여기서 우리는 원발성 마우스 간 정현파 내피 세포 (LSEC) 분리를위한 프로토콜을 개략적으로 설명하고 시연합니다. 이 프로토콜은 간 콜라게나제 관류, 저속 원심분리에 의한 비실질 세포 정제 및 CD146 마그네틱 비드 선택을 기반으로 합니다. 우리는 또한 표현형과 유세포 분석기 및 주사 전자 현미경을 사용하여 이러한 분리 된 LSEC를 특성화합니다.
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이 논문에서
요약
초록
간 정현파 내피 세포 (LSECs)는 순환과 간 실질 사이의 계면에 위치한 특수 내피 세포입니다. LSECs는 fenestrae의 존재와 기저막의 부재를 특징으로하는 뚜렷한 형태를 가지고 있습니다. LSEC는 대사 조절 장애, 염증, 섬유증, 혈관 신생 및 발암을 포함하여 간에서 많은 병리학 적 장애에서 필수적인 역할을합니다. 그러나 LSEC의 격리 및 특성화에 대해서는 거의 발표되지 않았습니다. 여기에서, 이 프로토콜은 건강한 및 비알콜성 지방간 질환(NAFLD) 마우스 둘 다로부터 LSEC의 분리에 대해 논의한다. 이 프로토콜은 마우스 간 및 자기 비드의 콜라게나제 관류에 기초하여 LSECs를 정제하기 위한 비실질 세포의 양성 선택이다. 이 연구는 유세포 분석기에 의해 특정 마커를 사용하여 LSEC를 특성화하고 주사 전자 현미경으로 특징적인 표현형 특징을 식별합니다. 이 프로토콜에 따라 분리된 LSEC는 접착 및 투과성 분석을 포함한 기능적 연구뿐만 아니라 관심 있는 특정 경로에 대한 다운스트림 연구에 사용될 수 있습니다. 또한, 이들 LSEC는 개별적으로 풀링되거나 사용될 수 있으며, RNA-seq 벌크 또는 단일 세포, 프로테오믹 또는 포스포-프로테오믹스, 시퀀싱(ATAC-seq)을 이용한 트랜스포제-접근 가능한 크로마틴에 대한 어세이 등을 포함하는 다중 오믹스 데이터 생성을 가능하게 한다. 이 프로토콜은 LSEC가 건강 및 질병에서 다른 간 세포와의 통신을 연구하는 조사관에게 유용하며 급성 및 만성 간 손상의 병원성 메커니즘에서 LSEC의 역할에 대한 심층적 인 이해를 가능하게합니다.
서론
간 정현파 내피 세포 (LSECs)는 간 정현파 벽을 따라 늘어서 있으며 간에서 가장 풍부한 비 실질 세포입니다1. LSECs는 fenestrae의 존재와 고전적인 기저막 또는 횡격막 2,3의 부족에 의해 신체의 다른 모세관 내피 세포와 구별됩니다. 따라서 LSEC는 지질 및 지단백질을 포함한 다양한 순환 거대 분자를 제거하기 위해 투과성과 내시성 능력을 향상시키는 독특한 표현형 및 구조적 특성을 가지고 있습니다. LSECs는 실질 세포와 비실질 세포, 예컨대 성상 세포 및 면역 세포 사이의 누화에서 중추적인 역할을 한다. LSECs는 성상 세포와 쿠퍼 세포를 정지 상태로 유지함으로써 간 항상성을 유지하는 데 중요합니다4. LSECs는 순환하는 백혈구 5,6의 부착 및 내피 이동을 매개함으로써 간 면역 세포 집단의 조성을 조절한다. 허혈-재관류 손상(IRI)8, 비알콜성 지방간염(NASH)9 및 간세포암(HCC)을 ....
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프로토콜
동물 프로토콜은 Mayo Clinic의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받아 수행되었습니다. 여덟 주령의 C57BL/6J 수컷 마우스를 잭슨 연구소에서 구입하였다. 마우스는 온도 조절 12:12-h 밝은-어두움 사이클 시설에 수용되어 식이요법에 자유롭게 이용할 수 있었다.
1. 콜라겐 코팅 배양접시 또는 접시의 제조
- 0.02 mol/L 아세트산 50 mL를 만들려면H2O49.4 mL에 빙초산 0.6 mL를 첨가한다.
- 0.02 mol / L 아세트산에 50 μg / mL 콜라겐 유형 I을 만드십시오. 희석은 로트의 농도에 달려 있습니다.
