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방법 논문

경골 내 골육종 세포 주사 동위원소 골육종 및 폐 전이 마우스 모델 생성

11.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/63072

⸱

2021년 10월 28일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of theory and therapy of muscles and bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 동위원소 골육종 및 폐 전이 병변을 지닌 마우스 모델을 생성하기 위해 경막내 골육종 세포 주사를 기술한다.

초록

골육종은 어린이와 청소년에서 가장 흔한 원발성 골암으로, 폐가 가장 흔한 전이성 부위입니다. 폐 전이 골육종 환자의 5 년 생존율은 30 % 미만입니다. 따라서, 인간에서 골육종 발달을 모방한 마우스 모델의 활용은 골육종 발암 및 폐전이의 근본적인 기전을 이해하여 새로운 치료제를 개발하는 데 큰 의미가 있다. 여기서, 상세한 절차는 골육종 세포의 경골 내 주사를 통해 원발성 골육종 및 폐 전이 마우스 모델을 생성하는 것으로 보고된다. 생체 발광 또는 X 선 라이브 이미징 시스템과 결합된이 살아있는 마우스 모델은 골육종 성장 및 전이를 모니터링하고 정량화하는 데 사용됩니다. 이 모델을 확립하기 위해, 골육종 세포를 함유하는 기저막 매트릭스를 마이크로-부피 주사기에 로딩하고, 마취 후 각 흉선 마우스의 하나의 경골에 주입하였다. 원발성 골육종이 IACUC 승인 프로토콜에서 크기 제한에 도달했을 때 마우스를 희생시켰다. 골육종을 앓고있는 다리와 전이 병변이있는 폐가 분리되었습니다. 이들 모델은 짧은 잠복기, 빠른 성장, 중증 병변 및 원발성 및 폐 전이성 병변의 발달을 모니터링하는 데 있어서 민감성을 특징으로 한다. 따라서, 이들은 골육종 암화 및 폐 전이, 종양 미세환경에서 특정 인자의 기능 및 기작을 탐구하고, 생체 내에서 치료 효능을 평가하기 위한 이상적인 모델이다.

서론

골육종은 어린이와 청소년에서 가장 흔한 원발성 골암으로 1,2 주로 주변 조직에 침투하고 환자가 진단 될 때 폐로 전이됩니다. 폐 전이는 골육종 치료의 주요 과제이며, 폐 전이 환자의 5 년 생존율은 20 % -30 % 3,4,5만큼 낮습니다. 그러나, 원발성 골육종의 5년 생존율은 화학요법6의 도입으로 인해 1970년대 이후 약 70%로 증가하였다. 따라서 새로운 치료법을 개발하기 위해서는 골육종 발암과 폐전이의 근본적인 메커니즘을 이해하는 것이 시급히 필요하다. 인간의 골육종 진행을 가장 잘 모방하는 마우스 모델의 적용은 매우 중요합니다7.

골육종 동물 모델은 자발적이고 유도 된 유전 공학, 이식 및 기타 기술에 의해 생성됩니다. 자발적인 골육종 모델은 긴 종양 형성 시간, 일관성 없는 종양 발생률, 낮은 이환률 및 불량한 안정성 8,9로 인해 거의 사용되지 않는다. 유도된 골육종 모델이 자발적인 골육종보다 수득하기에 더 접근하기 쉽지만, 유도 인자가 골육종(10)의 미세환경, 병인, 및 병리학적 특성에 영향을 미치기 때문에 유도된 골육종 모델의 적용은 제한적이다. 트랜스제닉 모델은 인간의 생리적 및 병리학적 환경을 더 잘 시뮬레이션할 수 있기 때문에 암의 발병기전을 이해하는 데 도움을 준다; 그러나, 트랜스제닉 동물 모델은 또한 트랜스제닉 변형의 어려움, 장기간 및 높은 비용으로 인해 그들의 한계를 갖는다. 더욱이, p53 및 Rb 유전자 변형에 의해 생성된 가장 널리 수용된 형질전환 동물 모델에서조차도, 육종의 13.6%만이 네 개의 사지뼈11,12에서 발생하였다.

이식은 간단한 기동, 안정한 종양 형성 속도 및 더 나은 균질성13으로 인해 최근 몇 년 동안 가장 일반적으로 사용되는 원발성 및 원거리 전이성 암 모델 생산 방법 중 하나입니다. 이식은 이식 부위에 따른 이종국소 이식 및 동위원소 이식을 포함한다. 골육종 이종 이식에서, 골육종 세포는 동물의 원발성 골육종 부위(뼈) 외부에, 일반적으로 피부 아래에, 피하14로 주사된다. 이종 국소 이식은 동물에서 수술을 수행 할 필요없이 간단하지만 골육종 세포가 주입되는 부위는 실제 인간 골육종 미세 환경을 나타내지 않습니다. 골육종 동위원소 이식은 골육종 세포가 경골15,16과 같은 동물의 뼈에 주입되는 경우이다. 이종 토픽 이식편과 비교하여, 동위원소 골육종 이식편은 짧은 잠복기, 빠른 성장 및 강한 침식 성질을 특징으로합니다. 따라서, 그들은 골육종 관련 연구17에 이상적인 동물 모델입니다.

