마우스 일차 간 정현파 내피 세포의 분리 및 특성화

요약

여기서 우리는 원발성 마우스 간 정현파 내피 세포 (LSEC) 분리를위한 프로토콜을 개략적으로 설명하고 시연합니다. 이 프로토콜은 간 콜라게나제 관류, 저속 원심분리에 의한 비실질 세포 정제 및 CD146 마그네틱 비드 선택을 기반으로 합니다. 우리는 또한 표현형과 유세포 분석기 및 주사 전자 현미경을 사용하여 이러한 분리 된 LSEC를 특성화합니다.

초록

간 정현파 내피 세포 (LSECs)는 순환과 간 실질 사이의 계면에 위치한 특수 내피 세포입니다. LSECs는 fenestrae의 존재와 기저막의 부재를 특징으로하는 뚜렷한 형태를 가지고 있습니다. LSEC는 대사 조절 장애, 염증, 섬유증, 혈관 신생 및 발암을 포함하여 간에서 많은 병리학 적 장애에서 필수적인 역할을합니다. 그러나 LSEC의 격리 및 특성화에 대해서는 거의 발표되지 않았습니다. 여기에서, 이 프로토콜은 건강한 및 비알콜성 지방간 질환(NAFLD) 마우스 둘 다로부터 LSEC의 분리에 대해 논의한다. 이 프로토콜은 마우스 간 및 자기 비드의 콜라게나제 관류에 기초하여 LSECs를 정제하기 위한 비실질 세포의 양성 선택이다. 이 연구는 유세포 분석기에 의해 특정 마커를 사용하여 LSEC를 특성화하고 주사 전자 현미경으로 특징적인 표현형 특징을 식별합니다. 이 프로토콜에 따라 분리된 LSEC는 접착 및 투과성 분석을 포함한 기능적 연구뿐만 아니라 관심 있는 특정 경로에 대한 다운스트림 연구에 사용될 수 있습니다. 또한, 이들 LSEC는 개별적으로 풀링되거나 사용될 수 있으며, RNA-seq 벌크 또는 단일 세포, 프로테오믹 또는 포스포-프로테오믹스, 시퀀싱(ATAC-seq)을 이용한 트랜스포제-접근 가능한 크로마틴에 대한 어세이 등을 포함하는 다중 오믹스 데이터 생성을 가능하게 한다. 이 프로토콜은 LSEC가 건강 및 질병에서 다른 간 세포와의 통신을 연구하는 조사관에게 유용하며 급성 및 만성 간 손상의 병원성 메커니즘에서 LSEC의 역할에 대한 심층적 인 이해를 가능하게합니다.

서론

간 정현파 내피 세포 (LSECs)는 간 정현파 벽을 따라 늘어서 있으며 간에서 가장 풍부한 비 실질 세포입니다¹. LSECs는 fenestrae의 존재와 고전적인 기저막 또는 횡격막 ^2,3의 부족에 의해 신체의 다른 모세관 내피 세포와 구별됩니다. 따라서 LSEC는 지질 및 지단백질을 포함한 다양한 순환 거대 분자를 제거하기 위해 투과성과 내시성 능력을 향상시키는 독특한 표현형 및 구조적 특성을 가지고 있습니다. LSECs는 실질 세포와 비실질 세포, 예컨대 성상 세포 및 면역 세포 사이의 누화에서 중추적인 역할을 한다. LSECs는 성상 세포와 쿠퍼 세포를 정지 상태로 유지함으로써 간 항상성을 유지하는 데 중요합니다⁴. LSECs는 순환하는 백혈구 ^5,6의 부착 및 내피 이동을 매개함으로써 간 면역 세포 집단의 조성을 조절한다. 허혈-재관류 손상(IRI)⁸, 비알콜성 지방간염(NASH)⁹ 및 간세포암(HCC)을 포함하는 급성 및 만성 간 손상(⁷) 동안, LSECs는 기저막⁽¹⁰)의 탈지 및 형성을 특징으로 하는 모세관화로 알려진 표현형 변화를 겪는다. LSECs의 이러한 표현형 변화는 LSECs 기능 장애 및 전구혈전성, 전염증성 및 프로섬유형성 특성의 획득과 관련이 있다.

