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방법 논문

생체 외 내측 전두엽 피질에서 외측 내후각 피질까지의 장거리 시냅스 전달 및 가소성에 대한 광유전학적 심문

2.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/63077

⸱

2022년 2월 25일

 , 
1School of Physiology, Pharmacology and Neuroscience, University of Bristol

이 논문에서

요약

여기서 우리는 급성 설치류 뇌 조각에서 시냅스 특이적 전기생리학적 특성을 허용하기 위해 광유전학적 구조를 가진 분리된 뇌 영역의 바이러스 형질도입을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

뇌의 특정 시냅스의 생리적 특성과 소성 변화를 겪는 방법을 연구하는 것은 현대 신경 과학의 핵심 과제입니다. 전통적인 체외 전기 생리 학적 기술은 전기 자극을 사용하여 시냅스 전달을 불러 일으 킵니다. 이 방법의 주요 단점은 비특이적 특성입니다. 자극 전극 영역의 모든 축삭이 활성화되어 특정 구 심성 연결에 영향을 미치기가 어렵습니다. 이 문제는 전기 자극을 광유전학 기반 자극으로 대체함으로써 극복할 수 있습니다. 우리는 광유전학을 시험관 내 패치 클램프 기록과 결합하는 방법을 설명합니다. 이것은 정확한 해부학 적으로 정의 된 시냅스 연결의 기저 시냅스 전달과 시냅스 가소성 모두를 연구하기위한 강력한 도구이며 뇌의 거의 모든 경로에 적용 할 수 있습니다. 여기에서는 설치류 뇌의 시냅스 전 관심 영역(내측 전전두엽 피질)에 외과적 주사를 위한 채널로돕신 단백질을 코딩하는 바이러스 벡터의 준비 및 처리와 하류 표적 영역(측면 entorhinal cortex)의 급성 절편을 만드는 방법에 대해 설명합니다. 장단기 시냅스 가소성을 연구하기 위해 패치 클램프 기록과 광 자극에 의한 시냅스 활성화를 결합하는 자세한 절차도 제시됩니다. 우리는 광유전학과 Cre 의존성 세포 표지를 결합하여 경로 및 세포 특이성을 달성하는 실험의 예를 논의합니다. 마지막으로, 관심 전 시냅스 영역의 조직학적 확인은 시냅스 후 세포의 바이오사이틴 표지와 함께 설명되어, 정확한 위치 및 세포 유형의 추가 식별을 가능하게 한다.

서론

시냅스의 생리학과 시냅스가 어떻게 소성 변화를 겪는지를 이해하는 것은 건강한 뇌에서 뇌 네트워크가 어떻게 기능하는지1,그리고 뇌 장애에서 어떻게 오작동하는지 이해하는 데 필수적입니다. 급성 생체 외 뇌 슬라이스를 사용하면 전체 세포 패치 클램프 기록을 사용하여 신호 대 잡음비가 높은 단일 뉴런에서 시냅스의 전기적 활동을 기록 할 수 있습니다. 막 전위의 제어와 간단한 약리학 적 조작은 수용체 아형의 분리를 가능하게합니다. 이러한 기록은 층류 및 하위 영역위치 2, 세포 형태3, 분자 마커의 존재4, 구 심성 투영5, 또는 최근에 활성화 된 경우에도6을 포함하는 시냅스 후 뉴런을 식별하기 위해 절묘한 특이성으로 이루어질 수 있습니다.

그러나 시냅스 전 입력의 특이성을 달성하는 것은 다소 어렵습니다. 종래의 방법은 특정 층에서 실행되는 축삭을 흥분시키기 위해 자극 전극을 사용했습니다. 이것의 예는 지층 반경의 국소 자극이 CA3에서 CA1 하위 필드7로 투사하는 시냅스를 활성화시키는 해마입니다. 이 경우, 시냅스 전 특이성은 CA3 입력이 CA1 피라미드 세포8에 투영되는 지층 반경 내에 위치한 유일한 흥분성 입력을 나타내기 때문에 달성됩니다. 그러나 CA3-CA1 축삭의 종래의 전기적 시냅스 전 활성화로 달성 할 수있는이 높은 수준의 입력 특이성은이 시냅스가 겪은 강렬한 연구에 반영된 예외입니다. 다른 뇌 영역에서는 여러 구 심성 경로의 축삭이 동일한 층, 예를 들어 신피질9의 층 1에 공존하므로 기존의 자극 전극으로는 입력 특이 적 시냅스 전 자극이 불가능합니다. 이것은 다른 시냅스 입력이 다양한 생리적 특성을 가질 수 있기 때문에 문제가 됩니다. 따라서, 이들의 공동 자극은 시냅스 생리학의 잘못된 특성화로 이어질 수 있습니다.

channelrhodopsin-2 (ChR2)와 같은 감광성 막 단백질 (opsins)의 유전 적 암호화 인 광유전학의 출현은 뇌 영역10,11 사이의 고립 된 시냅스 투영을 연구 할 수있는 가능성을 크게 확장 할 수있게했습니다. 여기에서는 장거리 시냅스 생리학 및 가소성을 연구하기위한 일반화 가능하고 저렴한 솔루션을 설명합니다. 광유전학적 구축물은 바이러스 벡터를 사용하여 매우 특이적인 방식으로 전달되어 관심 전 시냅스 영역을 매우 정밀하게 제어할 수 있습니다. 원심성 돌기는 표적 영역에서 이들 섬유의 활성화를 허용하는 광 활성화 채널을 표현할 것이다. 따라서, 전통적, 비특이적, 전기 자극에 의해 독립적으로 활성화 될 수없는 장거리, 해부학 적으로 확산 된 경로가 연구 될 수있다.

