여기에서, 우리는 다양한 유방암 세포주에서 루시퍼라제 및 녹색 형광 단백질 발현을 수반하는 비침습적 모니터링 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 마우스에서 실시간으로 종양 형성 및 전이성 콜로니화를 모니터링하는 기술을 제공한다.
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이 논문에서
요약
초록
유방암은 빈번한 이질적인 악성 종양이며 주로 먼 장기 전이로 인해 여성의 사망률의 두 번째 주요 원인입니다. 암세포가 유선지방 패드에 주입되는 널리 사용되는 동위원소 마우스 모델을 포함하여 여러 동물 모델이 생성되었다. 그러나, 이들 모델은 종양 성장 동역학 및 전이성 콜로니화를 모니터링하는 것을 도울 수 없다. 생쥐에서 실시간으로 암세포를 모니터링하는 최첨단 도구는 종양 생물학에 대한 이해를 크게 향상시킬 것입니다.
여기서, 루시퍼라아제와 녹색 형광 단백질(GFP)을 안정적으로 발현하는 유방암 세포주가 확립되었다. 구체적으로, 이 기술은 시험관 내에서 루시퍼라제 활성을 측정하고 이어서 비비만 당뇨병-중증 복합 면역결핍(NOD-SCID) 마우스의 유선지방 패드에 암세포를 이식함으로써 개시되는 두 개의 순차적 단계를 포함한다. 주사 후, 종양 성장 및 전이성 콜로니화 둘 모두는 비침습적 생체발광 이미징 시스템에 의해 실시간으로 모니터링된다. 이어서, 폐에서 GFP 발현 전이의 정량화는 관찰된 생체발광 결과를 검증하기 위해 형광 현미경에 의해 검사될 것이다. 루시퍼라아제와 형광 기반 검출 도구를 결합한 이 정교한 시스템은 유방암 치료제 및 질병 관리에 사용할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있는 생체 내 암 전이를 평가합니다.
서론
유방암은 전 세계적으로 빈번한 유형의 암으로, 미국에서 매년 약 250,000 건의 새로운 사례가 진단됩니다1. 높은 발생률에도 불구하고 새로운 항암제 세트는 유방암 환자 결과를 크게 개선했습니다2. 그러나 많은 환자들이 질병 재발과 전이성이 환자의 이환률과 사망률의 주요 원인 인 중요한 장기로 전이되어전이성 확산을 경험하기 때문에 이러한 치료법은 여전히 부적절합니다. 따라서, 유방암 연구의 주요 과제 중 하나는 원위 전이의 형성을 조절하는 분자 메커니즘을 규명하여 이들의 발달을 억제하는 새로운 수단을 개발하는 것이다.
암 전이는 세포가 원발성 종양에서 분리되어 혈액 순환을 통해 이웃 조직을 침범하는 역동적 인 과정입니다. 따라서, 세포가 유사한 전이성 캐스케이드를 겪는 동물 모델은 이러한 과정(3,4)을 지배하는 메카니즘의 식별을 용이하게 할 수 있다. 추가적으로, 이러한 생체내 모델은 유방암 치료제(5,6)를 개발하는데 필수적이다. 그러나, 이들 동위원소 모델은 효과가 종결시에 결정되기 때문에 실제 종양 성장 동역학을 나타낼 수 없다. 따라서 우리는 종양 발생과 전이성 식민지화를 실시간으로 탐지하는 루시페라아제 기반 도구를 확립했습니다. 추가적으로, 이들 세포는 GFP를 발현하여 전이성 콜로니를 검출한다. 이 접근법은 비교적 간단하며 어떠한 침습적 절차도 수반하지 않는다3. 따라서, 루시퍼라아제와 형광 검출을 결합하는 것은 유방암 치료제 및 질병 관리의 전임상 연구를 진전시키는 데 유용한 전략이다.
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프로토콜
모든 마우스 실험은 히브리 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회-승인 프로토콜 MD-21-16429-5 하에 수행되었다. 또한, 히브리 대학은 실험실 동물 관리의 평가 및 인증을위한 협회 (AAALAC)의 인증을 받았습니다.
1. 세포주 정비
참고: 인간 유방암 세포주(MCF-7, MDA-MB-468 및 MDA-MB-231)가 이 프로토콜에 사용되었다.