마우스 간으로부터 LSECs를 분리하기 위한 몇몇 방법이 개발되었다¹¹. 일부 기술은 비실질 및 실질 세포를 분리한 후 밀도 구배 원심분리를 통해 비실질 분획으로부터 LSEC를 정제하는 것에 의존한다. 이 방법의 한계는 LSEC 단리의 최종 단계에서 대식세포를 오염시키는 존재이며, 이는 단리된 LSEC(¹²)의 순도에 영향을 미칠 수 있다. 이 프로토콜은 마우스 간 콜라게나제 관류 및 CD146⁺ 자기 비드의 양성 선택에 기초하여 LSECs를 정제하기 위한 비실질 세포의 양성 선택이다. 이 방법을 사용하여 분리된 LSEC는 높은 순도와 보존된 형태학 및 생존력을 보여줍니다. 이러한 LSEC는 투과성 및 접착 분석뿐만 아니라 관심 경로에 대한 다운스트림 연구를 포함한 기능 연구에 최적입니다. 또한, 임상 연구 및 발견 과학 모두에서 큰 데이터 세트를 생성하는 것에 대한 관심이 증가함에 따라, 비알콜성 지방간염(NASH) 또는 기타 질환을 앓고 있는 건강한 간과 병든 간에서 분리된 이러한 고품질 LSEC를 개별적으로 풀링하거나 사용할 수 있어 다중 오믹스 데이터 생성 및 건강과 질병 간의 비교^13,14 . 또한, 단리된 LSEC는 LSEC에서 활성화된 신호전달 경로를 해독하고 다양한 유해한 자극 하에서 그리고 다양한 치료적 개입에 반응하여 다른 간세포와의 세포간 통신을 해독하기 위해 오가노이드와 같은 이차원 및 입체내 시험관내 모델을 개발하는 데 사용될 수 있다.

프로토콜

동물 프로토콜은 Mayo Clinic의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받아 수행되었습니다. 여덟 주령의 C57BL/6J 수컷 마우스를 잭슨 연구소에서 구입하였다. 마우스는 온도 조절 12:12-h 밝은-어두움 사이클 시설에 수용되어 식이요법에 자유롭게 이용할 수 있었다.

1. 콜라겐 코팅 배양접시 또는 접시의 제조

1. 0.02 mol/L 아세트산 50 mL를 만들려면_H2O49.4 mL에 빙초산 0.6 mL를 첨가한다.
2. 0.02 mol / L 아세트산에 50 μg / mL 콜라겐 유형 I을 만드십시오. 희석은 로트의 농도에 달려 있습니다.
3. 10cm 배양 접시에 콜라겐 용액 3mL를 코팅하십시오. 실온 (RT)에서 1 시간 동안 인큐베이션한다.
   참고 : 배양을 위해 다른 접시 또는 접시를 사용하는 경우 배양 면적에 따라 코팅 용액의 부피를 조정해야하며 일반적으로 6-10 μg /^cm2를 사용하십시오.
4. 코팅된 표면으로부터 과량의 유체를 제거하고, 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 3회 세척한다. 접시가 공기 건조되도록 허용하십시오.
5. 콜라겐 용액이 멸균되지 않은 경우, 멸균 조직 배양 후드에서 10분 동안 자외선(UV) 빛에 노출시켜 콜라겐이 코팅된 접시를 멸균한다.

2. 장비 설정

1. 도 1B와 같이 가열 및 가습된 재순환 관류 장치를 설치한다.
2. 관류 시스템을 5분 동안 10% 표백제를 사용하여 헹구고 또 다른 10분 동안 멸균수를 사용한다.
3. 콜라게나제 용액을 관류하기 전에 헹굼액을 가능한 한 많이 배출하십시오.
4. 콜라게나제 용액을 관류 시스템을 통해 주입하고( 도 1B에 도시된 바와 같이) 이를 37°C에서 예열한다. 속도 제어 다이얼에 표시된 대로 펌프 속도를 속도 1로 설정합니다(40mL/분과 같음).
5. 이 속도는 전체 절차에서 동일하게 유지하십시오. LSEC 분리 당일 동안 폐쇄 회로에서 실행되는 콜라게나제 용액을 재사용하십시오.
   참고: 펌프 속도는 LSEC의 생물학적 상태를 교란시킬 수 있는 기계적 압력을 피하기 위해 1로 고정됩니다.