우리는 흥분성 양이온 채널 옵신을 암호화하는 아데노 관련 바이러스 (AAV)를 사용한 내측 전두엽 피질 (mPFC)의 형질 도입을 예로 들어 설명합니다. 그런 다음 측면 내 후각 피질 (LEC)의 급성 절편 준비, 5 층 LEC 피라미드 뉴런의 패치 클램프 기록 및 글루탐산 성 mPFC-LEC 투영의 광 유발 활성화에 대해 설명합니다 (그림 1). 우리는 또한 관심 있는 시냅스 전 영역의 위치를 확인하고 시냅스 후 세포 형태를 식별하기 위해 주사 부위의 조직학적 평가를 설명합니다.

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프로토콜

모든 동물 절차는 영국 동물 과학 절차법 (1986) 및 관련 지침 및 지역 기관 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 정위 바이러스 주사

참고: 현재 프로토콜은 해부학적이지만 시냅스 후 세포 유형, 특이성은 필요하지 않습니다.

  1. 적절한 동물을 선택하십시오. 수컷 야생형 리스터 후드 래트를 이 프로토콜에 사용하였다(300-350 g, 대략 3개월령).
  2. 적절한 바이러스 구조를 선택하십시오. 고려해야 할 몇 가지 요소가 있습니다(토론 참조). 현재 프로토콜은 바이러스를 사용하여 광유전학적 채널 ChETATC 12를 발현하고 흥분성 뉴런을 형질도입합니다(AAV9 - CaMKIIa - ChR2(E123T/T159C) - mCherry; 역가: 3.3 x 10 13 바이러스 게놈/mL).
  3. 앞서 설명한 바와 같이 뇌 지도책을 사용하여 주입의 좌표와 부피를 설정합니다35.
  4. 바이러스 제제의 정위 주사
    참고: 동물의 사용 및 관리에 대한 모든 관련 국가 및 기관 지침을 따라야 합니다. 바이러스 벡터는 앞서 설명한 대로 입체적으로 주입됩니다.13 다음과 같이 수정했습니다.
    1. 동물의 마취 및 준비 중에 바이러스 제제를 얼음 위에 보관하십시오.
    2. 마취 유도 챔버에서 4% 이소플루란으로 마취를 유도한다. 느린 규칙적인 호흡 속도 (1Hz)와 페달 및 각막 반사의 부재로 나타나는 마취 수준을 모니터링하십시오 (발가락을 꼬집고 눈의 구석을 가볍게 만져서 각각 테스트하십시오. 반응이 감지되지 않아야 함).
    3. 침습적 시술 최소 30 분 전에 meloxicam과 같은 수술 전 진통제를 투여하십시오.
    4. 동물이 완전히 마취되면 클리퍼를 사용하여 두피에서 모피를 제거하십시오. 이소플루란 흐름을 정위 프레임의 코 원뿔로 전환하고 쥐를 프레임에 장착합니다. 시술 중 건조를 방지하기 위해 윤활 아이 젤을 눈에 바르십시오.
    5. 수술은 무균 상태에서 수행해야합니다. 절차 전반에 걸쳐 멸균 장갑과기구를 사용하십시오. 4% w/v 클로르헥시딘 용액으로 두피를 소독하기 전에 리도카인 연고(5% w/w)를 바르고 멸균 드레이프로 몸을 덮습니다. 메스를 사용하여 두피에 약 15mm 길이의 세로 절개를하여 브레그마를 노출시킵니다.
    6. 해밀턴 주사기를 정위 프레임에 장착된 이동식 암에 부착된 미세 주입 주사기 펌프에 넣습니다.
    7. 0.2mL 튜브에 바이러스의 5μL 분취량을 넣고 모든 부피가 튜브 바닥에 올 때까지 몇 초 동안 회전합니다. 피펫 2 μL의 바이러스 제제를 튜브의 뚜껑에 넣습니다.
