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방법 논문

병아리 배아에서 인간 줄기 세포 스페로이드의 거동을 조사하기 위한 무표지 이종이식 모델

1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/63067

⸱

2021년 10월 15일

 , 
1Morphological Sciences Program, Biomedical Sciences Institute, Federal University of Rio de Janeiro, 2Department of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology

이 논문에서

요약

여기에서는 인간 세포 스페로이드를 병아리 배아에 이식하고 식별하는 방법을 설명합니다. 이 이종이식 모델은 배아 미세환경을 세포 이동, 분화 및 열대성을 분석하기 위한 교육 신호의 소스로 사용하며 특히 1차 및/또는 이종 세포 집단 연구에 적합합니다.

초록

이종이식편은 in vivo에서 인간 세포의 행동을 조사하는 데 유용한 방법입니다. 특히, 배아 환경은 성체 이종이식 모델에는 종종 없는 고유한 지시 신호와 생식층 정체성을 통해 세포 이동, 분화 및 형태 형성에 대한 단서를 제공합니다. 또한, 배아 모델은 자가 조직과 비자기 조직을 구별할 수 없기 때문에 이식편에 대한 거부 반응의 위험과 숙주의 면역 억제의 필요성을 제거합니다. 본 논문은 인간 세포의 스페로이드를 닭 배아에 이식하는 방법을 제시하는데, 닭 배아는 접근이 용이하고 조작이 가능하며 37°C에서 발달합니다.

스페로이드는 이식을 위해 배아의 특정 영역을 선택할 수 있도록 합니다. 이식 후 세포는 숙주 조직에 통합되어 이동, 성장 및 분화를 추적할 수 있습니다. 이 모델은 이질적인 일차 세포 집단 및 암세포를 포함한 다양한 부착 집단을 활용할 수 있을 만큼 충분히 유연합니다. 이전 세포 라벨링의 필요성을 피하기 위해 인간 특이적 Alu 프로브의 혼성화를 통한 기증자 세포 식별을 위한 프로토콜도 설명되며, 이는 이질적인 세포 집단을 조사할 때 특히 중요합니다. 또한 DNA 프로브는 다른 공여자 종을 식별하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 스페로이드를 준비하고, 닭 배아에 이식하고, 파라핀 절편을 위해 조직을 고정 및 처리하고, 최종적으로 DNA in situ hybridization을 사용하여 인간 세포를 식별하는 일반적인 방법을 설명합니다. 제안된 대조군, 결과 해석의 예 및 분석할 수 있는 다양한 세포 거동이 이 방법의 한계 외에도 논의될 것입니다.

서론

이종이식편은 in vivo에서 인간 세포의 행동을 조사하는 데 유용한 도구입니다. 이러한 모델은 인간 줄기세포의 생물학1, 실시간 세포 현상 관찰2, 종양 혈관 신생 및 전이 조사3 와 같은 광범위한 과학 주제에 대한 귀중한 정보를 제공했습니다. 또한, 환자 특이적 이종이식편의 종양 형성을 포함한 암 생물학의 여러 측면이 연구되었습니다 4,5. 이러한 각 이종 이식 모델에는 장단점이 있으므로 각 모델은 특정 과학적 질문에 더 적합합니다. 병아리 배아는 외과적 조작이 가능한 접근 가능한 양수 모델이기 때문에 인기 있는 발달 생물학 모델입니다. 이종 이식편을 통해 연구자들은 정확한 운명 지도6를 만들거나 형질이 세포 자율적인지 아니면 환경에 의해 지시되는지를 탐구할 수 있었다 7,8. 유사한 이론적 근거로 병아리 배아를 인간 세포의 행동을 연구하기 위한 이종 이식 모델로 사용할 수 있습니다.

배아 환경은 이동 및 분화 신호뿐만 아니라 세포-세포 상호 작용을 통해 조직 형태 형성을 적극적으로 조율합니다. 따라서, 성체 이종이식 모델과 비교하여, 배아는 예를 들어, 성체 줄기세포 틈새(예: BMP, WNT, NOTCH,SHH 9)에 존재하는 신호를 모방함으로써 이식된 세포의 거동을 분석하기 위한 보다 유익한 환경을 제공합니다. 또한, 초기 발달 기간 동안 적응면역 체계가 없기 때문에 면역 반응이나 기증자 조직의 거부 반응의 위험 없이 이종이식을 수행할 수 있습니다10. 이전 연구에서는 이러한 목적으로 인간 세포를 닭 배아에 이종 이식하는 방법을 조사했습니다. 인간 줄기세포의 신경인성 잠재력은 배아 줄기세포(embryonic stem cell)12 및 유도만능 줄기세포(13)를 배아(embryo)에 통합하는 것 외에도 신경관 또는 혈관(11)에 주입한 후 분석되었다. 인간 흑색종 세포는 또한 병아리의 배아 환경을 사용하여 연구되었는데, 이를 통해 종양 형성과 신경능선 세포(neuro crest cell)의 행동 사이의 연관성이 밝혀졌습니다14, 그리고 배아의 정보로 종양 세포를 재프로그래밍하는 것15. 이 논문은 인간 1차 및 이종 세포 집단의 행동을 연구하는 데 특히 적합한 프로토콜에 대해 설명합니다.

