세포 및 분자 기능 실험을 위한 심장학의 황금 표준은 심근 세포입니다. 이 기사에서는 마우스 심근 세포를 분리하기 위한 비 Langendorff 기술에 대한 적응에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
고품질 심근 세포를 생성하는 재현 가능하면서도 기술적으로 간단한 방법의 필요성은 심장 생물학 연구에 필수적입니다. 심근 세포에 대한 세포 및 분자 기능 실험(예: 수축, 전기생리학, 칼슘 순환 등)은 질병의 메커니즘을 확립하기 위한 황금 표준입니다. 마우스는 기능 실험을 위해 선택되는 종이며 설명된 기술은 특히 마우스 심근 세포의 분리를 위한 것입니다. Langendorff 장치가 필요한 이전 방법은 대동맥 캐뉼라 삽입을 위해 높은 수준의 훈련과 정밀도가 필요하며 종종 허혈을 초래합니다. 이 분야는 단순하고 재현 가능하며 생리학적 데이터 수집 및 배양을 위한 생존 가능한 근세포를 생성하는 Langendorff-free 분리 방법으로 이동하고 있습니다. 이러한 방법은 대동맥 캐뉼라 삽입에 비해 허혈 시간을 크게 줄이고 안정적으로 얻은 심근 세포를 생성합니다. Langendorff-free 분석법에 대한 당사의 적응에는 얼음처럼 차가운 투명 용액을 사용한 초기 관류, 관류 중 안정적인 바늘을 보장하는 안정화 플랫폼 사용, 기능 측정 및 배양에 사용하기 위해 안정적으로 얻은 심근 세포를 보장하기 위한 추가 분해 단계가 포함됩니다. 이 방법은 간단하고 빠르게 수행할 수 있으며 기술이 거의 필요하지 않습니다.
서론
수십 년 동안 심장 생물학 문헌에서 필수적인 아이디어는 분자 작용 메커니즘입니다. 신뢰할 수 있는 연구를 발표하기 위해서는 행동 메커니즘을 확립해야 합니다. 분자 메커니즘을 결정하기 위한 잘 확립된 전략은 신뢰할 수 있는 데이터를 얻기 위해 고품질 심근 세포가 필요한 분리된 심근 세포 연구입니다. 작용 기전을 결정하기 위해 심근 세포에서 수행되는 세포 및 분자 실험은 수축1, 전기 생리학2, 칼슘 (Ca2+) 사이클링3, 근섬유 Ca2+ 민감도4, 세포 골격5, 대사6, 호르몬 효과7, 신호 분자8, 약물 연구9를 조사하기 위한 황금 표준이다 등. 마우스는 유전자 조작의 용이성, 작은 크기, 상대적으로 짧은 수명, 저렴한 비용 등으로 인해 대부분의 심장 생물학 실험에서 선택되는 종이 되었습니다10. 그러나 고품질 마우스 심근 세포의....
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프로토콜
이 연구에서 수행된 모든 절차는 NIH 지침에 따라 오하이오 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 용액 준비
참고: 버퍼 농도는 표 2 를 참조하십시오.
- 사전 격리(근세포 분리 최대 2주 전)
- 관류 완충액 염기: 1L의 초순수 18.2MΩ·cm H 2O에 1L의 관류 완충액 염기(NaCl, KCl, NaH 2PO4, HEPES, 포도당 및 BDM)를 준비합니다.0.22μm멸균 여과 전에 pH 7.4로 조정합니다. 격리 당일까지 4 °C에서 보관하십시오.
- 클리어링 버퍼: 초순수 18.2MΩ·cm H2O 1L에 클리어링 버퍼(NaCl, KCl, NaH 2PO4, HEPES, Glucose, EDTA, BDM) 1L를 준비합니다.0.22μm멸균 여과 전에 pH 7.4로 조정합니다. 격리 당일까지 4 °C에서 보관하십시오.
- 100mM CaCl2 원액:CaCl2 1.11g을 칭량하여 초....
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결과
격리의 성공 여부를 결정할 때 검토해야 할 몇 가지 요소가 있습니다. 첫째, 심근 세포는 그림 1에서 분리된 세포와 같이 막 기피가 없는 막대 모양이어야 합니다. 전형적인 분리는 근세포의 ~80%가 막대 모양이 됩니다. 분리 결과 막대 모양의 세포가 50% 미만이면 실패한 분리로 간주되며 심근 세포는 사용되지 않습니다. 마지막으로 심근 세포는 정지 상태여야 합니다. 자발적으로 수축하는 근세포는 Ca2+ 불내성을 나타내며 신뢰할 수 없는 데이터를 생성합니다. 위의 기술을 사용하여 수행된 모든 격리 중에서 거의 모든 격리가 성공한 것으로 간주됩니다. 배양된 심근 세포는 막 블랩이 없는 막대 모양이거나 생존율이 높은 둥근 모서리인 경우 성공적인 것으로 간주됩니다(그림 2).
표 1. 우리의 방법, Langendorff 방법 및 이전에 발표된 Langendorff-f.......
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토론
Langendorff-free 심근세포 분리 기술의 주요 장점은 Langendorff 장치에 캐뉼러를 삽입할 필요가 없어 저산소증과 허혈 시간을 제한한다는 것입니다. 심장을 제거, 세척 및 매달아 종종 근세포에 허혈성 손상을 초래하는 고전적인 Langendorff 기법 대신 당사의 방법에는 얼음처럼 차가운 세척 용액을 통한 생체 내 혈액 세척이 포함됩니다. 얼음처럼 차가운 투명 완충액에는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 함유되어 있으며, 2가 양이온을 비가역적으로 킬레이트화하여 칼슘을 효율적으로 제거하여 우수한 항응고제로 만들어 수축을 막는다23. 얼음처럼 차가운 용액을 사용하면 이온 교환과 세포 대사 속도를 늦추어 수축을 억제하여 허혈로 인한 손상을 예방할 수 있습니다24. 대동맥 캐뉼라 삽입의 필요성을 제거함으로써 Langendorff-free 기술은 강력한 근세포를 생성하여 신뢰할 수 있는 데이터를 산.......
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공개 사항
공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 국립 보건원 보조금 R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) 및 T32 HL134616 (Sturgill and Salyer)의 지원을 받았습니다.
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참고문헌
- Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).
- Ziolo, M. T., et al.
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