생체 외 내측 전두엽 피질에서 외측 내후각 피질까지의 장거리 시냅스 전달 및 가소성에 대한 광유전학적 심문

Lisa Kinnavane; Paul J. Banks

doi:10.3791/63077

방법 논문

생체 외 내측 전두엽 피질에서 외측 내후각 피질까지의 장거리 시냅스 전달 및 가소성에 대한 광유전학적 심문

DOI:

10.3791/63077

⸱

2022년 2월 25일

Lisa Kinnavane¹ , Paul J. Banks¹

¹School of Physiology, Pharmacology and Neuroscience, University of Bristol

이 논문에서

요약

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여기서 우리는 급성 설치류 뇌 조각에서 시냅스 특이적 전기생리학적 특성을 허용하기 위해 광유전학적 구조를 가진 분리된 뇌 영역의 바이러스 형질도입을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

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뇌의 특정 시냅스의 생리적 특성과 소성 변화를 겪는 방법을 연구하는 것은 현대 신경 과학의 핵심 과제입니다. 전통적인 체외 전기 생리 학적 기술은 전기 자극을 사용하여 시냅스 전달을 불러 일으 킵니다. 이 방법의 주요 단점은 비특이적 특성입니다. 자극 전극 영역의 모든 축삭이 활성화되어 특정 구 심성 연결에 영향을 미치기가 어렵습니다. 이 문제는 전기 자극을 광유전학 기반 자극으로 대체함으로써 극복할 수 있습니다. 우리는 광유전학을 시험관 내 패치 클램프 기록과 결합하는 방법을 설명합니다. 이것은 정확한 해부학 적으로 정의 된 시냅스 연결의 기저 시냅스 전달과 시냅스 가소성 모두를 연구하기위한 강력한 도구이며 뇌의 거의 모든 경로에 적용 할 수 있습니다. 여기에서는 설치류 뇌의 시냅스 전 관심 영역(내측 전전두엽 피질)에 외과적 주사를 위한 채널로돕신 단백질을 코딩하는 바이러스 벡터의 준비 및 처리와 하류 표적 영역(측면 entorhinal cortex)의 급성 절편을 만드는 방법에 대해 설명합니다. 장단기 시냅스 가소성을 연구하기 위해 패치 클램프 기록과 광 자극에 의한 시냅스 활성화를 결합하는 자세한 절차도 제시됩니다. 우리는 광유전학과 Cre 의존성 세포 표지를 결합하여 경로 및 세포 특이성을 달성하는 실험의 예를 논의합니다. 마지막으로, 관심 전 시냅스 영역의 조직학적 확인은 시냅스 후 세포의 바이오사이틴 표지와 함께 설명되어, 정확한 위치 및 세포 유형의 추가 식별을 가능하게 한다.

서론

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시냅스의 생리학과 시냅스가 어떻게 소성 변화를 겪는지를 이해하는 것은 건강한 뇌에서 뇌 네트워크가 어떻게 기능하는지1,^{그리고 뇌 장애}에서 어떻게 오작동하는지 이해하는 데 필수적입니다. 급성 생체 외 뇌 슬라이스를 사용하면 전체 세포 패치 클램프 기록을 사용하여 신호 대 잡음비가 높은 단일 뉴런에서 시냅스의 전기적 활동을 기록 할 수 있습니다. 막 전위의 제어와 간단한 약리학 적 조작은 수용체 아형의 분리를 가능하게합니다. 이러한 기록은 층류 및 하위 영역^{위치 2}, 세포 형태³, 분자 마커의 존재⁴, 구 심성 투영⁵, 또는 최근에 활성화 된 경우에도⁶을 포함하는 시냅스 후 뉴런을 식별하기 위해 절묘한 특이성으로 이루어질 수 있습니다.

그러나 시냅스 전 입력의 특이성을 달성하는 것은 다소 어렵습니다. 종래의 방법은 특정 층에서 실행되는 축삭을 흥분시키기 위해 자극 전극을 사용했습니다. 이것의 예는 지층 반경의 국소 자극이 CA3에서 CA1 하위 필드

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프로토콜

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모든 동물 절차는 영국 동물 과학 절차법 (1986) 및 관련 지침 및 지역 기관 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 정위 바이러스 주사

참고: 현재 프로토콜은 해부학적이지만 시냅스 후 세포 유형, 특이성은 필요하지 않습니다.