- 모든 유방암 세포주를 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 배양하고, 가습된 이산화탄소(5%CO2) 배양기에서 37°C에서 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충하였다.
참고 : 정기적으로 세포 밀도를 확인하십시오. 70 % 합류율에 도달 할 때 향후 사용을 위해 분할하고 확장하십시오.
2. 바이러스 준비
- HEK293T 세포가 분리될 때까지 1mL의 트립신으로 치료하십시오.
- 트립신 활성을 중화시키기 위해 DMEM (10% FBS) 10 mL를 첨가하고, 세포 현탁액을 새로운 15 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.
- 150 × g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 침전시킨다. 원심분리 후 상층액을 버리고 신선한 DMEM 배지 1 mL를 첨가한다.
- 세포 농도를 결정하고 6 웰 플레이트에서 106 세포 / 웰× 1.2 종자.
- 다음 날, 형질감염 시약, 무혈청 DMEM, 엔벨로프 플라스미드 (VSV-G), 렌티바이러스 패키징 플라스미드 (ΔVPR), 및 pLX304 루시페라제-V5 블라스트 플라스미드 또는 FUW GFP 플라스미드를 포함하는 필요한 모든 시약을 예열한다.
- 1.5 mL 오토클레이브 원심분리 튜브에서, 50 μL의 무혈청 DMEM을 0.3 μg의 VSV-G 플라스미드, 1 μg의 ΔVPR, 및 1.2 μg의 pLX304 루시페라제-V5 블라스트 플라스미드 또는 FUW GFP 플라스미드와 혼합한다.
- 이들 플라스미드를 배지와 완전히 혼합한 후, 형질감염 시약 5 μL를 첨가하고, 부드럽게 혼합하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다.
- 인큐베이션 후, 상기 혼합물을 HEK293T 세포에 적가한다.
- 24시간 후, 성장 배지를 2 mL의 (30% FBS) DMEM으로 교체한다. 다음날(형질감염 후 48시간)에, 바이러스("pLX304 루시페라제-V5 또는 FUW GFP 바이러스")를 함유하는 배지를 수확한다.
참고: 30% FBS를 사용하면 바이러스 생산 효율성이 향상됩니다. - 임의의 HEK293T 세포 잔기를 피하기 위해, 바이러스 함유 배지를 0.45 μm 시린지 필터 또는 원심분리기를 통해 5분 동안 150 × g 에서 통과시키고, 상청액을 수집한다.
참고: 장기간 보관하려면 바이러스의 작동 분취량을 -80°C에서 유지하십시오.
3. GFP와 루시퍼라아제를 안정적으로 발현하는 세포 확립 ("GFP + Luc+ 세포")
- 세포를 감염시키기 전날, 6 웰 플레이트에 웰 당 8 개의 × 10 개의5 개의 세포를 시드하십시오.
- 하룻밤 동안 배양한 후, 성장 배지를 8 μg/mL의 폴리브렌을 함유하는 신선한 배지로 교체한다. 200 μL의 FUW GFP 바이러스를 세포에 적가한다.
- 선택사항: 바이러스 효율을 향상시키기 위해, 플레이트를 560 × g 에서 30분 동안 원심분리(37°C)한다(스핀 감염).
- 세포를 48시간 동안 인큐베이션하고, GFP 발현을 형광 현미경으로 검증한다.
- GFP 발현 세포를 형광 활성화 세포 분류 (FACS) (GFP+)에 의해 정렬한다 (도 1A).
- GFP 분류된 세포를 단계 3.2에 기재된 바와 같이 pLX304 루시페라제-V5 블라스트 바이러스로 감염시킨다.
- 세포를 감염 후 30시간 후에 블라스티시딘(10μg/mL)으로 처리하여 pLX304 루시페라제-V5 블라스트 발현 세포(GFP+, Luc+ 세포)를 풍부하게 합니다. 그런 다음 이틀마다 블라스티시딘을 함유 한 신선한 배지로 교체하십시오. 추가적으로, 대조군으로서, 나이브 세포를 동일한 블라스티시딘 함유 배지로 치료한다.