    8. 먼저 수술용 현미경으로 바늘 끝을 보고 주사기에 바이러스 제제를 채운 다음 바늘 끝에 바이러스 볼루스를 수동으로 놓고 펌프 컨트롤을 사용하여 주사기 플런저를 빼냅니다.
    9. 펌프 주입량을 300nL로 설정하고 유량을 100nL/min으로 설정합니다. 펌프를 가동하고 바늘 끝에서 바이러스 방울을 관찰하여 적절한 흐름을 확인하십시오. 면봉에 바이러스를 흡수하고 70 % 에탄올로 바늘을 부드럽게 닦으십시오.
    10. 정위 프레임의 조절기 나사를 사용하여 바늘 끝을 브레그마(관상 및 시상 봉합사가 만나는 두개골의 지점)로 이동하고 프레임의 세 버니어 스케일에서 관찰된 정위 측정을 기록합니다. 쥐 mPFC의 브레그마에 대한 좌표는 전방 - 후방 + 3.1 mm, 내측 ± 0.7 mm, 배측 - 4.5 mm이다. 브레그마 좌표에서 이러한 거리를 더하거나 뺀 다음(표시된 대로) 바늘을 전후방 및 중간 측 좌표로 탐색하고 바늘을 두개골 표면으로 부드럽게 내립니다.
      참고 : 위에 주어진 mPFC 좌표는 300-350g의 수컷 리스터 후드 쥐에 적합합니다. 쥐 균주, 크기의 변화는 이러한 좌표를 변경해야 할 수 있습니다 ( 토론 참조).
    11. 두개골 표면에서 바늘을 들어 올리고 미세한 영구 마커 펜으로이 지점을 표시하십시오. 이 시점에서 스테레오 택시 암에 장착 된 마이크로 드릴을 사용하여 버 구멍을 만드십시오.
    12. 미리 결정된 배복부 좌표에서 바늘을 뇌에 삽입하고 미리 결정된 부피를 주입합니다(mPFC의 경우: 300nL). 볼루스의 확산을 허용하기 위해 바늘을 제자리에 10분 동안 그대로 두십시오. 바늘을 제거하면 펌프를 작동시켜 바늘이 막히지 않았는지 확인하십시오.
      알림: 뇌 조직의 손상과 바늘로의 바이러스 역류를 최소화하기 위해 바늘을 천천히 (~ 3mm / 분) 삽입하고 제거하십시오.
    13. 수분을 유지하기 위해 온난화된 염화나트륨(0.9% w/v)과 포도당(5% w/v) 용액 2.5mL를 피하로 투여합니다.
    14. 1.4.12단계를 반복합니다. 두 번째 반구를 위해.
    15. 두피 절개 부위를 봉합하고 시술이 완료되면 2.5mL의 염화나트륨 및 포도당 용액과 통증 관리를 위한 적절한 기관 권장 진통제(예: 부프레노르핀 또는 멜록시캄)를 투여합니다. 의식이없는 동안 동물을 방치하지 마십시오. 쥐가 완전히 의식을 회복 할 때까지 가열 된 회복 상자에 넣으십시오. 완전히 회복 된 후에는 다른 동물과 함께 집 케이지로 돌아갑니다.
    16. 바이러스 성 형질 감염된 설치류에 대한 수술 후 관리 및 주거 절차에 대한 제도적 지침을 따르십시오. 실험을 시작하기 전에 옵신 전이유전자가 적절하게 발현될 때까지 최소 2주를 기다리십시오.
      참고 : 변환에 필요한 시간은 시냅스 전후 영역 사이의 연결 거리와 강도에 따라 다릅니다. mPFC에서 LEC로의 경우 4-6주가 필요합니다.

2. 급성 뇌 절편의 제조

참고 : 여기서 우리는 성인 생쥐와 쥐의 고품질 피질, 해마 및 시상 조각을 얻기에 충분한 뇌 조각을 준비하는 간단한 방법을 설명합니다.