가장 일반적으로 사용되는 동물은 생쥐, 개 및 제브라 피쉬18,19입니다. 골육종의 자발적 모델은 골육종이 송곳니에서 가장 흔한 종양 중 하나이기 때문에 일반적으로 송곳니에서 사용됩니다. 그러나, 이 모델의 적용은 긴 종양 형성 시간, 낮은 종양 생성 속도, 불량한 균질성 및 안정성 때문에 제한된다. 제브라피쉬는 빠른 번식(20)으로 인해 형질전환 또는 녹아웃 종양 모델을 구축하는데 종종 사용된다. 그러나 제브라피쉬 유전자는 인간 유전자와 다르기 때문에 그 적용이 제한적입니다.

이 연구는 흉선 마우스에서 골육종 세포의 경골 내 주사를 통해 폐 전이와 함께 경골에서 원발성 골육종을 생산하기위한 상세한 절차, 예방 조치 및 대표적인 이미지를 설명합니다. 이 방법은 치료 효능 평가를 위해 마우스 경골에서 원발성 골육종을 만들기 위해 적용되었으며, 이는 높은 재현성21,22를 나타내었다.

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프로토콜

모든 동물 실험은 상하이 중국 전통 의학 대학의 동물 복지위원회에 의해 승인되었습니다. 네 주 된 수컷 BALB/c 흉선 마우스는 골육종 세포의 동위원소 주사 수술 전에 일주일 동안 적응하였다. 마우스는 SPF 사료 및 멸균수에 대한 Ad libitum 접근과 함께 12 시간의 빛 / 어두운 사이클에서 케이지 당 다섯 마리의 마우스가있는 개별적으로 환기 된 마우스 케이지에 보관되었습니다.

1. 세포의 제조

  1. 골육종 세포(143B-Luciferase) 주입 당일에, 10 cm 세포 배양 접시에서 배양된 80%-90% 합류 세포를 PBS(pH 7.4)로 두 번 세척하고 1.5 mL의 0.25% 트립신으로 3분 동안 트립신화한다. 이어서, 트립신을 켄칭하기 위해 6 mL의 10% 혈청-함유 MEM 배지를 첨가하고, 세포를 15 mL 원심분리 튜브에서 수집하였다.
    참고: 143B-루시퍼라제 세포주는 pLV-루시퍼라제 벡터 23으로 형질감염된143B 세포주로부터 수득된다.
  2. 20 μL의 세포 현탁액을 세포 카운팅 플레이트의 챔버에 흡인하고 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 농도를 계산 한다 (재료 표 참조).
  3. 세포를 실온에서 5분 동안 800 x g 에서 원심분리한다.
  4. 상층액을 피펫으로 흡인하고 세포 펠렛을 8.5 mg/mL 기저막 매트릭스 ( 물질 표 참조)에 재현탁하여 2 x 107 cells/mL의 최종 농도로 재현탁시킨다.
  5. 세포를 얼음 위에 두고, 수술실로 가져 오십시오. 세포는 2 h 이내에 사용되어야 한다.
    참고 : 부정확 한 주사 용량 (예 : 주사기의 죽은 공간으로 인해)을 피하기 위해 여분의 세포 현탁액이 준비됩니다 (일반적으로 필요한 세포 현탁액의 두 배). 기저막 매트릭스는 실온24 이상의 응고 특성을 갖기 때문에 항상 얼음 위에 보관됩니다.

2. 골육종 세포의 동위원소 주사 수술

참고: 수술 도구는 그림 1에 나와 있습니다.