지난 수십 년 동안 다양한 조직의 기질 구성 요소는 전구 세포/줄기 세포의 자가 공급원으로 연구되었으며 이전에는 "중간엽 줄기 세포"로 알려진 혈관 형성 및 면역 조절 특성으로 연구되었습니다16,17,18. 특성화할 이러한 세포 집단 중 첫 번째는 골수 기질/줄기세포 집단(BMSC)으로, 골수, 지방 및 그보다 덜하지만 생체 내 연골 생성 잠재력을 가지고 있습니다 19,20. 지방 유래 기질 세포(ADSC)는 지흡인 또는 피부지방 절제술 샘플의 효소 분해에 의해 얻어진 이질적인 집단이며, 그 후 기질-혈관 분획(SVF)의 분리와 최종적으로 배양에서의 확장에 의해 얻어진 이질적인 집단이다21. 배양에서 이러한 세포는 CD90, CD73, CD105 및 CD44와 같은 다른 중간엽 집단과 공유되는 마커, CD36과 같은 고유 마커 및 조혈(CD45) 또는 내피(CD31) 마커의 부재에 의해 표현형적으로 특성화됩니다22. 또한, ADSC는 in vitro에서 골형성 전위(osteo-ogenic potential), 아디포(adipo) 및 연골형성 전위(chondrogenic potential)를 가지고 있으며, 이 집단의 줄기세포/전구세포의 수는 섬유아세포성 집락형성단위(CFU-F) 분석22에 의해 정의될 수 있다. 생체 내에서, ADSC 표현형을 가진 세포는 기질23 및/또는 혈관 주위24 구획에 존재하는 것으로 보고되었습니다. 체외 배양 후 마커를 공유함에도 불구하고 서로 다른 조직의 기질 구획은 주어진 기관의 고유한 특성을 반영하며 이러한 세포 집단은 출처에 따라 뚜렷한 특성을 갖는다는 것이 점점 더 분명해지고 있습니다 17,25,26,27. 더욱이, 이러한 세포는 세포 배양 접시에 대한 접착력에 따라 분리되기 때문에 다양한 배아층의 세포로 구성될 수 있습니다(28). 따라서 이종이식법(xenograft method)을 사용하여 편향되지 않은 방식으로 기질 세포의 분화 잠재력과 영양성을 연구하면 이러한 세포 집단에 대한 귀중한 정보를 제공하여 향후 세포 치료제 개발을 안내할 수 있습니다.

여기에 설명된 프로토콜(그림 1)은 병아리 배아의 저렴한 비용과 조작의 용이성을 활용하는 이종 이식 방법입니다. 이전에는 인간 ADSC29, 피부 섬유아세포29, 월경 혈액 유래 기질 세포30 및 교모세포종 세포31의 행동을 연구하는 데 사용되었습니다. 이 방법은 세포를 스페로이드(spheroids) 32로 이식하는 것을 포함하며, 이는 부착성 세포의 모든 집단으로부터 제조될 수 있다(도 2). 수술 절차와 맞춤형 수술 재료(미세 메스 및 유리 모세혈관)의 준비도 설명합니다(그림 3). 인간 세포는 인간 특이적 Alu 프로브를 하이브리드화하여 조직학적 절편에서 검출되므로(그림 4) 이식된 세포의 사전 표지가 필요하지 않습니다. 대표적인 결과는 날개 새싹 수준(그림 5, 그림 6 및 그림 7)과 첫 번째 인두궁(그림 8)의 솜 영역에서 이식된 인간 ADSC와 전뇌에 이식된 인간 원발성 교모세포종 스페로이드(그림 8). 세포 이동, 분화 및 병아리 배아 조직과의 상호 작용에 대해 설명하고, 인접 절편의 동시 염색 또는 염색을 사용하여 세포 거동을 추가로 조사하기 위해 제안된 분석법도 설명합니다.

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프로토콜

이 연구에 사용된 모든 생체 내 절차는 브라질 실험 동물 사용 지침(L11794)에 따라 동물 실험 및 연구를 위한 모든 관련 실험 지침을 준수했습니다. 닭 배아를 취급하는 데 사용되는 프로토콜은 모두 과학 실험에서의 동물 사용에 관한 윤리 위원회(리우데자네이루 연방 대학의 건강 과학 센터)의 승인을 받았습니다. 인간 세포의 사용은 Clementino Fraga Filho 대학병원 윤리위원회(번호 043/09 및 088/04)의 승인을 받았습니다. White Leghorn 닭(Gallus gallus)의 특정 병원균이 없는(SPF) 계란을 사용했습니다.

1. 세포 스페로이드의 제조

참고: 세포 스페로이드는 부착되어 있는 한 다양한 세포 유형으로 준비할 수 있습니다. 이 프로토콜의 경우, 앞서 설명한 바와 같이 인간 지방 유래 기질 세포(ADSC)를 분리했습니다(21,27)가 사용됩니다(그림 2A). 교반 하에서 37°C에서 1시간 동안 콜라겐분해효소 IA로 지방 조직 절편 또는 지흡인물을 소화한 후 1−2 ×10 4 cells/cm2에서 도금하고 하룻밤 배양하여 세포를 얻었습니다. Non-adherent cell은 폐기하고, adherent cell은 3-6 계대에 대해 확장되었다. ADSC는 표면 항원 CD105, CD90, CD13 및 CD44의 발현에 대해 균질하고 조혈 항원 CD45, CD14, CD34, CD3 및 CD19에 대해서는 음성이었습니다27. 여기에 설명된 방법은 세포 배양에 일상적으로 사용되는 것 이상의 최소한의 재료로 쉽게 수행할 수 있지만 최적의 응집 시간과 부분 해리의 필요성은 경험적으로 결정해야 합니다. 세포 스페로이드를 제조하기 위한 대안적인 방법, 예를 들어 행잉-드롭 방법(33) 또는 아가로스-코팅된 웰(34); 자세한 내용은 토론을 참조하십시오. 모든 절차는 무균 기술을 사용하여 깨끗한 벤치에서 수행해야 합니다.