  1. 해부를위한 솔루션을 준비하십시오.
    1. 250mL 비커에 ~200mL의 빙냉 자당 절단 용액(189mM 자당, 26mM NaHCO3, 10mM D-포도당, 5mM MgSO4, 3mM KCl, 1.25mMNaH2PO4및 0.2mM CaCl2)을 25°C에서 저항률이 18.2MΩcm인 초순수(UPW)로 제조) 또는 비브라톰 조직 챔버를 채우기에 충분한 부피로 채웁니다. 카보 겐 (95 % O 2, 5 % CO2)으로 거품을 내고 얼음에 보관하십시오.
    2. 슬라이스 수집 챔버를 실온에서 인공 뇌척수액 (aCSF; 124 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 10 mM D-글루코스, 3 mM KCl, 2 mMCaCl2, 1.25 mM NaH2PO4, 및 1mM MgSO4 UPW로 만든)으로 채우고, 카보겐으로 버블링한다. 슬라이스 수집 챔버(14)는 나일론 메쉬 시트에 접착되고 비커에 배치된 미세 원심분리 튜브 랙으로 맞춤 제작되어 CSF에 잠겨 있습니다(그림 2A).
    3. 50mL 튜브를 인산염 완충액(PB; 75.4mM Na2HPO 4.7H2O 및 24.6mM NaH2PO4)에 4% 파라포름알데히드(PFA)로 채웁니다. H2O).
      주의: PFA는 독성이 있습니다. 흄 후드에 사용하십시오.
  2. 뇌의 해부.
    1. 호흡이 느리고 규칙적일 때까지(~1Hz) 5% 이소플루란을 사용하여 유도실에서 쥐를 마취합니다. 페달과 각막 반사가없는 것에 대한 충분한 수준의 마취 검사를 보장합니다.
    2. 단두대를 사용하여 동물을 참수하십시오.
    3. 앞서 설명한 바와 같이 뇌 전체를 신속하게 해부하고15에서 자당 절단 용액으로 옮깁니다. 참수 후 90초 이내에 단계를 완료하면 좋은 슬라이스 품질과 성공적인 전체 세포 기록이 가능합니다.
    4. 금속 티스푼을 사용하여 뇌를 집어 들고 과도한 절단 용액을 버리고 벤치 탑의 여과지 위에 놓습니다.
    5. 메스 또는 면도날을 사용하여 소뇌를 신속하게 제거하고 대뇌를 길이를 따라 약 절반 정도 관상 동맥 평면에서 자릅니다. 뒤쪽 절반은 LEC 조직 블록입니다. 다음 단계를 위해 슬라이스 할 영역 외에 과도한 조직을 포함해야합니다. 이 조직 블록과 뇌의 나머지 부분을 자당 절단 용액으로 되돌립니다.
    6. 시아노아크릴레이트 접착제 한 방울을 비브라톰 조직 스테이지에 놓습니다. 이전 단계에서 만든 조직 블록보다 약간 큰 영역을 가진 얇은 층으로 펼칩니다.
    7. 티스푼을 사용하여 LEC 조직 블록을 집어 들고 여분의 용액을 버리고 전방 관상 절단이 부착되도록 접착제 패치에 옮깁니다.
    8. 스테이지를 비브라톰 조직 챔버에 설치하고 조직을 잠수하기에 충분한 양의 자당 절단 용액을 신속하게 붓습니다. 이 용액을 카보겐으로 거품을 냅니다. LEC 조직 블록이 복부 표면이 블레이드를 향하도록 방향을 지정합니다. 주변 실내 조명으로는 옵신을 활성화하기에 충분하지 않지만 비브라톰에 있을 수 있는 추가 광원을 사용하지 마십시오.
    9. 높은 블레이드 진동 속도(100Hz)와 느린 블레이드 전진 속도(0.06mm/s)를 사용하여 복부에서 등쪽까지 350μm 두께의 슬라이스를 절단합니다. 일반적으로 반구당 7개의 LEC 슬라이스를 얻을 수 있습니다.
    10. 슬라이스를 슬라이스 수집 챔버로 옮깁니다. 슬라이스 수집이 완료되면 수집 챔버를 실온으로 돌아가기 전에 1시간 동안 34°C 수조로 옮깁니다. 카보 겐으로 지속적으로 거품. 슬라이스는 최소 6시간 동안 기록하기에 충분히 정상입니다.
    11. 주사 부위의 사후 검사를 위해 뇌의 나머지 부분을 PFA에 48시간 동안 두십시오(섹션 4 참조).