  1. 마우스는 특정 병원체가 없는 조건에서 사육하였다. 모든 절차는 멸균 도구가있는 무균 캐비닛에서 수행되었습니다.
  2. 마우스를 2 % 이소 플루란과 98 % 산소 (산소 유량, 2 L / 분)에 노출시켜 마취시킵니다.
  3. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 소량의 안과 연고를 눈에 바르십시오.
    참고: 환기가 잘되는 곳에서 전체 절차를 수행하십시오. 골육종 세포 주사 전에, 각 마우스가 발가락 꼬집음에 의해 깊은 마취하에 있는지 확인; 마우스에 여전히 트위치 또는 저크와 같은 응답이 있으면 위의 응답이 사라질 때까지 오래 기다리십시오.
  4. 각 마우스를 수핀 위치에 두십시오. 엄지 손가락과 검지 손가락을 사용하여 마우스의 발목을 잡고 경골의 주사 부위를 70 % 에탄올 면봉으로 소독하십시오.
    참고: 마우스 발목을 단단히 잡으려면 엄지 손가락과 검지 손가락 끝이 후속 절차에서 매우 중요합니다.
  5. 각 마우스의 발목 관절을 바깥쪽으로 돌려 경골과 비골을 이동시키고 근위 경골 고원(경골 상단)이 피부를 통해 명확하게 보일 때까지 무릎 관절을 적절한 위치로 구부립니다(그림 2A).
  6. 바늘을 1 mL 주사기에 부착하고 바늘 끝을 주사 부위쪽으로 향하게하십시오. 주사기 바늘이 경골의 긴 축과 평행한지 확인하십시오.
    1. 바늘이 피부 / 관절 캡슐을 통과 할 때 슬개골 인대를 통해 또는 슬개골 인대를 통해 바늘을 경피적으로 삽입하십시오. th0en, 주사기 (1/2 ~ 3/4 원)를 회전시켜 미세 부피 주사기로 골육종 세포 주사를 위해 경골 플랫폼 (수질 강)의 원위 끝쪽으로 경골 플랫폼을 통해 구멍을 뚫습니다 (그림 2B, C).
      참고 : 바늘 팁이 정확하면 드릴링하는 동안 경골의 동시 회전을 느낄 수 있습니다. 니들링이 바늘의 약 절반이 경골에 있을 때까지 직접 앞으로 밀지 않고 주사기 회전으로 앞으로 이동하는지 확인하십시오.
  7. 주사기 바늘이 성공적인 드릴링을 보장하기 위해 수질 운하로 눈에 띄는 움직임을 보였는지 확인하십시오.
    참고 : X 선 검사 ( 재료 표 참조)를 수행하여 바늘의 적절한 위치를 확인하고 이미지를 수집하십시오.
  8. 로딩된 143B 골육종 세포 현탁액(단계 1.5로부터)을 마이크로-볼륨 주사기에 넣고, 경골 내의 1 mL 주사기를 143B 세포-로딩된 마이크로-볼륨 주사기로 교체한다(도 2D). 고압을 가하지 않고 각 흉선 마우스의 경골 (약 2 x 105 세포)에 143B 세포 현탁액의 ~ 10 μL (바늘에 존재하는 용액을 무시)를 천천히 주입하십시오.
  9. 마이크로 볼륨 주사기가 제거되면 면봉으로 주사 부위를 20-30 초 동안 누릅니다.
  10. 각 마우스를 깨끗한 케이지에 다시 넣고 마우스가 마취에서 완전히 회복 될 때까지 면밀히 모니터링하십시오 (약 10 분).
  11. X선 영상화 시스템을 이용하여 생체내에서 종양 성장을 모니터링한다. 종양 부피 (V) 계산을 위한 캘리퍼로 매주 암 질량의 더 긴 직경 (a) 및 짧은 직경 (b)을 측정한다: V = 1/2 x a xb2.
    참고 : 마우스를 2 % 이소플루란과 98 % 산소에 노출시켜 마취하십시오. 마우스를 x-레이 이미징을 위해 마취시켰다. 루시퍼라제 또는 형광 단백질로 표지된 골육종 세포의 경골 내 주사는 원발성 및 전이성 골육종 병변의 추적을 가능하게 한다.
    참고: 무릎 및 폐 전이의 종양 성장으로 인한 골육종을 가진 마우스의 인간적 종점은 다음의 기준에 기초하였다: (1) 신체 상태 점수, (2) 체중 감소 역치 20%, (3) 종양의 평균 최대 직경 2cm, 또는 (4) 심각하게 제한된 동물 행동.

3. 병리검사 (분석을 위해 원발성 및 폐전이성 골육종 표본 수집)

  1. 골육종 세포 주사 육주 후,CO2 흡입을 위해 이들을 노출시킨 후 자궁경부 탈구에 의해 마우스를 희생시킨다.
  2. 마우스를 supine 위치에 유지하고 뒷다리를 모두 스트레칭하십시오.
  3. 골육종이있는 다리 전체를 사타구니 부위에서 분리하십시오.
    참고 : 모든 다리가 동일한 해부학 적 부위에서 분리되어 있는지 확인하십시오.
  4. 골육종을 지닌 다리의 조직학적 표본을 준비하여 피부, 근육 및 발을 제거하고, 각 마우스의 표본을 20 mL 포르말린 용액(10%)으로 50 mL 튜브에 고정한 후 24시간 동안 고정한 다음, 가끔 완충액 변화로 10% EDTA 용액에서 14일 동안 탈석회화시켰다.
  5. 표본을 파라핀에 임베드하고 이전에 발표 된 연구25에 따라 조직 학적 검사를위한 섹션을 준비하십시오.
  6. 부드럽게 폐를 분리하고 20 mL 포르말린 용액 (10 %)으로 채워진 50 mL 튜브에 넣으십시오. 24시간 후, 각 마우스의 폐를 70% 에탄올이 있는 15 mL 튜브로 옮긴다. 폐를 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 및 면역조직화학 분석법25를 위해 파라핀에 임베딩한다.