  1. 세포 조작 전에 멸균 PBS(인산염 완충 식염수), 배양 배지 및 트립신 용액을 37°C로 예열합니다.
  2. 10% 소 태아 혈청(FBS), 2mM L-글루타민, 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 저포도당 DMEM의 배양 ADSC입니다. 두 개의 스페로이드 플레이트를 준비하기 위해 25cm2 플라스크의 ADSC를 사용합니다. 배양 배지를 버리고 적당량의 멸균 PBS(25cm2 세포 배양 플라스크를 사용하는 경우 세척 1회당 5mL PBS)로 배양 접시를 3회 세척합니다.
  3. 세포를 덮을 수 있을 만큼 충분한 트립신 용액(0.78mM EDTA 함유)을 추가하고(25cm2 세포 배양 플라스크를 사용하는 경우 1mL의 트립신 용액) 배양 플라스크를 실온에서 5분 동안 그대로 둡니다.
  4. 세포를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 분리시킵니다. FBS가 포함된 동일한 양의 배양 배지를 첨가하여 트립신을 비활성화하고 세포 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
  5. 180 × g에서 10분간 원심분리기를 사용합니다. 상등액을 버리고 튜브를 두드려 펠릿을 풉니다.
  6. 세포 유형에 적합한 500 μL-2 mL의 배양 배지에 세포를 재현탁합니다(1.2단계 참조).
    참고: 최소 농도는 ADSC 및 섬유아세포와 같은 부착 세포의 경우 5 ×10 5 cells/mL입니다. ADSC의 25cm2 플라스크를 2mL의 배지에 재현탁시키고 각각 1mL를 사용하여 2개의 페트리 접시에 도금해야 합니다. 신경교세포(glia)와 같이 부착력이 떨어지는 세포는 더 낮은 부피에서 ~2 × 106 cells/mL로 도금하는 것이 도움이 될 수 있습니다.
  7. 세포 현탁액을 멸균 60mm 페트리 접시(한천 플레이트를 준비하는 데 사용되는 것과 같이 코팅되지 않고 처리되지 않은 접시)의 한쪽으로 조심스럽게 옮깁니다. 배양 배지를 가능한 가장 작은 영역(그림 1B)으로 제한하려면 접힌 깨끗한 거즈 조각 위에 접시를 올려 인큐베이터에서 기울어진 상태를 유지합니다.
  8. 세포 응집체가 형성될 때까지 37°C, 5% CO2에서 세포 현탁액을 배양합니다(ADSC를 도금한 후 6-8시간).
    참고: 스페로이드 응집 시간은 세포 유형에 따라 달라질 수 있습니다.
  9. 필요한 경우(논의 참조) 1000 μL 팁을 사용하여 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 대형 세포 응집체를 부분적으로 해리합니다. 도금 후 6-8시간 후에 ADSC 스페로이드를 해리합니다.
  10. 스페로이드를 이식할 준비가 될 때까지 플레이트를 인큐베이터에 놓습니다: 가장자리가 정의되어 있고 쉽게 분산되지 않는 둥글습니다(그림 1C, D).
    참고: ADSC 스페로이드는 부분 해리 후 2일 후에 준비됩니다.