3. 전기 생리학 및 광유전학적 자극

  1. 표적 세포의 식별.
    1. 슬라이스를 34°C의 잠긴 기록 챔버에 넣고 연동 펌프에 의해 2mL/분의 속도로 aCSF로 관류합니다. 슬라이스 앵커를 사용하여 슬라이스를 고정합니다.
    2. 경사 적외선 조명을 사용하는 광시야 현미경의 저배율(4x) 대물렌즈에서 LEC 레이어 5로 이동합니다. 파이알 표면에서 필요한 층까지의 거리를 측정하십시오.
      알림: 비스듬한 적외선 조명은 커버슬립 평면에 대해 ~3° 각도로 기록실 커버슬립 아래 약 55mm에 근적외선 LED를 배치하여 달성되었습니다(그림 2B). 미분 간섭 대비는 슬라이스 전기 생리학에 일반적으로 사용되는 대체 이미징 기술입니다.
    3. 고배율 수침 대물렌즈(40x)로 변경하고 피라미드 뉴런을 식별합니다. 테이프로 컴퓨터 모니터에서 셀의 위치를 표시하십시오.
      참고: 피라미드 뉴런은 슬라이스의 파이얼 표면을 향해 돌출된 두드러진 정점 수상 돌기가 있는 대략 삼각형 형태를 가지고 있습니다(그림 3A). 세포 건강은 응축되고 가시적인 핵이 없고 매끄럽게 보여야 하는 원형질막을 검사하여 평가할 수 있습니다. 옵신-형광단 융합 단백질에 의한 축삭의 명확한 형광 표지는 광시야 형광 현미경을 사용할 때 보이지 않을 것입니다. 축삭 투영을 시각화하려면 옵신의 형광단에 대한 1차 항체를 사용하여 사후 면역조직화학을 수행하고 동일하거나 유사한 파장의 형광단에 접합된 2차 항체로 증폭합니다.
  2. 전체 세포 패치 클램프의 형성.
    1. 피펫 풀러를 사용하여 붕규산 유리 마이크로피펫을 제조하고 여과된 세포내 기록 용액(120mM k-글루코네이트, 40mM 헤페스, 10mM KCl, 2mM NaCl, 2mM MgATP, 1mM MgCl, 0.3mM NaGTP, 0.2mM EGTA, 및 0.25% 바이오사이클틴)으로 채웁니다. UPW, pH 7.25, 285-300 mOsm). 채워진 마이크로피펫을 패치 클램프 증폭기 헤드스테이지의 전극 홀더에 놓고 전극 와이어가 세포 내 용액과 접촉하도록 합니다.
    2. 튜브로 전극 홀더 측면 포트에 연결된 마우스피스(플런저가 제거된 1mL 주사기 등)에 세게 불어 입으로 양압을 가하고 인라인 3방향 밸브를 닫아 압력을 유지합니다. 반월판이 형성되도록 현미경 대물렌즈를 올리고 현미경에서 볼 수 있을 때까지 전극을 반월판에 삽입합니다.
    3. WinLTP16(또는 기타 수집 소프트웨어/오실로스코프)에서 씰 테스트 창을 열고 전압 클램프 모드의 증폭기를 사용하여 5mV 사각 펄스를 적용하여 피펫 저항이 3-6MΩ인지 확인합니다.
    4. 피펫 팁으로 식별된 세포 상에 접근하고 접촉하는 단계; 이로 인해 세포막이 움푹 들어가고(그림 3A, 오른쪽 패널) 피펫 저항이 약간 증가합니다(0.1MΩ).
    5. 양압을 해제하고 마우스피스에 적당한 흡입을 가하여 음압을 가하십시오. 이로 인해 피펫 저항(>1000MΩ)이 크게 증가합니다. 이제 압력을 중립으로 유지할 수 있습니다. 세포막이 파열되어 전체 세포 커패시턴스 과도 상태가 발생할 때까지 점차적으로 증가하는 램프에 음압을 가합니다.
  3. 광학적으로 유발된 시냅스 사건을 기록합니다.
    1. 전류 클램프 구성을 입력합니다.
      참고: 대부분의 경우 장거리 시냅스 전달은 글루타메이트성이므로 염화물 반전 전위에 가까운 막 전위에서 기록하면 AMPA 수용체(AMPAR) 매개 전파를 가장 잘 분리하고 유발된 피드포워드 억제(FFI)의 측정을 최소화할 수 있습니다. 염화물 반전은 세포 내 기록 용액 및 aCSF의 조성에 의존하며 골드만-호 지킨-카츠 방정식을 사용하여 계산할 수 있습니다. 위의 솔루션의 경우 -61.3mV였습니다. 층 5 LEC 피라미드 뉴런은 -62mV의 평균 휴지기 막 전위를 가졌으며, 필요한 경우 정전류 주입에 의해 이 전위를 유지하였다. 대안적으로, 셀들은 원하는 전위로 전압 클램핑될 수 있다. 