참고 : 감염된 세포와 대조 세포 간의 명확한 차이는 블라스티시딘 치료 며칠 후에 관찰되어야합니다. 이 효과는 세포주에 의존적이며 보통 ~ 8-10 일이 걸립니다. 열악한 생존율은 낮은 바이러스 생산 수율을 나타낼 것이다. 그렇다면 낮은 효율로 새로운 바이러스 배치를 생산하면 향후 실험에 영향을 줄 수 있습니다.
4. 체외 루시퍼라아제 활성 검증
- MCF-7, MDA-MB-468, 및 MDA-MB-231 GFP+ Luc+ 세포를 15 cm 플레이트에서 80% 컨플루언시로 성장시킨다. 단계 2.1-2.2에 기재된 바와 같이 트립신화에 의해 세포를 수확한다.
- 각 웰 (0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4 × 104)에서 증가하는 세포 수를 검정색 96-웰 플레이트에 시드한다.
참고: 검은색 96웰 플레이트는 흰색 또는 투명 플레이트가 자동 발광 신호를 생성하므로 루시퍼라제 수준을 측정하는 데 더 적합합니다. 대조군으로서, PBS로부터의 자가발광이 없는지 확인하기 위해 하나의 웰에 인산완충식염수(PBS)를 단독으로 사용한다. - 모든 웰을 100 μL의 DMEM으로 채우고 16-24 h 동안 인큐베이션한다.
- PBS 중의 루시페린 용액을 30 mg/mL의 스톡으로부터 1.5 mg/mL 농도로 준비한다. 루시페린 용액의 스톡을 분취액하고 -20°C에서 보관한다.
- 세포를 PBS로 1회 부드럽게 세척하고, 각 웰에 루시페린 용액 100 μL를 첨가하고, 2분 동안 기다린다. 마지막으로, 생체발광을 이용하여 모든 유방암 세포에서 루시퍼라제 활성을 측정한다.
참고: 동물 실험 전에 시험관내 GFP 및 루시퍼라제 발현을 검사하는 것이 중요합니다. 또한 빈 웰은 배경을 뺀 데 사용됩니다.
5. GFP+ Luc+ 세포에 쥐 주입하기
- 5 × 106 (MCF-7 및 MDA-MB-468) 또는 2 × 106 (MDA-MB-231) GFP+ Luc+ 세포를 각각 200 μL 또는 100 μL PBS 내로 옮긴다.
- 주사하기 전에 멸균 된 생물학적 후드를 5 % 소독제 용액으로 청소 하십시오 (자료 표 참조). 이어서, 마우스를 2-3분 동안 1 L/min의 기류 속도로 4% 이소플루란을 함유하는 여과된(0.2 μm) 공기로 마취시킨다.
주: 적절한 마취를 확인하는 것이 필수적입니다. 마우스의 발가락을 꼬집고 어떤 반응을 찾으십시오. - 마취 된 마우스 머리 위에 원뿔을 수핀 위치에 놓습니다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 수의사 연고를 눈에 바르십시오.
- 면봉을 사용하여 에탄올로 유선의 위 마우스의 복부 부위를 닦고 포셉으로 4번째 유선을 들어 올립니다.
- 바늘 27 G x 3/4 (0.4 x 19 mm)를 지방 패드 아래에 넣고 세포 현탁액 100 μL를 천천히 주입하십시오.
참고: 피부 아래에 둥근 팽창이 나타납니다. 또한, 부적절한 주사는 동일한 실험군에서 종양 성장 속도 또는 종양의 부재에 편차를 초래할 수 있다. - 주사 절차가 끝나면 마우스를 후드에서 꺼내 새 케이지로 옮깁니다. 그들이 의식으로 돌아갈 때까지 생쥐를 모니터링하십시오.
주: 사용된 바늘과 주사기가 모두 날카로운 상자에 버려졌는지 확인하십시오.
6. GFP+ Luc+ 마우스의 루시퍼라제 수준 측정
- 생체 발광 검출 전에 왼손으로 목을 잡고 의식이있는 마우스를 억제하십시오. 그런 다음 손을 왼쪽으로 기울이면 마우스가 위쪽으로 향하게되고 하체가 수핀 위치에 있습니다.