2. 스페로이드를 병아리 배아에 이식

  1. 준비
    1. 원하는 햄버거-해밀턴(HH) 단계에 도달할 때까지 37.5°C의 습한 인큐베이터에서 15-30개의 달걀을 배양하여 닭고기 달걀을 준비합니다.사지 새싹 수준의 소마이트(HH11-12 또는 13-19 소미트) 또는 두부 영역의 이식편의 경우 29-33시간(HH8-9 또는 5-8 소미트). 알을 수평으로 놓고 부화하기 전에 알 위에 연필로 선을 그립니다(그림 3D).
      참고: 배양 시간은 개별 인큐베이터에 따라 약간 다를 수 있습니다. 선을 긋는 것은 배아가 발견되는 난자의 윗부분을 실험 전에 난자를 회전시키면 쉽게 식별할 수 있도록 합니다.
    2. 금속 바늘 홀더에 재봉 바늘을 부착하여 날카로운 바늘("마이크로 메스")을 준비합니다(그림 3B). 기름을 바른 숫돌을 사용하여 바늘이 얇은 가장자리가 있는 작은 메스처럼 보일 때까지 바늘을 갈아줍니다(그림 3C). 또는 전기 분해36으로 날카로운 텅스텐 바늘을 준비하십시오.
    3. 유리 파스퇴르 피펫의 얇은 부분을 잠시 녹이기 위해 분젠 버너의 불꽃을 사용하여 유리 모세관을 준비합니다. 화염에서 용융된 부분을 제거하고 늘려 얇은 모세관을 형성합니다. 모세관을 마이크로핀셉으로 부수어 조심스럽게 두 부분으로 나눕니다. 인도 잉크 주입을 위한 얇은 모세관과 스페로이드 이동을 위한 두꺼운 모세관을 준비합니다(그림 3B).
      참고: 인장 강도를 변경하여 다양한 모세관 게이지를 만들 수 있습니다. 모세 혈관은 수술 직전에 준비해야 합니다.
    4. 계란 조작을 위해 작업 표면 및 기타 재료를 준비합니다(그림 3A). 모든 수술 재료는 100°C 오븐에서 밤새 또는 사용 직전에 70% 에탄올로 멸균하십시오. 37°C까지 온난한 멸균 PBS. 200μL 팁(배리어 포함)을 인도 잉크 주입 및 이송 스페로이드용 흡인기 튜브 어셈블리에 부착합니다.
      참고: 인간 세포의 스페로이드를 옮길 때 장벽이 있는 팁을 사용하십시오.
    5. 실험 직전에 30mm 페트리 접시에 인도 잉크 스톡 용액 2방울을 넣고 1mL의 멸균 PBS와 혼합합니다. 인큐베이터에서 스페로이드 플레이트를 제거하고 나머지 실험을 위해 아이스박스 위에 놓습니다.
  2. 각 계란의 준비
    1. 인큐베이터에서 달걀 하나를 꺼내 달걀 홀더 위에 올려 놓습니다. 난자의 뾰족한 끝 부분에 작은 구멍을 뚫고(그림 2D) 주사기와 바늘을 사용하여 알부민 1.5mL를 흡인합니다. 달걀 노른자가 손상되지 않도록 바늘을 달걀에 수직으로 삽입하십시오. 접착 테이프를 사용하여 구멍을 막습니다. 선택적으로 실험 전에 모든 난자에 대해 이 단계를 반복하고 나머지 난자를 다시 배양합니다.
    2. 가위를 사용하여 계란 상단의 창을 조심스럽게 자릅니다(그림 3D). 피펫을 사용하여 노른자 위에 PBS 1-2방울을 추가합니다. 필요한 경우 피펫을 사용하여 큰 알부민 기포( 예: 그림 3F에서 볼 수 있는 것)를 제거합니다.
    3. 얇은 모세관을 흡인기 튜브 어셈블리에 부착합니다. 흡인에 의해 유리 모세관을 인도 잉크 용액으로 부분적으로 채웁니다. 배아 구조가 보일 때까지 배아 아래의 난황에 충분한 인도 잉크를 주입합니다(그림 3E, F).
    4. 실체현미경을 사용하여 솜털의 수를 세십시오(그림 4A). 연필을 사용하여 달걀에 개별적으로 번호를 매깁니다(그림 4B).
  3. 스페로이드 이식
    1. 이식편의 영역을 확인합니다: 날개 새싹 수준의 근축 중배엽(추정15-20th somites37의 전소미틱 중배엽)(그림 3G 및 그림 5A) 또는 추정 첫 번째 인두궁 영역(후방 중뇌/제1 능형체 측면 외배엽과 내배엽 사이)38(그림 8A).
    2. 마이크로 메스를 사용하여 대상 부위 위에 vitelline membrane을 절단합니다.
    3. 한 쌍의 미세 메스를 사용하여 스페로이드가 이식될 부위를 얕게 자릅니다(그림 3H).
      알림: 기저 내배엽을 손상시키지 마십시오. 그렇지 않으면 노른자가 새게 됩니다(이 경우 계란을 버리십시오).
    4. 흡인기에서 얇은 모세관을 제거하고 두꺼운 모세관으로 교체합니다. 실체현미경으로 스페로이드를 관찰하고 소마이트와 거의 같은 크기의 스페로이드를 선택합니다(그림 2D). 이 스페로이드를 모세혈관으로 흡인합니다.
    5. 절단 영역 옆에 스페로이드를 부드럽게 놓습니다(그림 3H). 날카로운 바늘을 사용하여 스페로이드를 절단 영역으로 밀어 넣습니다(그림 3I,J).
    6. 피펫을 사용하여 배아 위에 PBS 1-2방울을 추가하여 스페로이드가 단단히 삽입되었는지 확인합니다.
      참고: 이식편이 제거된 경우 새 스페로이드를 이식해야 합니다(2.3.4 및 2.3.5 단계).
    7. 난자가 완전히 밀봉되어 오염을 방지할 수 있도록 티슈 페이퍼를 사용하여 달걀 껍질에서 누출된 알부민을 청소합니다. 접착 테이프를 사용하여 계란의 창을 밀봉하십시오.
    8. 접목된 영역을 기록해 두십시오(그림 4A). 삽입된 스페로이드가 빠지지 않도록 계란을 37.5°C의 습한 인큐베이터에 조심스럽게 되돌립니다.
    9. 원하는 단계까지 난자를 부화시킵니다.
      참고: 사지 싹 수준에서 싹 수준에서 솜씨로 이종이식을 수행할 때 3.5일 된 배아(HH21)에서 이동 및 세포 사멸이 성공적으로 분석되었으며 6일 된 배아(HH29)에서 세포 분화 및 열대성이 관찰되었습니다(그림 5A). 숙주 조직으로의 통합은 생후 8일 된 배아에서도 수행되었습니다(HH33). 인두궁 영역에 이식된 기증자 세포는 생후 4.5일 된 배아(HH25)에서 연구되었습니다(그림 8A).

