대식세포-섬유아세포 공동배양물의 정량화를 위한 영역 기반 이미지 분석 알고리즘

Summary

우리는 세포 수를 식별하기 위해 일반화 가능한 영역 기반 이미지 분석 접근법을 활용하는 방법을 제시합니다. 상이한 세포 집단의 분석은 적응형 알고리즘 내에서 별개의 세포 유형 사이의 유의한 세포 높이 및 구조 차이를 이용하였다.

Abstract

세포의 정량화는 광범위한 생물학적 및 생화학적 연구에 필요하다. 세포의 종래의 이미지 분석은 전형적으로 면역형광 염색 또는 형광 단백질로 형질감염 또는 에지 검출 기술과 같은 형광 검출 접근법을 이용하는데, 이는 종종 이미지 배경에서 노이즈 및 다른 비이상성으로 인해 오류가 발생하기 쉽다.

우리는 대식세포와 섬유아세포, 조직 재생 중에 종종 공국소화되는 다양한 표현형의 세포를 정확하게 계산하고 구별할 수 있는 새로운 알고리즘을 설계했습니다. MATLAB은 배경과의 높이 차이에 따라 별개의 세포 유형을 차별화하는 알고리즘을 구현하는 데 사용되었습니다. 기본 알고리즘은 세포 크기 / 구조 및 고밀도 시딩 조건의 변화를 설명하기 위해 영역 기반 방법을 사용하여 개발되었습니다.

세포 구조에서 비이상성은 주어진 세포 유형에 대한 실험 데이터를 사용하여 계산된 세포 커버리지와 같은 내부 파라미터를 활용하는 이차적이고 반복적인 알고리즘으로 설명되었다. 마지막으로, 영상 내의 상대적 높이 차이의 평가에 기초하여 다양한 세포 유형이 선택적으로 배제되는 격리 알고리즘을 사용하여 공동 배양 환경의 분석이 수행되었다. 이 접근법은 단배양된 세포에 대해 5% 오차 한계 내에서 그리고 공동 배양된 세포에 대해 10% 오차 한계 내에서 세포를 정확하게 계수하는 것으로 밝혀졌다.

Introduction

소프트웨어는 이미지 분석 기술 중에 일상적으로 구현되어 결과가 정확하고 효율적이며 편향되지 않도록합니다. 세포 기반 분석의 경우, 일반적인 문제는 세포의 오인입니다. 부적절한 초점 및 대비 설정이 있는 이미지는 셀 블러링으로 이어질 수 있으며, 여기서 개별 셀의 경계는¹을 식별하기 어려워집니다. 기공, 거품 또는 기타 바람직하지 않은 물체와 같은 외래 이미지 기능이 있으면 계산 프로세스가 느려지고 잘못 식별되어 계산 절차가 방해받을 수 있습니다. 또한 셀 카운팅은 번거로울 수 있으며 수백 번의 반복실험을 계산하는 데 매우 시간이 많이 걸릴 수 있습니다. 더욱이, 수동 카운팅 동안 내재된 주관적 편향이 존재하며, 따라서 세포 식별에 관한 의사 결정은 종종 부정확하다². 자동화 된 소프트웨어는 조사자 편향의 영향을 줄이는 잘 정의 된 식별 기준에 따라 정확한 탐지를위한 인간 능력을 훨씬 뛰어 넘는 물체를 포함하여 세포를 외부 물체와 신속하고 정확하게 구별함으로써 이러한 모든 문제를 우회 할 수있는 흥미로운 잠재력을 제공합니다. 자동화 된 소프트웨어를 사용하여 세포를 식별하는 일반적인 기술은 세분화 및 임계 값³의 두 가지 주요 방법을 포함합니다. 여기에서는 널리 접근 ....