3. 수술 절차

1. 마우스의 무게를 재십시오.
2. 케타민 90 mg / kg 체중과 자일라진 10 mg / kg 체중을 복강 내 주사하십시오 (IP).
3. 마우스가 고통스러운 자극에 반응하지 않으면 그림 1B와 같이 마우스를 수술 표면에 고정시킵니다.
4. 마우스 복부에 70 % 에탄올을 뿌리십시오. 외과 용 가위를 사용하여 복부의 아래 부분부터 xiphoid 과정까지 ~ 5cm 길이의 절개를하십시오.
5. 다음으로, 복부의 양쪽에있는 작은 홍채 가위를 사용하여 복부 장기를 완전히 노출시키는 두 개의 측면 절단을하십시오.
6. 정맥 주사 (IV) 카테터의 외피를 동물의 등 아래에 두어 복부를 들어 올리고 평평하게하십시오.
7. 규칙적인 곡선 드레싱 포셉을 사용하여 창자와 위를 동물의 왼쪽으로 부드럽게 당깁니다.
8. 5-0 수술 봉합사를 노출 된 왼쪽 신장 바로 아래의 열등한 정맥 카바 (IVC) 아래에 놓습니다. 봉합사에 느슨한 히치를 묶으십시오.
9. 또 다른 5-0 수술 봉합사를 간 포털 정맥 (PV) 주위에 놓고 간 PV에서 비장 정맥 분기점 바로 위에 놓습니다. 봉합사에 느슨한 히치를 묶으십시오.
10. PV 봉합사를 장력으로 사용하여 20 G IV 카테터를 1cm 아래의 간 PV에 삽입하여 좌우 간 PV로 분기합니다.
11. 카테터를 정맥 위로 밀어 올리지만 분기 영역 아래에 두십시오. 혈액이 물방울이 떨어지기 시작할 때까지 카테터 아래로 이동하게하십시오.
12. 수술 영역 위에 위치한 정맥 내 (IV) 병에 완충액 A (표 1) 중 일부를 넣고 IV 라인을 사용하여 카테터에 부착하십시오. 시스템에 공기 유입을 피하면서 이 용액으로 간을 씻어내십시오.
13. 신장 아래의 열등한 정맥 카바 주위의 봉합사를 묶으십시오. 이것은 간이 복고풍 퍼퓨즈를 할 수있게 해줍니다.
14. IVC를 봉합사 아래로 잘라 동물이 피를 흘릴 수 있도록하십시오.
    참고 :이 단계는 간 혼잡을 피하기 위해 신속하게 수행되어야합니다.
15. IV 카테터를 PV 봉합사로 고정하십시오.
16. 일단 관류하면 위장, 창자, 비장 및 간장에 붙어있는 다른 찌꺼기를 잘라냅니다.
17. 횡격막과 흉강에서 주요 혈관을 잘라냅니다. 동물에서 간을 제거하고 관류 트레이에 놓습니다.
18. 조심스럽게 IV 라인을 제거하고 재순환 챔버에서 콜라게나제 용액을 연결하십시오.
    참고: 3.16-3.18단계는 5분 이내에 수행해야 하므로 간이 완충액 A로 너무 오래 관류되지 않도록 주의하십시오. 간으로 기포가 들어가지 않도록 주의하십시오.
19. 캡슐이 얼룩덜룩 해지고 끈적 끈적하게 보일 때까지 간이 관류하도록하십시오 (10-15 분 이상, 콜라게나제의 다른 제트에 따라 기간이 다릅니다).
20. 간이 관류하는 동안, 부검 가방에 넣기 전에 동물이 죽었는지 확인하십시오.
21. 소화가 끝나면 챔버에서 간을 제거하고 약 20mL의 무혈청 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)가있는 10cm 페트리 접시에 넣으십시오.
22. 두 개의 피펫 팁으로 간을 부드럽게 떼어 내고 담즙 나무를 버리십시오.
23. 간 현탁액을 70 μm 세포 스트레이너를 통해 50 mL 원뿔형 튜브로 여과한다.
24. 세포 현탁액을 RT에서 2분 동안 50 x g 에서 원심분리한다. 비실질 간 세포를 함유하는 상층액을 수집한다.
    참고: 간세포는 펠릿 내에 침전되며, 이는 앞서 기술된 바와 같이 구배 원심분리를 사용하여 추가로 정제될 수 있다¹⁵.