3. 조직 절제, 고정, 가공 및 조직학적 절편의 준비

  1. 해부 및 고정
    1. 고정제(최소 1mL/배아): 에탄올 100%-포름알데히드 37%-빙초산을 6:3:1 비율로 준비합니다. 작업 표면, 마이크로 집게 한 쌍, 수술용 가위 또는 홍채 가위, 홈이 있는 숟가락을 청소합니다. 60mm 유리 페트리 접시에 차가운 PBS를 채우고 실체 현미경 아래에 놓습니다.
    2. 접착 테이프를 잘라 계란을 엽니다.
    3. 배아 주위의 막을 자르고 홈이 있는 스푼을 사용하여 제거합니다.
    4. 배아를 페트리 접시에 옮깁니다. 배아가 생후 5일(HH26) 이상인 경우, 조작 전 배아를 조작하기 전에 즉시 참수하십시오.
    5. 마이크로펜셉과 가위를 사용하여 남아 있는 멤브레인을 제거합니다. PBS에서 표본을 부드럽게 교반하여 남아 있는 노른자 방울을 씻어냅니다.
    6. 이종이식편이 날개 수준에서 수행된 경우 머리를 버리십시오. 세포를 두부 부위에 이식한 경우 심장 부위가 손상되지 않도록 신체의 하반신을 잘라 버리십시오.
    7. 각 검체를 1mL의 고정제가 들어 있는 별도의 2.0mL 튜브로 옮깁니다. 이전과 같이 튜브를 개별적으로 식별합니다(그림 4B). 교반하면서 4 ° C에서 밤새 배양하십시오.
    8. 세포 펠릿 또는 스페로이드(그림 4F)를 positive control로 사용합니다. 이를 위해 1.5mL 튜브에서 180 × g 에서 10분 동안 세포 현탁액(단계 1.5) 또는 세포 스페로이드(단계 1.10)를 원심분리하고, 배양 배지를 버리고, 펠릿을 방해하지 않고 정착제 1mL를 첨가합니다. 교반 없이 4°C에서 밤새 튜브를 배양하고 병아리 샘플과 동일한 방식으로 진행합니다.
  2. 탈수 및 임베딩(Dehydration and embedding)
    1. 1x PBS에 70%, 80%, 90% 및 100% 에탄올 1mL를 교반과 함께 각각 최소 1시간 동안 연속적으로 세척하여 배아를 탈수합니다.
    2. 1mL의 100% 에탄올을 넣고 실온에서 교반하면서 샘플을 밤새 배양합니다.
    3. 흄 후드에서 100% 자일렌 1mL로 샘플을 1시간 동안 배양합니다. 두 번 더 반복합니다.
    4. 튜브의 내용물을 염색 블록으로 옮기고 자일렌을 버립니다. 배아를 덮을 만큼 충분한 용융 파라핀을 추가하고 염색 블록을 유리 뚜껑으로 덮습니다. 65 °C 오븐에서 하룻밤 동안 배양합니다.
    5. 매립을 위한 파라핀 블록용 따뜻한 플레이트와 주형을 준비합니다.
      참고: 한 쌍의 쭉 뻗은 종이 클립은 배아를 배치하는 데 유용합니다.
    6. 주형에 용융된 파라핀을 채우고 배아를 주형으로 옮깁니다. 몸통의 가로 부분(그림 5A) 또는 머리의 관상 부분(그림 8A)을 얻기 위해 배아를 배치합니다.
    7. 절단할 표면 반대편에 있는 파라핀에 종이 이름 태그를 삽입하면 배아를 올바른 방향으로 절단하는 데 도움이 됩니다(그림 4C).
    8. 사용 중인 경우 샘플 위에 임베딩 카세트를 놓습니다. 틀에서 블록을 제거하기 전에 블록을 완전히 식히십시오. 또는 용융된 파라핀을 사용하여 경화된 파라핀 블록을 카세트 또는 다른 블록 홀더에 부착하고 다시 식히십시오.
  3. 단면화
    1. 단면화를 위한 재료를 준비합니다. 핫플레이트를 42°C로 예열하고 판지나 스티로폼 플레이트를 약 30cm x 20cm의 깨끗한 알루미늄 호일로 덮습니다. 사용하기 전에 모든 표면을 청소하십시오.
      참고: 뉴클레아제에 의한 오염을 피하기 위해, 특히 일부 절편이 RNA in situ hybridization에 사용되는 경우 장갑을 사용하십시오. 물과 표면을 미리 철저히 청소할 수 없는 한 같은 이유로 파라핀 섹션을 늘리기 위해 조직학 수조를 사용하지 마십시오.
    2. 마이크로톰 블레이드로 여분의 파라핀을 다듬습니다. 이후 단계에서 메스 날을 사용하여 각 섹션을 쉽게 분리할 수 있도록 양쪽에 사다리꼴 모양으로 경사를 만듭니다(그림 3A).
    3. 마이크로톰에 블록을 부착합니다. 왼쪽과 오른쪽이 서로 평행이 되도록 블록을 조심스럽게 배치합니다. 샘플의 몇 부분을 절단하고 현미경으로 관찰한 후 더 미세한 조정을 수행합니다.
    4. 목표 영역(사지 새싹 또는 첫 번째 인두궁)에 도달하면 7μm 절편을 자르고 알루미늄 호일로 덮인 판 위에 파라핀 리본을 놓습니다. 전체 대상 영역을 절단합니다(그림 4C).
    5. 연속 절편을 준비하려면 멸균 탈이온수 한 방울로 적절한 수의 슬라이드 유리를 덮으십시오. 개별 섹션을 브러시와 메스를 사용하여 순차적으로 슬라이드로 이동합니다. 인접한 섹션을 다른 슬라이드로 전송하여 연속 섹션을 만듭니다(그림 4D). 생후 3.5일령 배아용 슬라이드 3개, 생후 4.5일 배아용 슬라이드 4개, 생후 6일 배아용 슬라이드 5개로 구성된 시리즈를 준비합니다. 인접한 절편을 다른 프로브, 항체 또는 고전적인 조직학적 염색으로 염색합니다.
      참고: 동일한 시리즈에는 배아의 많은 부분이 절편화된 경우 인접한 여러 슬라이드가 포함될 수 있습니다. 여러 섹션을 각 슬라이드로 전송할 수 있으며, 섹션 사이에 약간의 공간을 유지하여 늘릴 수 있습니다. 아직 따뜻한 접시에 슬라이드를 올려 놓지 마십시오.
    6. 모든 섹션을 슬라이드로 옮긴 후 모든 섹션이 단일 물방울 위로 떠오를 때까지 물을 더 추가합니다. 따뜻한 접시에 슬라이드를 놓고 섹션을 늘리십시오. 보온 플레이트에서 슬라이드를 제거하고 슬라이드 유리를 티슈 페이퍼에 조심스럽게 기울여 물기를 제거합니다.
      알림: 섹션이 늘어나기 전에 유리가 미끄러지기에 직접 닿지 않도록 하십시오.
    7. 슬라이드를 37°C 인큐베이터에서 밤새 건조시킵니다.

4. 중합효소연쇄반응(PCR)에 의한 digoxigenin 표지 Alu 프로브의 합성

  1. 하기의 인간 특이적 프라이머39의 원액을 제조한다: AluFw: 5'-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3' 및 AluRev: 5'-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3'.
  2. 다음 PCR 반응40 중 50 μL를 준비합니다: 1x PCR 완충액, 2.0 mM MgCl2, 0.1 mM dCTP, 0.1 mM dGTP, 0.1 mM dATP, 0.065 mM dTTP, 0.035 mM dig-11-dUTP, 0.4 μM AluFw 프라이머, 0.4 μM AluRev 프라이머, 0.05 U/μL Taq 중합효소 및 1 ng/μL 인간 게놈 DNA.
  3. 초기 변성 온도를 94°C에서 4분 동안 수행한 후 94°C에서 20초, 60°C에서 20초, 72°C에서 20초 동안 40회 변성한 후 5분 동안 72°C의 최종 변성을 수행합니다.
  4. 분광 광도계를 사용하여 프로브 농도를 측정합니다. 프로브를 -20°C에서 보관하십시오.
    참고: PCR 산물은 2% 아가로스 겔에서 전기영동 후 200-300bp여야 합니다29.