- 10cm 배양 접시에 콜라겐 용액 3mL를 코팅하십시오. 실온 (RT)에서 1 시간 동안 인큐베이션한다.
참고 : 배양을 위해 다른 접시 또는 접시를 사용하는 경우 배양 면적에 따라 코팅 용액의 부피를 조정해야하며 일반적으로 6-10 μg /cm2를 사용하십시오. - 코팅된 표면으로부터 과량의 유체를 제거하고, 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 3회 세척한다. 접시가 공기 건조되도록 허용하십시오.
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결과
실험 회로도 및 장비 설정 :
이 프로토콜에서, 마우스 간을 폐쇄 관류 회로를 사용하여 소화시킨 다음, 비실질 세포 및 간세포를 2분 동안 50 x g 에서 저속 원심분리에 의해 분리하였다. 일차 LSECs는 비실질 분획으로부터 선별된 CD146 자기 비드를 사용하여 단리하였다. 실험 회로도를 도 1A에 나타내었다. 캐뉼러를 PV를 통해 배치하고, 열등한 베나 카바는 간을 통한 콜라게나제의 단방향 관류를 보장하기 위해 묶었다(도 1B). 사내 관류 챔버에는 37-40 °C의 따뜻하고 가습 된 장치 공기를 보장하기 위해 가열 및 가습 시스템이 장착되어 있습니다. 관류된 콜라게나제는 폐쇄된 시스템을 통해 순환하며, 격리 하루 동안 두세 마리의 마우스에 재사용되어 단리를 보다 비용 효율적으로 만들 수 있다.
유세포.......
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토론
현재 원고에서, 우리는 두 단계 콜라게나제 관류 및 후속 자기 활성화 세포 분류 (MACS)로 구성된 마우스 간으로부터의 LSEC 분리를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 다음의 세 단계로 구성된다: (1) 칼슘이 없는 완충액으로 PV를 통한 관류, 이어서 간세포 분산을 달성하기 위한 콜라게나제 함유 완충액; (2) 저속 원심분리를 통한 간세포의 배제; 및 (3) 항-CD146 자기 비드를 사용하는 비실질 세포 (NPCs)로부터의 LSECs의 MACS-기반 양성 선택. 전체 절차는 3 시간 이내에 완료 될 수 있습니다. 또한 모든 소모품 공급을 포함하여이 절차의 비용은 마우스 당 약 150 USD이며,이 LSEC 분리 방법이 전반적으로 효율적이고 비용 효율적임을 시사합니다. 우리는 1 차 마우스 간세포의 분리를 위해 단계 (1)과 (2)를 사용하며, 이는 현재 원고의 범위를 벗어납니다.
문맥 캐뉼레이션 및 간 관류에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다 : (i) 카테터 위치.......
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공개 사항
모든 저자는 공개 할 충돌이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 NIH의 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환의 국립 연구소 (1RO1DK122948 내지 SHI)와 NIH Silvio O. Conte 소화기 질환 연구 핵심 센터 P30 부여 메커니즘 (DK084567)에 의해 지원되었습니다. 일본 과학진흥회(JSPS) 해외연구펠로우십에서도 KF에 지원을 제공받았다. 우리는 또한 Gregory J. Gores 박사와 Steven Bronk 박사가 콜라게나제 관류 장치의 원래 설계 및 최적화에 대해 인정하고 싶습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2.0인치 20 G 정맥 내 (IV) 카테터 | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
| 2– 중앙에 구멍이 있는 3인치 향수 트레이 | 맞춤형; 집에서 제작 | ||
| &아틸데; 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
| BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
| CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
| Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
| Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
| Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
| 내피 세포 성장 배지 | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
| FcR 차단 시약, 마우스 | Miltenyi, Bergisch Gladbach, 독일 | 130-092-575 | |
| FlowJo 소프트웨어, 버전 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
| Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
| Heated (37 ° C) 및 10psi의 속도로 산소 주입이 장착된 가습 재순환 관류 장치. | 맞춤형; 자체 제작 | ||
| Hitachi S 4700 주사 전자 현미경 | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
| LS 컬럼 | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| MACS 사전 분리 필터 (70 μ m) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
| MACS 헹굼 버퍼 | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS Smart Strainer (70 μ m) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
| MACSQunt 유세포 분석기 | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
| 밀리셀 세포 배양 인서트 | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
| Nexcelom | bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
| Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
| 수술용 가위 | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
| Very small curved dressing typs | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |
참고문헌
- Morin, O., Goulet, F., Normand, C. Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes. Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).
- Ibrahim, S. H.
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재인쇄 및 허가
