종종 근세포에 허혈성 손상을 초래하는 고전적인 Langendorff 기법 대신 당사의 방법에는 얼음처럼 차가운 세척 용액을 통한 생체 내 혈액 세척이 포함됩니다. 얼음처럼 차가운 투명 완충액에는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 함유되어 있으며, 2가 양이온을 비가역적으로 킬레이트화하여 칼슘을 효율적으로 제거하여 우수한 항응고제로 만들어 수축을 막는다²³. 얼음처럼 차가운 용액을 사용하면 이온 교환과 세포 대사 속도를 늦추어 수축을 억제하여 허혈로 인한 손상을 예방할 수 있습니다²⁴. 대동맥 캐뉼라 삽입의 필요성을 제거함으로써 Langendorff-free 기술은 강력한 근세포를 생성하여 신뢰할 수 있는 데이터를 산...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10cc Bd Luer-Lok 주사기	Fisher Sci	14-827-52
10mL Pyrex 저형 비커	Cole-Palmer	UX-34502-01
100mL 폴리프로필렌 캡 유리 미디어 보관 병	DWK Life Sciences	UX-34523-00
캡이 있는 14mL 둥근 바닥 폴리프로필렌 시험관	Fisher Sci	14-959-11B
2,3-부탄디온 모노심	Sigma	B0753	>98%
3 cc BD Luer-Lok 주사기	Fisher Sci	14-823-435
35 mm 유리 바닥 접시	MatTek Corporation	P35G-1.0-20-C
50 mL BD 주사기(바늘 없음	) Fisher Sci	13-689-8
50 mL 원추형 원심분리기 튜브	Cole-Palmer	EW-22999-84
95% O2 5% CO2
AIMS 스페이스 젤 히팅 패드	Fisher Sci	14-370-223
BD PrecisionGlide 27 G x 1/2" 피하 주사 바늘	Becton Dickinson	305109
소 혈청 알부	시그마	A3803	열 충격 분율, 동결건조 분말, 본질적으로 지방산 무료, >98%
칼슘 클로라이드 디하이드레이트	시그마	C7902	>99%
D-(+)-포도	시그마	G7021	세포 배양에 적합, >99.5%
DMEM	Fisher Sci	11965092
EDTA	Fisher Sci	AAA1071336
Falcon 100mm TC 처리 세포 배양 접시	코닝	353003
FBS	R& D 시스템 (바이오 테크네)	S11195
Fisherbrand Isotemp 가열 침지 순환기	Fisher Sci	13-874-432
Hartman 모기 지혈 겸자	세계 정밀 기기	15921
Hausser Scientific Hy-Lite 계수 챔버 세트	Fisher Sci	02-671-11
HEPES	시그마	H4034	>99.5%
라벨링 테이프	Fisher Sci	15-901-10R
Legato 100 주사기 펌프	kdScientific	788100
L-글루타티온	Fisher Sci	ICN19467980
Liberase TH 연구 등급	시그마	5401135001	높은 열분해 농도
M199	Fisher Sci	MT10060CV
염화	마그네슘Invitrogen	AM9530G
마우스 라미닌	코닝	354232
펜/연쇄상 구균	Fisher Sci
염화	시그마	P5405	>99%
Precision Digital Reciprocating Water Bath	ThermoFisher Scientific	TSCIR19
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761	세포에 적합 culture
염화나트륨	시그마	S5886	>99%
인산나트륨 일염기	시그마	S5011	>99%
멸균 세포 스트레이너 70 &마이크로; m	Fisher Sci	22-363-548
학생용 세밀한 가위	세밀한 과학 도구	91460-11
VWR 흡수성 언더패드	Fisher Sci	NC9481815