- 바늘 크기가 27G x 3/4(0.4 x 19mm)인 1.0 mL 주사기를 사용하여 왼쪽 아래 복부 사분면의 마우스 복부 표면에 복강내(i.p.) 루시페린(30mg/mL) 100μL를 주입합니다.
참고 : 바늘 끝은 내장 장기에 침투 할 수 있으므로 복벽에서 3-5mm 이상 삽입해서는 안됩니다. 또한, 마취 된 마우스의 체내에서 루시페린 분포가 의식이있는 마우스보다 느리기 때문에 마취없이 i.p. 주사를 수행하는 것이 좋습니다. 따라서, 의식이있는 마우스에서 루시퍼라제 수준을 모니터링하는 것이 더 빠른 절차입니다. - 마우스를 마취 없이 7분 동안 유지한 다음, 종양 동역학을 측정하기 전에 마취 챔버 내에서 3분 동안 유지하였다.
참고 : 배양 시간은 실험, 세포주 및 종마다 다릅니다. 따라서 실험을 시작하기 전에 배양 시간을 교정하는 것이 좋습니다. - 단계 5.2-5.3에 기재된 바와 같이 마우스를 마취시킨다.
- 인큐베이션 중에 소프트웨어(재료 테이블)를 열고 이미징 시스템을 초기화한 다음 초기화 버튼을 클릭합니다.
참고 : 카메라가 식히고 -90 °C에 도달하는 데 ~ 10 분이 걸립니다. 추가적으로, 배경 대조군으로서, 순진한 마우스(즉, 루시퍼라제 유전자를 발현하지 않는 세포를 주입한 GFP+ 마우스)에서 루시퍼라제 수준을 측정한다. - 다음 설정을 사용하여 자동 노출 설정을 유지하십시오 : 노출 시간 자동, 60 초; 비닝 매체, F / 정지 1; 차단된 여기 필터; 방출 필터가 열려 있습니다. 초기화 가 끝나면 이미징 마법사를 선택| 생체 발광을 클릭하고 다음 |를 클릭하십시오. 필터 | 열기 이미지 제목에서 마우스 를 선택합니다.
- 필드 뷰에서 스테이지 C(10cm)와 피사체 높이: 1.50cm를 선택합니다.
- 이미지 설정 스테이지를 C로 클릭하고 획득 버튼을 클릭하기 전에 마우스가 적절한 수핀 위치의 스테이지에 배치되어 있는지 확인합니다.
- 도어를 닫고 획득 단추를 클릭한 다음 이미지가 화면에 나타날 때까지 기다립니다.
참고: 자동 노출 옵션을 사용하면 신호에 따라 강한 신호가 5-20초가 걸립니다. 약한 신호는 약 60 초가 소요됩니다. - 다른 마우스에 대해 이 단계를 반복합니다.
- 폐 전이를 감지하려면 두꺼운 검은 판지 종이를 사용하여 원발성 종양의 강한 신호를 덮고 폐의 복부 측면 만 카메라 쪽으로 노출시킵니다. 위에서 설명한 것과 동일한 매개 변수를 사용하여 이미지를 캡처합니다.
7. 생체 발광 및 형광을 이용한 생체 외 이미지 획득
- 데시케이터에서 이산화탄소(CO2) 흡입을 사용하여 마우스를 안락사시키고 오토클레이브 가위와 포셉을 사용하여 마우스를 해부한다.
- 0.9% 식염수를 사용하여 마우스를 관류시키고, 장기를 수확하고, 1x PBS로 헹구어 장기로부터 혈액 얼룩을 제거한다.
- 헹굼 된 장기를 페트리 접시에 옮겨 생체 발광 기계의 무대에 놓습니다. 단계 6.2-6.6에 설명된 것과 동일한 생체발광 설정을 적용한다.
참고: 루시퍼라아제 신호의 감소로 인해 이 단계는 시간 제한이 있습니다. 따라서, 마우스를 안락사시킨 후, 즉시 생체 발광에 의해 장기를 시각화한다. - GFP 이미지의 경우, 생체 발광 대신 형광 GFP 필터를 사용하여 단계 6.3에서 설명한 것과 동일한 설정을 적용합니다.
- 스테레오 현미경을 사용하여 폐 이미지를 촬영하여 GFP+ 콜로니의 존재를 검사합니다.