적절한 동물을 선택하십시오. 수컷 야생형 리스터 후드 래트를 이 프로토콜에 사용하였다(300-350 g, 대략 3개월령).
적절한 바이러스 구조를 선택하십시오. 고려해야 할 몇 가지 요소가 있습니다(토론 참조). 현재 프로토콜은 바이러스를 사용하여 광유전학적 채널 ChETA_TC 12를 발현하고 흥분성 뉴런을 형질도입합니다(AAV9 - CaMKIIa - ChR2(E123T/T159C) - mCherry; 역가: 3.3 x 10 ¹³ 바이러스 게놈/mL).
앞서 설명한 바와 같이 뇌 지도책을 사용하여 주입의 좌표와 부피를 설정합니다³⁵.
바이러스 제제의 정위 주사
참고: 동물의 사용 및 관리에 ....

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결과

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이 프로토콜에서는 광유전학적 구조물의 바이러스 전달을 사용하여 장거리 시냅스 생리학 및 가소성을 연구하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 뇌의 거의 모든 장거리 연결을 연구하는 데 매우 쉽게 적용 할 수 있습니다. 예를 들어, 옵신을 암호화하는 AAV를 쥐 mPFC에 주입하고, LEC에서 급성 절편을 준비하고, 레이어 5 LEC 피라미드 뉴런에서 패치 클램프 기록하고, LEC에서 mPFC 말단의 광 유발 활성화를 설명합니다(그림 1).

건강한 피라미드 세포를 찾아 패치하였다(예를 들어, 도 3A). 본 mPFC 내지 LEC 예에서, 시냅스 후 세포는 표지되지 않았고; 시냅스 후 세포 식별이 필요한 경우 형광 마커를 발현하는 세포를 광시야 광학을 사용하여 국소화해야 합니다(예: 그림 3B). 세포의 건강은 실험 전에 적외.......

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토론

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여기에 제시된 프로토콜은 광유전학적 구조를 암호화하는 AAV를 전달하기 위한 정위 수술과 급성 뇌 절편에서 전기생리학의 조합을 사용하여 고도로 특이적인 장거리 시냅스 투영을 탐색하는 방법을 설명합니다(그림 1). 이러한 기술은 함께 기존의 비특이적 전기 자극을 사용하여 이전에는 접근 할 수 없었던 장거리 및 해부학 적으로 확산 된 경로에서 높은 정밀도로 뇌 회로의 생리학 및 가소성을 특성화하는 도구를 제공합니다. 세포-특이적 분자 마커와의 조합은 하나의 뇌 영역으로부터 다른 영역(²³)의 상이한 정의된 세포 집단으로의 투영의 특성화를 허용한다.