5. Alu 프로브를 사용한 섹션 in situ hybridization

  1. 1일차: 투과화(Permeabilization)와 교잡(hybridization)
    알림: 멸균된 슬라이드 유리병은 1일차에 수행된 모든 단계에 사용해야 합니다.
    1. 37°C의 수조에서 PBT(0.1% Tween 20 in PBS)를 1회 세척하여 예열하고 50% 포름아미드/50% 탈이온수로 촉촉한 챔버를 준비합니다.
      알림: 유리병 크기에 따라 모든 세척의 양을 계산하십시오. 지정하지 않는 한, 모든 세척은 슬라이드를 용액에 침지하여 수행됩니다.
    2. 흄 후드에서 크실렌을 각각 5분씩 세 번 연속으로 세척하여 파라핀을 제거합니다.
    3. 100% 에탄올로 각각 5분 동안 두 번 세척한 다음 PBS에서 90/70/30% 에탄올을 각각 2분 동안 세척하여 시리즈를 재수화합니다.
    4. PBT(PBS의 0.1% 트윈 20)로 각각 5분씩 3회 세척합니다.
    5. 투과화를 위해 예열된 PBT에 2μg/mL Proteinase K를 첨가하고 슬라이드를 용액에 담근 다음 37°C 수조에서 14분 동안 배양합니다.
    6. 실온에서 4% 파라포름알데히드/PBS에 20분 동안 침지하여 단면을 고정합니다.
    7. PBS로 5분 동안 세척합니다.
    8. 각 슬라이드에서 과도한 PBS를 닦은 후 300μL의 혼성화 완충액(50% 탈이온화 포름아미드, 4x SSC pH 5.0, 1x Denhardt 용액, 5% 덱스트란 설페이트, 100μg/mL 연어 정자 DNA)으로 섹션을 덮습니다(표 1). 포름 아미드 챔버에서 42 ° C에서 1 시간 동안 배양합니다.
    9. 혼성화 완충액에 0.2 ng/mL Alu 프로브 용액을 준비합니다. 슬라이드를 기울여 혼성화 버퍼를 제거하고 섹션에 120μL의 Alu 프로브 용액을 추가합니다. 유리 커버슬립으로 덮고 거품이 생기지 않도록 주의하십시오.
      참고: 파라필름은 70°C 이상의 온도에서 녹기 때문에 이 단계에서 슬라이드를 덮는 데 사용해서는 안 됩니다.
    10. 핫 플레이트의 슬라이드를 95°C에서 5분 동안 가열합니다.
      알림: 포름아미드 연기를 흡입하지 마십시오.
    11. 슬라이드를 42°C의 포름아미드 챔버에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  2. 2일차: 엄격한 세척 및 면역조직화학
    1. 20x SSC 완충액(3M NaCl, 0.3M 구연산나트륨, pH 7.5)을 준비합니다(표 1). pH 7.5의 0.1x 식염수 구연산나트륨(SSC) 완충액을 2회 세척하여 42°C로 예열합니다.
    2. 슬라이드 유리병에 2x SSC 버퍼, pH 7.5를 채웁니다. 슬라이드를 용액에 부드럽게 넣고 커버슬립이 분리될 때까지 기다립니다. 집게를 사용하여 커버슬립을 제거하고 실온에서 5분 동안 2x SSC 버퍼에 슬라이드를 배양합니다.
    3. 실온에서 2분 동안 2x SSC 버퍼(pH 7.5)로 슬라이드를 다시 세척합니다.
    4. 0.1x SSC 버퍼, pH 7.5, 42°C에서 각각 5분 동안 슬라이드를 두 번 세척합니다.
    5. MABT(Tween이 포함된 말레산 완충액, 0.1M 말레산, 0.15M 염화나트륨, 0.1% Tween 20, pH 7.5)(표 1)로 실온에서 각각 30분 동안 슬라이드를 두 번 세척합니다.
    6. 각 슬라이드에서 여분의 완충액을 닦아내고 섹션을 400μL의 차단 용액(10% 불활성화 일반 염소 혈청, MABT 내 2% 차단 시약)으로 덮습니다. 실온의 습한 챔버 (탈 이온수로 준비)에서 2 시간 동안 배양하십시오.
    7. 슬라이드를 팁으로 액체를 제거하고 알칼리 포스파타제에 접합된 Fab anti-DIG 단편 150μL를 차단 용액에 1:2,000 희석으로 추가합니다. 유리 커버슬립 또는 파라필름으로 덮고 4°C의 습한 챔버에서 16시간 동안 배양합니다.
  3. 3일차: 색상 개발
    1. MABT가 있는 용기 안의 커버슬립 또는 파라필름을 부드럽게 제거하고(5.2.2단계 참조) 실온에서 30분 동안 MABT의 슬라이드를 배양합니다.
    2. MABT로 각각 30분씩 3회 더 세척합니다.
    3. MAB(말레산 완충액, 0.1M 말레산, 0.15M 염화나트륨, pH 7.5)(표 1)로 30분 동안 세척합니다.
    4. NTM(NaCl-Tris-MgCl2 완충액, 100mM Tris-HCl pH 9.5, 100mM 염화나트륨, 50mM 염화마그네슘)(표 1)으로 각각 10분 동안 두 번 세척합니다.
    5. 염색 용기에 염색 용액(0.45μL/mL 4-니트로 블루 테트라졸륨 클로라이드, 3.5μL/mL 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트 p-톨루이딘)(표 1)을 염색 용기에 넣고 슬라이드를 용액에 담급니다. 항아리를 알루미늄 호일로 덮고 37 ° C에서 밤새 색이 발현되도록합니다.
  4. 4일차: 대조염색 및 장착
    1. PBS로 슬라이드를 실온에서 각각 10분씩 세 번 세척합니다.
      알림: 염색 용액이 할로겐 폐기물로 적절하게 폐기되었는지 확인하십시오.
    2. 수성 장착 매체 방울을 추가하고 유리 커버 슬립으로 섹션을 덮어 슬라이드를 그대로 장착합니다. 또는 핵 고속 적색 또는 알시안 블루 대조 염색을 진행하십시오.
    3. 과도한 PBS를 닦아내고 섹션 위에 0.1% 핵 고속 적색41 (표 1)의 핵 대조 염색 용액 500μL를 추가하고 습한 챔버에서 10분 동안 슬라이드를 배양합니다. 팁: 과도한 핵 패스트 레드를 제거하고 탈수를 진행합니다(단계 5.4.5).
    4. 단면을 0.5% Alcian blue 용액(연골 카운터스테인)42 에 10분 동안 담그십시오. 증류수로 헹구고 1% 포스포몰리브딕산에서 10분 동안 배양합니다. 다시 물로 헹구고 탈수를 진행하십시오.
      참고: 포스포몰리브딕산 세척을 생략하면 Alcian blue는 핵 대조염색이 됩니다.
    5. 70/95/100/100% 에탄올로 각각 5분씩 탈수합니다.
    6. 흄 후드에서 매번 5분 동안 자일렌으로 세 번 세척하십시오.
    7. 크실렌 기반 장착 매체와 유리 커버슬립으로 장착합니다.
    8. 흄 후드에서 슬라이드를 최소 16시간 동안 건조시키십시오.