장거리 억제 투영16 을 기록하거나 FFI를 기록하려면 양이온 반전 전위에서 전압 클램프를 사용하여 GABA 성 염화물 전도도를 분리합니다. 막 전위에서 활동 전위 임계 값을 초과하는 전압 클램핑 뉴런의 경우, 전압 게이트 나트륨 채널 차단제를 포함하는 세슘 기반 세포 내 용액을 사용하여 전압 클램프를 개선하고 활동 전위의 시작을 방지합니다 (130 mM CsMeSO 4, 10 mM Hepes, 8 mM NaCl, 5 mM QX 314 클로라이드,4 mM MgATP, 0.5 mM EGTA, 0.3 mM NaGTP, UPW에서 만든 0.25 % 바이오 사이클틴, pH 7.25, 285-300 mOsm).
    2. 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 트랜지스터-트랜지스터 로직 (TTL) 신호를 LED 드라이버로 전송하여 장착된 470nm LED를 활성화합니다. 장착된 LED는 필터 큐브와 적절한 광학 장치(그림 2B)를 사용하여 현미경 광 경로로 향하게 되어 40x 대물렌즈를 통해 슬라이스에 광 펄스를 적용하여 광유전학적 흥분성 시냅스 후 전위(oEPSP)를 불러일으킵니다.
      참고: 광 펄스는 주변/수상돌기 위에 적용될 수 있으며, 이로 인해 축삭 및 시냅스 전 부톤에서 옵신이 활성화되거나 조사자는 과도한 부톤 자극을 피하기 위해 기록된 세포에서 축삭으로 대물렌즈를 이동할 수 있습니다( 토론 참조). 최대 oEPSP 진폭은 시냅스 투영의 강도, 바이러스 주사의 효능 및 사용된 옵신에 따라 달라집니다. oEPSP는 다양한 광도 및/또는 지속시간(18)에 의해 원하는 진폭으로 적정될 수 있고; 광 펄스의 지속 시간을 변경하면(최대 LED 전력 출력에서 0.2-5ms 사이의 일반적인 지속 시간, 결과적으로 4.4mW/mm 광 밀도19) LED의 전력 출력을 변경하는 것보다 더 일관된 oEPSP 진폭을 제공합니다.
    3. 서로 다른 자극 간격을 가진 여러 광 펄스의 트레인을 전달하여 시냅스 전 방출 특성 (전압 변화)을 조사합니다 (그림 3E). 광유전학적으로 유발된 전파를 해석할 때 주의를 기울여야 합니다( 토론 참조).
    4. oEPSP19 를 반복적으로 유발하거나 리간드를 적용하여 장기 가소성을 조사합니다. 가소성 유도 전에 안정성을 보장하기 위해 oEPSP 진폭을 5-10분 동안 모니터링한 다음 안정적인 진폭에 도달할 때까지(일반적으로 30-40분) 모니터링합니다.
      참고: 대부분의 현재 옵신은 LTP를 유도하는 데 일반적으로 사용되는 것처럼 고주파에서 다중 활동 전위(예: 100Hz에서 전달되는 100개의 자극)를 안정적으로 불러일으킬 수 없습니다.
    5. oEPSP가 단시냅스인지 확인하려면 수지상 정자 위에 대물렌즈를 배치하고 0.5μM 테트로도톡신과 100μM 아미노피리딘이 있는 상태에서 자극하여 형질도입된 경로의 과도한 시합 활성화를 수행합니다. 테트로도톡신의 적용은 반응이 활동 전위 의존적 인 경우 전달을 폐지하고 아미노 피리딘을 포함하면 oEPSP가 단일 시냅스 적으로 생성되는 경우 부분적으로 전염을 회복합니다19,20.
    6. 바이오 사이클틴이 뉴런을 채울 수 있도록하려면 전체 세포 구성에 들어간 후 최소 15 분 동안 기다리십시오. 전압 클램프에서는 멤브레인 커패시턴스와 입력 저항을 모니터링합니다.
    7. 세포의 체세포에서 멀리 떨어진 접근 각도를 따라 피펫을 천천히 빼내고, 정전 용량 과도 상태 및 막 전류가 느리게 사라지는 것을 관찰하여 세포막의 재밀봉 및 피펫 팁에 아웃사이드 아웃 패치가 형성됨을 나타냅니다. 슬라이스의 방향과 슬라이스 내에서 셀의 위치를 확인합니다. 슬라이스를 24-웰 플레이트에 PFA에 넣고 4°C에서 밤새 배양한 다음, 0.1 M PB로 옮긴다.
      참고: 슬라이스는 최대 일주일 동안 보관할 수 있습니다. 더 긴 보관이 필요한 경우 PB를 정기적으로 변경하거나 아지드화나트륨(아지드화나트륨의 0.02%-0.2%)이 포함된 PB를 사용하십시오.