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결과

성공적인 정형 외과 (원발성) 골육종 및 전이성 폐 모델은 골육종 세포의 정확한 정형 외과 주사에 달려 있습니다. 여기서, 경골 내 골육종 세포 주사를 통한 동위원소(primary) 골육종 모델이 성공적으로 개발되었다. 도 3A는 원발성 (primary) 골육종을 지닌 대표적인 마우스를 나타내고, 도 3B는 대표적인 단리된 동위원소 (primary) 골육종을 나타낸다. 종양 부피를 캘리퍼로 일주일에 한 번 측정하고 단계 2.11에 기재된 바와 같이 계산하였다(도 3C). 생체 내에서 동위원소 (일차) 골육종 성장은 X 선 및 생체 발광 (주입 된 세포가 루시페라아제로 표지되었을 때) 라이브 이미징 시스템 모두에 의해 추적되었다. X선 이미지는 143B 골육종 세포 주사 후 첫 주부터 여섯 번째 주까지 얻어졌...

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토론

골육종 세포의 동위원소 주사는 골육종 발암에 있어서 특정 인자의 기능 및 기전을 연구하고 치료 효능을 평가하기 위해 개발하기에 이상적인 모델이다. 종양 성장의 차이를 피하기 위해 동일한 수의 80 % -90 % 합류에서 대부분의 활성 골육종 세포를 각 마우스의 경골에 조심스럽게 주입하고 세포 트립신화 시간은 세포 생존력에 영향을 미치지 않고 엄격하게 제어됩니다. 세포 덩어리가 세포 계수에 영향을 주어 각 마우스의 경골에 주입되는 부정확 한 세포 번호로 이어지기 때문에 세포 덩어리가 형성되지 않도록 세포 현탁액을 피펫과 위아래로 적절하게 혼합해야합니다.

고려해야 할 또 다른 중요한 측면은 골육종 세포에 대한 재현탁 용액입니다. 주입된 세포는 PBS 또는 배양 배지 대신 기저막 매트릭스에 재현탁된다. 더욱이, 고농도의 기저막 매트릭스는 피펫팅되기가 어렵고 정확한 부피에 영향을 미친다; 따라서, 기저막 매트릭스의 적절한 농도가 요구된다(26)...

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공개 사항

저자들은 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 (1) 중국의 국가 핵심 R & D 프로그램 (2018YFC1704300 및 2020YFE0201600), (2) 국립 자연 과학 재단 (81973877 및 82174408)의 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
자동 세포 계수기 Shanghai Simo Biological Technology Co., LtdIC1000카운팅 셀
마취 기계Shenzhen RWD Life Technology Co., LtdR500IP마취 마우스
BALB/c 흉선 마우스장비 Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd./동물
기저막 매트릭스Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd356234, BD, Matrigel세포 재현탁 이미징
시스템Shanghai Baitai Technology Co., Ltd로 라벨링된 경우 종양 성장 및 폐 전이를 추적하는Vieworks
YueNian Biotechnology Co., Ltd  430790, 코닝원심 분리기 세포
이소 플루란심천 RWD Life Technology Co., LtdVETEASY마취 마우스
MEM 미디어상하이 YueNian 생명 공학 유한 회사LM-E1141세포 배양 매체
마이크로 볼륨 주사기상하이 높은 비둘기 산업 및 무역 유0-50 μ L경골에 정확한 세포를 주입
인산염 완충 식염수Beyotime BiotechnologyST447인간 골육종 세포
세척 1ml 주사기Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd20200411드릴링
143B 세포주ATCCCRL-8303골육종 세포주
트립신 (0.25%)Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd25200056, 세포의 Gibco트립신 처리
Trypan blueBeyotime BiotechnologyST798활성 벡터를 평가하기 위한 염색 세포
(pLV-루시페라제)Shanghai YueNian Biotechnology Co., LtdVL3613Plasmid
Lipofectamine 2000Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd11668027,Thermo fisherPlasmid transfection 시약
X-ray imaging 종Brook (Beijing) Technology Co., LtdFX PROX-ray 이미지를 획득했습니다
주입 세포가 루시페라제 원심분리기 튜브(15mL) Shanghai 한 회사 양 성장을 감지하기 위해 시스템 .

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