8. 생체 발광 데이터 분석
- 소프트웨어를 두 번 클릭하고 파일 메뉴에서 열기를 선택합니다.
- 모든 파일을 열고 최소화하십시오. 모든 유닛이 래디언스(광자)인지 확인하십시오. 또한 모두에 적용을 클릭하여 모든 이미지에 대해 동일한 매개 변수를 유지합니다.
- 보기 메뉴에서 도구 팔레트를 선택하면 새 창이 열립니다.
- 도구 팔레트 창에서 ROI 도구 탭을 선택하고 유형에서 평균 Bkg ROI를 선택합니다.
- ROI 도구에서 원을 선택하고 마우스의 흉부 영역에 작은 원을 그립니다.
- 원을 두 번 클릭하고 백그라운드 ROI 탭에서 향후 ROI를 위해 BKG로 사용 옵션을 선택한 다음 완료를 클릭합니다.
9. 총 플럭스 측정
- 공구 팔레트 창에서 ROI 도구 탭을 선택하고 유형에서 ROI 측정을 선택합니다.
- ROI 도구에서 원을 선택하고 마우스의 원발성 종양에 큰 원을 그립니다.
- ROI 복사를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 ROI 붙여넣기를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 각 마우스의 모든 개별 파일에 넣습니다.
- ROI 도구 탭에서 ROI 측정을 클릭하면 ROI 측정이라는 새 창이 열립니다. 이 탭에서 측정 유형을 광도(광자)로, 이미지 속성을 모든 채워진 값으로 유지합니다.
- 파일을 측정 파일 (*.txt) 또는 Csv(*.csv) 형식으로 내보냅니다.
- 스프레드시트에서 내보낸 데이터를 열고 총 플럭스(p/s) 와 주 값을 가져옵니다.
참고: 이 단계는 다른 그룹을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어 , 비히 클로 치료받은 마우스와 약물로 치료받은 마우스. - 시간이 Y축을 따라 X축과 총 플럭스(p/s)를 따라 표시되는 XY 플롯을 생성합니다. 매주 각 표본 그룹에 대한 총 플럭스(p/s) 매개 변수를 취하고 비모수 스튜던트 t-검정을 사용하여 유의한 차이를 확인합니다.
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결과
우리는 GFP 및 루시퍼라제 벡터를 발현하는 유방암 세포주 (MDA-MB-231, MCF-7 및 MDA-MB-468)를 생성하였다. 구체적으로, 이것은 순차적 감염에 의해 달성되었다. 먼저, 유방암 세포주를 형광 GFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 감염시켰다. GFP 양성 세포(GFP+)를 감염 2일 후(도 1A, B) 분류하고 pLX304 루시페라제-V5 벡터에 감염시켰다. 이어서, 블라스티시딘을 사용하여 루시퍼라아제를 선택하여 지시된 (GFP+, Luc+) 세포를 생성하였다. 시험관내 루시퍼라제 활성을 검증하기 위해, 루시퍼라제 활성 수준의 세포 수 의존적 증가를 입증하였다(도 1C). 또한, 루시퍼라제 활성과 세포 수 사이에 선형 상관관계가 발견되었다(도 1D...
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토론
동물 기반 실험은 암 연구 7,8,9에 필수적이며, 실제로 많은 프로토콜이 개발되었습니다 3,6,10,11,12,13,14. 그러나, 이들 연구의 대부분은 실험의 끝에서만 생물학적 효과를 결정하고, 따라서 종양 성장 동역학 또는 전이 콜로니화에 대한 영향은 결정되지 않은 채로 남아있다. 여기서, 우리는 GFP 및 루시퍼라아제를 발현하는 세포를 유방...
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공개 사항
모든 저자는 이해 상충이 없다고 공개했습니다.
감사의 글
Y.D.S. 연구소 회원들에게 감사드립니다. 예루살렘 하다사 메디컬 센터(Hadassah Medical Center)에 있는 Wohl Institute for Translational Medicine에 작은 동물 영상 시설을 제공해주신 것에 대해 감사드립니다. 이 연구는 이스라엘 암 연구 기금 (Israel Cancer Research Fund)의 연구 경력 개발 상 (Research Career Development Award) 의 지원을 받았다.
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