6. 이미지 획득

  1. 장착된 슬라이드를 완전히 건조시킨 후 정립 명시야 현미경을 사용하여 이식된 인간 세포의 존재 여부에 대해 모든 섹션을 검사합니다(그림 4E). 청자색 Alu-positive cells(그림 4F,G)를 찾고 마커 펜을 사용하여 Alu-positive cells(알루미늄 양성 cell)가 포함된 섹션을 표시합니다(그림 4E).
    참고: Alu 양성 세포로 섹션을 표시하면 사진을 찍고 다른 마커로 염색된 인접한 슬라이드를 비교하는 동안 더 쉽게 찾을 수 있습니다.
  2. 이종이식편이 포함된 단면을 슬라이드의 위치와 동일한 순서(전후 방향)로 촬영하도록 주의하십시오. [이종 이식 날짜]_[세포 유형]_[배아 연령]_[프로브 유형]_[섹션 번호]_001과 같은 모든 관련 정보와 함께 각 사진의 이름을 지정합니다. 메타데이터 파일을 포함하여 나중에 축척 막대를 추가합니다.
  3. 동일한 시리즈의 다른 슬라이드가 다른 마커(예: RNA in situ hybridization 또는 immunohistochemistry)로 염색된 경우 동일한 방식으로 인접 섹션(그림 6)을 촬영하고 이름을 지정합니다.

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결과

조직학적 절편에서 Alu-positive ADSC의 식별
Alu 염기서열은 인간 게놈의 ~10%를 구성하는 반복적인 요소이므로 종 특이적 방식으로 인간 세포를 식별하기 위한 훌륭한 표적입니다43. DNA 프로브를 사용한 현장 혼성화는 1차 인간 세포 29,30,40,44,45,46을 포함한 조직학적 섹션에서 게놈 요소를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 실험 섹션을 검토하기 전에 A...