4. 비실질간세포와 LSECs 정제의 분리

참고: 제조 지침에 따라 면역자기 비드를 사용하여 CD146⁺ LSEC를 정제하십시오.

1. 상층액을 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리한다.
2. 세포 펠릿을 수집하고 1 mL의 분리 완충액에 재현탁시키고(표 1), 제조자의 지시에 따라 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 번호를 결정한다.
3. 세포 현탁액을 4°C에서 10분 동안 300 x g 에서 원심분리하고, 상청액을 완전히 흡인한다.
4. 펠렛을 총 세포 10,7개당 90 μL의 분리 완충액으로 재현탁시킨다.
5. 총 세포 10,7개당 10μL의 CD146 마그네틱 비드^를 첨가한다. 잘 섞어서 4°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.
6. 세포를 세척하기 위해, 10⁷ 세포 당 1-2 mL의 분리 완충액을 첨가하고, 300 x g 에서 10분 동안 원심분리한 다음, 상청액을 완전히 흡인시킨다.
7. 최대 10개의^9개 세포를 500 μL의 분리 완충액에 재현탁시킨다(표 1).
   참고: 셀 번호가 높을수록 버퍼 볼륨을 적절하게 확장하십시오.
8. 분리 컬럼을 준비하고 3 mL의 분리 버퍼로 헹구십시오.
9. 세포 현탁액을 70 μm 예비 분리 필터로 적층된 컬럼 상에 적용한다.
10. 컬럼을 3 mL의 분리 완충액으로 3회 세척한다.
    참고: 컬럼을 세척할 때 컬럼 저장소가 비어 있는 즉시 분리 버퍼를 추가해야 합니다.
11. 분리기에서 컬럼을 제거하고 15 mL 원심분리 튜브 상에 놓는다. 5 mL의 분리 완충액을 컬럼 상에 피펫팅한다.
12. 자성 비드가 표지된 세포를 회수하려면 플런저를 컬럼으로 단단히 밀어 세포를 플러시합니다.
13. 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리기. LSECs는 현미경 검사 및 하류 분석을 위해 준비된다.

5. LSECs 면역표현형 및 유세포측정에 의한 순도 평가

1. 제조업체의 지침에 따라 자동 셀 카운터를 사용하여 분리된 LSEC의 세포 번호를 확인합니다.
2. 세포를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 완전히 흡인시킨다.
3. 1 x 10⁶ 세포/튜브를 취하여 90μL의 염색 완충액으로 재현탁하십시오(표 1).
4. 마우스 FcR 블록 10 μL/튜브 및 1 μL의 생존력 염료를 첨가하고, 4°C에서 10분 동안 인큐베이션한다.
5. 세포를 염색 완충액으로 1:50에 희석된 CD45, CD146 및 스타빌린-2 항체의 조합으로 착색시킨다. 4°C에서 20분 동안 인큐베이션한다.
6. 세포를 5 mL의 염색 완충액으로 세척하고, 300 x g 에서 10분 동안 원심분리한 다음, 상청액을 완전히 흡인시킨다.
7. 세포를 300 μL의 염색 완충액으로 재현탁시키고 유세포 분석기를 통해 실행한다.

6. LSEC의 문화와 시험

1. 시드 1 x 10 6 세포/웰을⁶ -웰 플레이트에 넣고 5% 태아 소 혈청(FBS), 1% 내피 세포 성장 보충제 및 1% 프리모신 용액으로 구성된 내피 세포 성장 배지로 배양합니다.
2. 분리된 LSEC를 광 현미경으로 검사합니다. 10x 배율로 밝은 필드 이미지를 획득하십시오.

7. 주사 전자 현미경에 의한 LSECs 형태학 및 fenestrae 검사

1. 세포 배양 인서트(3 μm 공극 크기)를 콜라겐 용액으로 미리 코팅한다.
2. 단리된 LSECs(120,000 세포)를 내피 세포 성장 배지와 함께 삽입하여 37°C의 가습 분위기에서 24-웰 플레이트에서 배양하였다. 세포가 정착하고 2 시간 동안 부착되도록하십시오.
3. 세포 고정을 위해, 37°C에서 예열된 트럼프의 고정제의 등가 부피를 세포 배양 배지에 첨가한다.
4. 10 분 동안 배양 한 후, 희석 된 50 % 희석 된 트럼프의 고정제를 희석되지 않은 트럼프의 고정제로 대체하십시오.
5. 세포를 트럼프 고정제에서 2 시간 동안 고정시킨 다음, 1 % 오스뮴 테트록사이드에서 1 시간 동안 인큐베이션한다.
6. 샘플 탈수, 임계점 건조 장치에서 건조, 장착, 스퍼터 코팅 및 주사 전자 현미경을 사용한 검사를 진행하십시오.