4. 조직학

  1. 슬라이싱 주사 부위
    1. 고정 후, 조직이 가라앉을 때까지(처음에는 자당 용액에 부유함) PB에서 30% 자당(w/v)으로 조직을 냉동 보호하며, 일반적으로 실온에서 밤새 또는 4°C에서 24-48시간 동안 지속됩니다.
    2. 최적 절단 온도(OCT) 배지를 사용하여 조직 블록을 저온 유지 표본 디스크에 부착합니다. 4.1.3에서 4.1.4 단계에 따라 조직 블록을 동결합니다.
    3. 적절한 용기에 이소 펜탄을 넣으십시오. 표본 디스크만 담그면 조직이 이소펜탄 수준보다 높도록 합니다. 이소 펜탄 용기를 액체 질소 (또는 드라이 아이스)로 내리고 조직이 얼도록하십시오.
    4. 완전히 동결되면(전체 조직 블록이 창백하고 단단해짐) 블록 온도가 평형을 이루도록 조직 블록을 -20°C의 저온유지 장치 챔버에 30분 동안 그대로 둡니다.
    5. -20°C에서 저온유지장치의 40μm 두께 섹션을 절단합니다. 가는 붓을 사용하여 블레이드에서 섹션을 안내합니다. 동결된 절편을 실온으로 접착시키고, 폴리L-lysine 코팅된, 유리 현미경 슬라이드를 접촉하여 절편에 슬라이드한다.
    6. 각 슬라이드에 약 150μL의 장착 매체를 추가하고 커버 슬립으로 덮습니다. 커버슬립을 부드럽게 눌러 기포를 제거합니다. 슬라이드를 덮어 광표백으로부터 보호하고 실온에서 최소 12시간(또는 밤새) 동안 자연 건조합니다. 형광 현미경을 사용하여 바이러스 주사 부위의 위치를 검사합니다.
  2. 바이오사이틴 염색 프로토콜
    참고: 이 프로토콜은 두꺼운 섹션에 적용할 수 있습니다. 슬라이스는 다시 절편 할 필요가 없습니다.
    1. 뇌 절편을 인산염 완충 식염수(PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 및 1.8 mM KH2PO4)로 세척당 10분 동안 6회 세척한다. 이송 피펫을 사용하여 각 단계 후에 웰을 비우십시오.
    2. 슬라이스를 PBS 중 3%H2O2(w/v)에서 30분 동안 인큐베이션하여 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단합니다. 이것은 산소 거품을 생성합니다.
    3. 세척 당 10 분 동안 또는 더 이상 산소 거품이 보이지 않을 때까지 PBS로 뇌 조각을 6 번 씻으십시오. 뇌 절편을 실온에서 0.1%(v/v) 트리톤 X-100을 함유한 PBS의 1%(v/v) 아비딘-비오티닐화 HRP 복합체(ABC) 용액에 3시간 동안 배양합니다.
    4. 뇌 슬라이스를 PBS로 6회 세척당 10분 동안 세척합니다.
    5. 각 슬라이스를 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 용액에서 뉴런 구조의 바이오사이틴 염색이 보일 때까지 몇 분 동안 배양합니다(약 5-10분 소요).
      주의 : DAB는 독성이 있습니다. 흄 후드에 사용하십시오.
      알림: DAB 배양 시간은 예측할 수 없으며 색상이 발달함에 따라 조직을 면밀히 모니터링하십시오.
    6. 슬라이스를 차가운 (4°C) PBS로 옮겨 반응을 중지시킨다. 뇌 슬라이스를 PBS로 6회 세척당 10분 동안 세척합니다. 브러시를 사용하여 뇌 조각을 poly-L-라이신 코팅 유리 현미경 슬라이드에 장착합니다.
    7. 깨끗한 티슈로 여분의 PBS를 모두 제거하십시오. 각 슬라이스를 약 200 μL의 장착 매체로 덮으십시오. 커버 슬립으로 덮고 커버 슬립을 부드럽게 눌러 기포를 밀어냅니다. 실온에서 최소 12시간(또는 밤새) 동안 자연 건조합니다. 광학 현미경을 사용하여 세포의 위치와 형태학적 세부 사항을 검사합니다.
      참고: 바이오사이틴은 대안적으로 형광단-접합된 스트렙타비딘을 사용하여 시각화할 수 있습니다. 그러나, 이미징은 절제 또는 컨포칼 현미경(21)의 사용을 필요로 할 수 있다.

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결과

이 프로토콜에서는 광유전학적 구조물의 바이러스 전달을 사용하여 장거리 시냅스 생리학 및 가소성을 연구하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 뇌의 거의 모든 장거리 연결을 연구하는 데 매우 쉽게 적용 할 수 있습니다. 예를 들어, 옵신을 암호화하는 AAV를 쥐 mPFC에 주입하고, LEC에서 급성 절편을 준비하고, 레이어 5 LEC 피라미드 뉴런에서 패치 클램프 기록하고, LEC에서 mPFC 말단의 광 유발 활성화를 설명합니다(그림 1).

건강한 피라미드 세포를 찾아 패치하였다(예를 들어, 도 3A). 본 mPFC 내지 LEC 예에서, 시냅스 후 세포는 표지되지 않았고; 시냅스 후 세포 식별이 필요한 경우 형광 마커를 발현하는 세포를 광시야 광학을 사용하여 국소화해야 합니다(예: 그림 3B). 세포의 건강은 실험 전에 적외...

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토론

여기에 제시된 프로토콜은 광유전학적 구조를 암호화하는 AAV를 전달하기 위한 정위 수술과 급성 뇌 절편에서 전기생리학의 조합을 사용하여 고도로 특이적인 장거리 시냅스 투영을 탐색하는 방법을 설명합니다(그림 1). 이러한 기술은 함께 기존의 비특이적 전기 자극을 사용하여 이전에는 접근 할 수 없었던 장거리 및 해부학 적으로 확산 된 경로에서 높은 정밀도로 뇌 회로의 생리학 및 가소성을 특성화하는 도구를 제공합니다. 세포-특이적 분자 마커와의 조합은 하나의 뇌 영역으로부터 다른 영역(23)의 상이한 정의된 세포 집단으로의 투영의 특성화를 허용한다.