이 기술의 고정밀 특성을 최대한 활용하려면 경로 특이성을 확인하는 것이 필수적입니다. 이 작업은 여러 단계로 수행됩니다. 기록하는 동안 조사중인 시냅스가 단일 시냅스인지 확인하십시오 (3.3.5 단계). 그런 다음 주사 부위를 조직학적으로 검사.......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 작업은 Wellcome 보조금 206401/Z/17/Z의 지원을 받습니다. 전문가 멘토링을 해주신 Zafar Bashir 님과 원고에 대한 기술 지원 및 의견을 주신 Clair Booth 박사에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.2 mL 튜브	Fisher Scientific Ltd	12134102
10 µ L 피펫	Gilson	FD10001
24 웰 플레이트	SARSTEDT	83.3922
3 웨이 루어 밸브	Cole-Parmer	WZ-30600-02
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate	Vector Laboratories	SK-4105
40x objective	Olympus	LUMPLFLN40XW
4-aminopyridine	Hello Bio	HB1073
4x 대물렌즈	Olympus	PLN4X/0.1
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry	Addgene	35512	바이러스 역가: 3.3x10¹³ GC/ml
무채색 렌즈	Edmund Optics	49363	초점 시각 스펙트럼 및 근적외선
탁상용 마이크로 원심분리기	벤치마크 Scientific	C1005*
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261
Borosillicate 유리 모세관	Warner Instruments	G150F-6
Burr	Fine science tools	19008-07
CaCl₂	Sigma-Aldrich	C5670
Camera - Qimaging Retiga Electro	Photometrics	01-ELECTRO-M-14-C
Carbachol	Tocris	2810
클로르헥시딘 수술용 스크럽	Vetasept	XHG008
클리퍼	Andis	22445	AGC Super 2단 탈착식 블레이드 클리퍼
시준 콘덴서 렌즈	ThorLabs	ACL2520-A
Coverslips	Fisher Scientific Ltd	10011913
Cryostat	Leica	CM3050 S
CsMeSO₄	Sigma-Aldrich	C1426
시아노아크릴레이트 접착제	Rapid Electronics Ltd	84-4557
데이터 수집 장치	National Instruments	USB-6341 BNC
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Dichroic mirror 500 nm long-pass	Edmund Optics	69899
이색성 거울 600nm 장역 통과	Edmund Optics	69901
이색성 거울 큐브	ThorLabs	CM1-DCH/M
EGTA	밀포어	324626
전극 홀더	HEKA	895150
방출 필터	Chroma	59022m
여기 필터	Chroma	ET570/20x
아이 젤	Dechra	Lubrithal
미세 페인트 브러시	과학 실험실 용품	BRU2052
단두대	세계 정밀 기기	DCAP
HEPES	시그마 - 알드리치	H3375
과산화수소 용액	시그마 - 알드리치	H1009	30 % (w / w)
이소 플루란	Henry Schein	988-3245
이소 펜탄	시그마 - 알드리치	M32631
KCl	시그마 - 알드리치	P3911
k- 글루 코네이	트 시그마 - 알드리치	G4500
운동 형광 필터 큐브	ThorLabs	DFM1T1
LED 드라이버	ThorLabs	LEDD1B
리도카인 연고	Teva	80007150
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187
MgCl	Sigma-Aldrich	M2670
MgSO₄	Sigma-Aldrich	M7506
Micro drill	Harvard Apparatus	75-1887
Microelectrode puller	Sutter instruments	P-87
마이크로인젝션 주사기	Hamilton	7634-01/00
마이크로인젝션 주사기 바늘	Hamilton	7803-05	맞춤 사양: 게이지 33, 길이 15mm, 포인트 스타일 4 - 12°;
미세 주입 주사기 펌프	World Precision Instruments	UMP3T-1
장착 파란색 LED	ThorLabs	M470L5
장착 녹색 LED	ThorLabs	M565L3
Na2HPO4.7H2O	시그마-알드리치	S9390
NaCl	시그마-알드리치	S9888
NaGTP	시그마-알드리치	G8877
NaH₂PO₄	Sigma-Aldrich	S0751
NaH₂PO_4.H₂O	Sigma-Aldrich	S9638
NaHCO₃	Sigma-Aldrich	S5761
NIR LED	OSRAM		SFH4550슬라이스의 굴절 IR 이미징에 사용되는 미분 간섭 대비(DIC) 광학은 일반적으로 사용되는 또 다른 방법입니다
. OCT 매체	VWR International	RAYLLAMB/OCT	최적 절단 온도 매체
파라포름알데히드	시그마-알드리치	158127
파라포름알데히드	시그마-알드리	P6148
패치 클램프 증폭기	분자 장치	700A
연동 펌프	World Precision Instruments	Ministar
Poly-L-lysine 코팅 현미경 슬라이드	Fisher Scientific Ltd	23-769-310
녹음 챔버	Warner Instruments	RC-26G
메스 블레이드	Swann Morton	#24
슬라이스 앵커	Warner Instruments	SHD-26-GH/15
입체 액자	Kopf	Model 902
마이크로 드릴 용 입체 홀더	Harvard Apparatus	75-1874
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
수술 현미경	Carl Zeiss	OPMI 1 FR pro
Suture	Ethicon	W577H
세포 내 기록 용 주사기 필터 해결책	Thermo Scientific Nalgene	171-0020
Tetrodotoxin citrate	Hello Bio	HB1035
이송 피펫	Fisher Scientific Ltd	10458842
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Upright 형광 현미경	Leica	DM6 B
VECTASHIELD DAPI가 있는 안티페이드 마운팅 배지	Vector Laboratories	H-1200-10
VECTASTAIN ABC-HRP 키트	Vector Laboratories	PK-4000
Vibratome	Campden Instruments	7000smz-2
WinLTP	https://www.winltp.com/	버전 2.32	데이터 수집 소프트웨어
Solution
aCSF
자당 절단 용액
PFA
Intracellular?

측면 포트가 있는 치

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
Poorthuis, R. B., et al. Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nico....

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재료

참고문헌

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