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토론

여기에 설명된 프로토콜(그림 1)은 병아리 배아를 모델로 사용하여 생체 내에서 인간 세포의 주요 집단의 행동을 스크리닝하기 위한 실현 가능한 옵션을 제시합니다. 이 논문은 세포 스페로이드의 형성(그림 2), 병아리 배아로의 스페로이드 이식(그림 3), 표본 처리 및 현장 교잡(그림 4), 전염색체 중배엽에 이식된 인간 ADSC의 대표적인 결과(그림 5) 및 관련 실험(그림 6 및 7)에 대해 설명합니다), 첫 번째 인두궁 영역에 이식된 인간 ADSC와 병아리 전뇌세포에 이식된 인간 원발성 교...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 Universidade Federal de Rio de Janeiro (Ufrj for J.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq for J.B.) 및 Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ for J.B.)의 지원을 받았습니다. Runx2 (Cbfa1) 프로브에 대해 T. Jaffredo(CNRS, Paris, France)에게 감사드립니다. HNK1 항체는 NICHD의 후원 하에 개발되고 아이오와 대학교 생물과학부, 아이오와 시티, IA 52242 USA에서 유지 관리하는 Developmental Studies Hybridoma Bank에서 얻었습니다. 마이크로톰에 대한 접근을 허락해 주신 V. Moura-Neto와 현미경에 대한 접근을 허락해 주신 R. Lent에게 감사드립니다. Alu 프로브를 합성하는 데 도움을 주신 E. Steck에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Animals
Gallus gallus eggsGranja TolomeiSPF-freeWhite leghorn chicken
시약
Alcian Blue 8GXSigma-aldrichA5268
AluFw 프라이머Sigma-aldrichOLIGO5'-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3'
AluRev 프라이머시그마 - 알드리치올리고5 '-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3'
황산 알루미늄그마 알드리치368458핵 빠른 적색 용액 준비
안티 Digoxigenin-AP, Fab 단편Roche11093274910항체 등록 ID : AB_514497
Anti-Human Natural Killer 1 항체 (HNK1, CD57)개발 연구 Hybridoma Bank3H5항체 등록 ID : AB_2314644
안티 마우스, 염소 IgM-HRP산타 크루즈 Biotechnologysc-2973항체 등록 ID: AB_650513
Anti-mouse, goat IgG (H+L)-HRPNovexG-21040항체 등록 ID: AB_2536527
Anti-Smooth Muscle Actin/ACTA2 항체DakoM085129항체 등록 ID:
AB_2811108 AquatexMerck1085620050수성 장착제
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt (BCIP)Sigma-aldrichB8503-100MG
차단 시약Roche11096176001
Citric acidVETEC238SSC 완충액 준비
콜라겐 분해 효소 유형 IASigma-aldrichSCR103
dCTP, dGTP, dATP, dTTP 세트Roche11969064001
Denhardt 용액 50XInvitrogen750018혼성화 완충액 준비용
덱스트란 황산염 나트륨 염Thermo Scientific15885118혼성화 완충액 준비용
DIG RNA 라벨링 혼합물Roche11277073910Dig-11-dUTP
DMEM 저포도당시그마-알드리치D5523
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB)함유시그마 알드리치D5905-50TAB
N, N- 디메틸 포름 아미드 (DMF)시그마 알드리치227056NBT 및 BCIP 용액 준비
용 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)시그마 알드리치E6758트립신 용액 준비
용 Entellan 새로운Merck107961비수성 장착 매체
에탄올Proquí miosN/A
소 태아 혈청ThermoFisher1265702956°에서 비활성화; C 사용 전
포름 알데히드 37 % 용액Proqu í miosN/A
포름아미드VetecV900064
빙하 아세트산Proquí miosN / A
인도 잉크Pelikan 221143
L- 글루타민 용액 (200 mM)Gibco25030-149
염화 마그네슘Merck8147330100NTM 완충 제 용
말레 산시그마 알드리치M0375-500GMAB 완충 제
MethanolProquí mios
Normal Goat SerumSigma-aldrichNS02L56°C에서 비활성화; C 사용 전
4-니트로 블루 테트라졸륨 클로라이드(NBT)로슈11585029001
핵 고속 레드시그마-알드리치60700
파라플라스트 플러스시그마-알드리치P3558
페니실린 G 나트륨염시그마-알드리치P3032
인산염 완충 식염수(PBS)시그마-알드리치P3813
포스포몰리브딕산Merck100532
Proteinase KGibco BRL25530-015
연어 정액 DNAInvitrogen15632011혼성화 완충액 제제용
염화나트륨Sigma-aldrichS9888SSC, MAB 및 NTM 완충액 제제용
스트렙토마이신 황산염Sigma-aldrichS6501
Taq 중합효소 키트Cenbiot EnzimasN/A
Tris-HCl, Sigma-aldrichT5941
TrypsinSigma-aldrichT4799
Tween 20Sigma-aldrichP1379
XyleneProquí miosN/A
Microscope and equipments
Axioplan upright microscopeCarl Zeiss MicroscopyN/A
Axiovision softwareCarl Zeiss MicroscopyN/A
Cell incubatorThermoForma3110
Egg incubator- 50eggs GP
구즈넥 램프BiocamN/A계란 조작
피지 소프트웨어용; Cell Counter 플러그인ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Laminar flow hoodTROX1385
Nanodrop LiteThermo ScientificND-LITE-PR
로터리 마이크로톰Leica BiosystemsRM2125 RTS절편
용 실체현미경LabomedLuxeo 4D난자 조작용
멸균 오븐REALIS7261690수술 재료의 sterelization
소모품
0.2 mL (PCR) 폴리프로필렌 원심분리기 튜브Eppendorf30124707
15 mL 폴리프로필렌 코니컬 원심분리기 튜브CorningCLS430791
1.5 mL 폴리프로필렌 원심분리기 튜브AxygenMCT-150-C
2 mL 폴리프로필렌 원심분리기 튜브AxygenMCT-200-C
50 mL 폴리프로필렌 원추형 원심분리기 튜브CorningCLS430829
Barrier (Filter) Tips, 200 μ L 크기InvitrogenAM12655계란 조작
용 굴착 유리 블록 (염색 블록) 커버 유리Hecht Karl42020010
임베딩 카세트SimportM480파라핀 블록 홀더로 사용
유리 커버 슬라이드, 24 x 40 mmKasviK5-2440
유리 파스퇴르 피펫 230 mmNORMAX5426023유리 모세관 제조용
마이크로톰 블레이드Leica BiosystemsHIGH-PROFILE-DISPOSABLE-BLADES-818
Parafilm MParafilmP7793
플라스틱 페트리 접시 절편용, 30mmKasviK13-0035계란 조작용
플라스틱 페트리 접시, 60mmProlab0303-8세포 스페로이드 준비용. 세포 부착을 위해 치료해서는 안 됩니다. 
실란화 유리 슬라이드 (Starfrost)Knittel Glass198주
사기 1 mL 절편, 바늘 26 G (0.45 x 13 mm)Descarpack32972난자 조작 (알부민 흡인)
Surgical tools
Aspirator tubeDrummond2-000-000난자 조작
해부 가위Fine Science Tools14061-11계란 조작용
마이크로핀셋(핀셋)Fine Science Tools00108-11계란 조작 및 유리 모세관 준비용
바늘 홀더(조정 가능한 해부 바늘 척)Fisherbrand8955계란 조작용
오일 숫돌, 10.000 그릿N/A/A바늘 숫돌 숫돌 샤프닝용
쌍 페인트 브러시N/AN/A파라핀 섹션 처리용. 모든 브랜드를 사용할 수 있습니다.
재봉 바늘N/AN/A마이크로 메스로 날카롭게 하기 위해. 모든 브랜드를 사용할 수 있습니다.
멸균 일회용 메스 No. 23Swann-Norton110절제용
외과용 메스 손잡이Swann-Norton914절제용
Wecker 홍채 가위, 날카롭고 날카로운SurtexSS-641-11계란 조작용
시: , , , , N 작은

참고문헌

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