결과

실험 회로도 및 장비 설정 :
이 프로토콜에서, 마우스 간을 폐쇄 관류 회로를 사용하여 소화시킨 다음, 비실질 세포 및 간세포를 2분 동안 50 x g 에서 저속 원심분리에 의해 분리하였다. 일차 LSECs는 비실질 분획으로부터 선별된 CD146 자기 비드를 사용하여 단리하였다. 실험 회로도를 도 1A에 나타내었다. 캐뉼러를 PV를 통해 배치하고, 열등한 베나 카바는 간을 통한 콜라게나제의 단방향 관류를 보장하기 위해 묶었다(도 1B). 사내 관류 챔버에는 37-40 °C의 따뜻하고 가습 된 장치 공기를 보장하기 위해 가열 및 가습 시스템이 장착되어 있습니다. 관류된 콜라게나제는 폐쇄된 시스템을 통해 순환하며, 격리 하루 동안 두세 마리의 마우스에 재사용되어 단리를 보다 비용 효율적으로 만들 수 있다.

유세포...

토론

현재 원고에서, 우리는 두 단계 콜라게나제 관류 및 후속 자기 활성화 세포 분류 (MACS)로 구성된 마우스 간으로부터의 LSEC 분리를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 다음의 세 단계로 구성된다: (1) 칼슘이 없는 완충액으로 PV를 통한 관류, 이어서 간세포 분산을 달성하기 위한 콜라게나제 함유 완충액; (2) 저속 원심분리를 통한 간세포의 배제; 및 (3) 항-CD146 자기 비드를 사용하는 비실질 세포 (NPCs)로부터의 LSECs의 MACS-기반 양성 선택. 전체 절차는 3 시간 이내에 완료 될 수 있습니다. 또한 모든 소모품 공급을 포함하여이 절차의 비용은 마우스 당 약 150 USD이며,이 LSEC 분리 방법이 전반적으로 효율적이고 비용 효율적임을 시사합니다. 우리는 1 차 마우스 간세포의 분리를 위해 단계 (1)과 (2)를 사용하며, 이는 현재 원고의 범위를 벗어납니다.

문맥 캐뉼레이션 및 간 관류에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다 : (i) 카테터 위치...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2.0인치 20 G 정맥 내 (IV) 카테터	Terumo, SOmerset, NJ, USA	SR-OX2051CA
2– 중앙에 구멍이 있는 3인치 향수 트레이	맞춤형; 집에서 제작
&아틸데; 488	MBL International, Woburn, MA, USA	D317-A48
BSA stock	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-376
Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-118-407
CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-007
Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-110-803
Collagen type I	Corning, Corning, NY, USA	354236
Collagenase II	Gibco, Waltham, MA, USA	17101-015
내피 세포 성장 배지	ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA	211-500
FcR 차단 시약, 마우스	Miltenyi, Bergisch Gladbach, 독일	130-092-575
FlowJo 소프트웨어, 버전 10.6	Becton, Dickinson and Company
Hardened Fine scissors	F.S.T, Foster city, CA, USA	14091-11
Heated (37 ° C) 및 10psi의 속도로 산소 주입이 장착된 가습 재순환 관류 장치.			맞춤형; 자체 제작
Hitachi S 4700 주사 전자 현미경	Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA	SEM096
LS 컬럼	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-401
MACS 사전 분리 필터 (70 μ m)	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-095-823
MACS 헹굼 버퍼	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-222
MACS Smart Strainer (70 μ m)	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-098-462
MACSQunt 유세포 분석기	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany
밀리셀 세포 배양 인서트	Millipore Sigma, Burlington, MA, USA	PITP01250
Nexcelom	bioscience, Lawrence, MA, USA	Cellometer Auto T4 Plus
Percoll	GE Healthcare, Chicago, IL, USA	17-0891-01
수술용 가위	F.S.T, Foster city, CA, USA	14001-12
Very small curved dressing typs	F.S.T, Foster city, CA, USA	11063-07