Protocol

1. 세포 배양 및 이미지 획득

1. RAW264.7 대식세포를 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1.5 g/L 중탄산나트륨 및 5 μM β-메르캅토에탄올로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 37°C 및 5%_CO2 에서 배양하였다.
   1. 단배양 영상화를 위해, RAW264.7 세포를 1 mL의 배지와 함께 5 mL 세포 배양 플라스크에서 25,000 세포/^cm2 의 밀도로 배양한다.
2. NIH/3T3 세포를 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 11로 보충된 DMEM에서 37°C 및 5%_CO2^{에서 배양}한다.
3. 공동배양 영상화를 위해, RAW264.7 대식세포와 NIH/3T3 섬유아세포를 25,000 세포^/cm2의 총 밀도에서 다양한 비율로 함께 배양한다. 1 파트 RAW264.7 배지 (10 % FBS, 1 % 페니실린 스트렙토 마이신, 1.5 g / L 중탄산나트륨 및 5 μM β-mercaptoethanol로 보충 된 DMEM) 및 1 부 NIH / 3T3 배지 (10 % 우태아 혈청 및 1 % 페니실린 스트렙....

Results

비구근성 RAW264.7 대식세포의 분석은 25,000 세포/^cm2에서 단독배양 환경에서 수행되었다. 세포 배양물을 촬영하고 ImageJ에서 8비트 티프로 변환한 후 MATLAB에서 처리한 대표적인 이미지를 촬영하였다. 공정 전반에 걸친 알고리즘 출력은 대표 이미지에 대해 도 2 에 기록되고 문서화되었다. 이 이미지에서 알고리즘은 226개의 셀을 계산했으며, 이 이미지 카운트는 241개의 셀을 식별한 수동 카운트(6.2% 오류)와 비교하여 검증되었습니다. RAW264.7 셀 카운트의 적어도 10개의 이미지에 대한 알고리즘 출력은 4.5 내지 1.9%의 평균 오차를 가±다.

구근 RAW264.7 대식세포의 분석은 반복적 알고리즘을 사용하여 수행되었다. 대부분의 이미지에서 관찰 된 구근 효과는 주로 세포가 부착 된 기판의 초점 평면보다 약간 높은 초점 평면에 초점을 맞춘 결과였습니다. 따라서 대부분의 이미지는 .......

Discussion

우리는 세포 높이를 기준으로 세포를 정확하고 효율적으로 계산하는 일반적인 영역 기반 절차를 설계하여 공동 배양 시스템에서도 세포의 얼룩없는 정량을 가능하게했습니다. 이 절차의 중요한 단계에는 세포가 분화 될 수있는 상대적 강도 시스템의 구현이 포함되었습니다. 상대 높이 분석의 사용은 두 가지 목적을 달성했습니다 : 상대 매개 변수가 주어진 셀 유형 및 매개 변수에 대해 일정하고 모든 이미지에 대해 절대 밝기 / 대비 수준을 입력 할 필요가 없기 때문에 외부 매개 변수의 필요성이 불필요하게 렌더링되었습니다. 또한, 백분위수 기반 시스템을 사용하여 동일한 이미지 내에서 여러 세포 유형을 분석할 수 있었으며, 서로 다른 세포 유형이 이미지 내의 고유한 높이에 상주하는 경우에 한해 분석할 수 있었습니다.

백분위수 기반 시스템은 평균과 반대되는 최대 픽셀 값과의 차이로 정의되었습니다. 이것은 평균 강도 값에 기초한 알고리즘의 왜곡을 방지하기 위해 수행되었으며, 이는 이미지에 존재하는 세포.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axio Observer 7 도립 현미경	Zeiss	1028290770
β-메르캅토에탄올	Life Technologies	21985023
세포 스크레이퍼	CellTreat	229310
Dublecco의 변형 독수리 매체	Fisher Scientific	12430047
Dublecco의 PBS	Fisher Scientific	14190144
MATLAB Software	MathWorks	2021A
NIH/3T3 셀	ATCC	ATCC CRL - 1658
페니실린– 스트렙토마이신	시그마 Aldrich	P4333-20ML
RAW264.7 세포	ATCC	ATCC TIB - 71
중탄산나트륨	시그마 Aldrich	S6014-25G
T75 세포 배양 플라스크	코닝	CLS3814-24EA