이 기술의 고정밀 특성을 최대한 활용하려면 경로 특이성을 확인하는 것이 필수적입니다. 이 작업은 여러 단계로 수행됩니다. 기록하는 동안 조사중인 시냅스가 단일 시냅스인지 확인하십시오 (3.3.5 단계). 그런 다음 주사 부위를 조직학적으로 검사...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 Wellcome 보조금 206401/Z/17/Z의 지원을 받습니다. 전문가 멘토링을 해주신 Zafar Bashir 님과 원고에 대한 기술 지원 및 의견을 주신 Clair Booth 박사에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.2 mL 튜브Fisher Scientific Ltd12134102
10 µ L 피펫GilsonFD10001
24 웰 플레이트SARSTEDT83.3922
3 웨이 루어 밸브Cole-ParmerWZ-30600-02
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrateVector LaboratoriesSK-4105
40x objectiveOlympusLUMPLFLN40XW
4-aminopyridineHello BioHB1073
4x 대물렌즈OlympusPLN4X/0.1
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherryAddgene35512바이러스 역가: 3.3x1013 GC/ml
무채색 렌즈Edmund Optics49363초점 시각 스펙트럼 및 근적외선
탁상용 마이크로 원심분리기벤치마크 ScientificC1005*
BiocytinSigma-AldrichB4261
Borosillicate 유리 모세관Warner InstrumentsG150F-6
BurrFine science tools19008-07
CaCl2Sigma-AldrichC5670
Camera - Qimaging Retiga ElectroPhotometrics01-ELECTRO-M-14-C
CarbacholTocris2810
클로르헥시딘 수술용 스크럽VetaseptXHG008
클리퍼Andis22445AGC Super 2단 탈착식 블레이드 클리퍼
시준 콘덴서 렌즈ThorLabsACL2520-A
CoverslipsFisher Scientific Ltd10011913
CryostatLeicaCM3050 S
CsMeSO4Sigma-AldrichC1426
시아노아크릴레이트 접착제Rapid Electronics Ltd84-4557
데이터 수집 장치National InstrumentsUSB-6341 BNC
D-glucoseSigma-AldrichG8270
Dichroic mirror 500 nm long-passEdmund Optics69899
이색성 거울 600nm 장역 통과Edmund Optics69901
이색성 거울 큐브ThorLabsCM1-DCH/M
EGTA밀포어324626
전극 홀더HEKA895150
방출 필터Chroma59022m
여기 필터ChromaET570/20x
아이 젤DechraLubrithal
미세 페인트 브러시과학 실험실 용품BRU2052
단두대세계 정밀 기기DCAP
HEPES시그마 - 알드리치H3375
과산화수소 용액시그마 - 알드리치H100930 % (w / w)
이소 플루란Henry Schein988-3245
이소 펜탄시그마 - 알드리치M32631
KCl시그마 - 알드리치P3911
k- 글루 코네이트 시그마 - 알드리치G4500
운동 형광 필터 큐브ThorLabsDFM1T1
LED 드라이버ThorLabsLEDD1B
리도카인 연고Teva80007150
MgATPSigma-AldrichA9187
MgClSigma-AldrichM2670
MgSO4Sigma-AldrichM7506
Micro drillHarvard Apparatus75-1887
Microelectrode pullerSutter instrumentsP-87
마이크로인젝션 주사기Hamilton7634-01/00
마이크로인젝션 주사기 바늘Hamilton7803-05맞춤 사양: 게이지 33, 길이 15mm, 포인트 스타일 4 - 12°;
미세 주입 주사기 펌프World Precision InstrumentsUMP3T-1
장착 파란색 LEDThorLabsM470L5
장착 녹색 LEDThorLabsM565L3
Na2HPO4.7H2O시그마-알드리치S9390
NaCl시그마-알드리치S9888
NaGTP시그마-알드리치G8877
NaH2PO4Sigma-AldrichS0751
NaH2PO4.H2OSigma-AldrichS9638
NaHCO3Sigma-AldrichS5761
NIR LEDOSRAMSFH4550슬라이스의 굴절 IR 이미징에 사용되는 미분 간섭 대비(DIC) 광학은 일반적으로 사용되는 또 다른 방법입니다
. OCT 매체VWR InternationalRAYLLAMB/OCT최적 절단 온도 매체
파라포름알데히드시그마-알드리치158127
파라포름알데히드시그마-알드리P6148
패치 클램프 증폭기분자 장치700A
연동 펌프World Precision InstrumentsMinistar
Poly-L-lysine 코팅 현미경 슬라이드Fisher Scientific Ltd23-769-310
녹음 챔버Warner InstrumentsRC-26G
메스 블레이드Swann Morton#24
슬라이스 앵커Warner InstrumentsSHD-26-GH/15
입체 액자KopfModel 902
마이크로 드릴 용 입체 홀더Harvard Apparatus75-1874
SucroseSigma-AldrichS0389
수술 현미경Carl ZeissOPMI 1 FR pro
SutureEthiconW577H
세포 내 기록 용 주사기 필터 해결책Thermo Scientific Nalgene171-0020
Tetrodotoxin citrateHello BioHB1035
이송 피펫Fisher Scientific Ltd10458842
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Upright 형광 현미경LeicaDM6 B
VECTASHIELD DAPI가 있는 안티페이드 마운팅 배지Vector LaboratoriesH-1200-10
VECTASTAIN ABC-HRP 키트Vector LaboratoriesPK-4000
VibratomeCampden Instruments7000smz-2
WinLTPhttps://www.winltp.com/버전 2.32데이터 수집 소프트웨어
Solution
aCSF
자당 절단 용액
PFA
Intracellular?
측면 포트가 있는 치

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