방법 논문

비알코올성 지방간염 마우스 모델에서 간 세포외 기질의 3D 이미징

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DOI:

10.3791/63106

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2022년 2월 25일

 ,  ,  , 
1Gastroenterology and Hepatology, Stanford University

이 논문에서

요약

현재 프로토콜은 비알코올성 지방간염(NASH) 동안 세포외 기질(ECM) 리모델링의 역학을 시각화하기 위한 신뢰할 수 있는 플랫폼을 구축하기 위해 간 상피내 관류/탈세포화 및 이광자 현미경 방법을 최적화합니다.

초록

비알코올성 지방간염(NASH)은 미국에서 가장 흔한 만성 간 질환으로 7천만 명 이상의 미국인에게 영향을 미칩니다. NASH는 섬유증으로 진행될 수 있으며 결국 간세포 암종의 중요한 위험 요소인 간경변으로 진행될 수 있습니다. 세포외 기질(ECM)은 구조적 지원을 제공하고 모세포 신호를 통해 간 항상성을 유지합니다. 간 섬유증은 동적 ECM 리모델링 과정의 불균형으로 인해 발생하며 구조 요소의 과도한 축적 및 글리코사미노글리칸의 관련 변화를 특징으로 합니다. NASH의 전형적인 섬유증 패턴은 "치킨 와이어"라고 불리며, 일반적으로 Masson의 삼색 염색과 Picrosirius Red 염색에 의해 관찰되는 특징을 기반으로 영역 3 perisinusoidal/pericellular 섬유증으로 구성됩니다. 그러나 이러한 기존의 얇은 2차원(2D) 조직 슬라이드 기반 이미징 기술은 상세한 3차원(3D) ECM 구조 변화를 입증할 수 없어 간 섬유증에서 동적 ECM 리모델링에 대한 이해를 제한합니다.

현재 작업은 위의 문제를 해결하기 위해 탈세포화를 통해 간의 기본 ECM 구조를 이미지화하는 빠르고 효율적인 프로토콜을 최적화했습니다. 쥐에게 14주 동안 차우나 패스트푸드 식단을 먹였습니다. 제자리 문맥 관류 후 탈세포화를 수행하고, 이광자 현미경 기술을 적용하여 천연 ECM의 변화를 이미지화하고 분석했습니다. 정상 간과 NASH 간의 3D 이미지를 재구성하고 분석했습니다. 현장 관류 탈세포화를 수행하고 이광자 현미경으로 스캐폴드를 분석함으로써 간에서 동적 ECM 리모델링을 시각화할 수 있는 실용적이고 신뢰할 수 있는 플랫폼을 제공했습니다.

서론

비알코올성 지방간 질환(NAFLD)은 성인 인구의 20%-25%에 영향을 미치는 가장 흔한 간 질환입니다. NAFLD 환자의 25%는 비알코올성 지방간염(NASH)으로 진행되며, 여기서 간경변, 간부전 및 간세포 암종의 위험이 증가합니다1. 향후 20년 동안 NASH는 미국에서 200만 명의 간 관련 사망을 차지할 것으로 추정됩니다. 승인된 치료법이 없기 때문에 NASH 환자에서 간 섬유증을 유발하는 메커니즘을 해독하고 표적 치료법을 개발하는 것이 시급합니다3.

세포외 기질(ECM)은 조직 항상성을 조절하기 위해 세포와 양방향 통신을 발휘하는 역동적이고 복잡한 미세환경이다4. 간 ECM은 프로테오글리칸, 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴 및 기타 비구조적 단백질(예: 올팩토메딘 및 트롬보스폰딘)과 같은 구조적 요소로 구성되어 물리적 및 구조적 지지를 제공한다4.

간 섬유증은 NASH3를 포함한 다양한 병인의 간 손상에 대한 만성 상처 치유 반응입니다. 이는 동적 ECM 매트릭스 리모델링 과정의 불균형으로 인해 발생하며 손상된 간에서 과도한 구조 단백질을 특징으로 합니다4. 섬유 형성은 서로 다른 간 세포 유형 간의 동적 세포-세포 통신에 달려 있습니다. 간 성상 세포(HSC)가 활성화되면 평활근 알파 2 액틴 발현, 이동 및 증식 근섬유아세포 유사 세포로 분화하고 상처 봉합 작용으로 ECM 단백질을 합성합니다. 활성화된 HSC는 간에서 콜라겐을 생성하는 세포의 중심입니다1.

ECM 리모델링의 분자 메커니즘, 섬유증의 패턴 및 세포 사건과의 관계는 명확하지 않습니다. 3차원(3D) ECM 구조에 대한 더 나은 이해는 질량분석법 기술이 ECM 단백질 조성을 분석하는 데 도움이 되었음에도 불구하고 여전히 필요하다4. 전통적으로 Masson의 삼색 염색, Picro Sirius Red 염색 및 SHG(2차 고조파 생성) 이미징은 2차원(2D) 얇은 간 섹션에서 수행되었습니다. NASH의 전형적인 섬유증 패턴은 "치킨 와이어"라고 불리며, 이는 영역 3까지 확장되며 perisinusoidal/pericellular fibrosis 5,6입니다. 그러나 천연 간의 3D 구조, 특히 조직 절편을 포함하지 않는 연구에 초점을 맞춘 연구가 부족했습니다. 간 섬유증에서 동적 ECM 리모델링 전반에 걸쳐 섬유증의 패턴과 특성을 식별하기 위한 강력한 이미징 접근 방식은 NASH 메커니즘에 대한 이해를 크게 강화하고 새로운 치료 표적을 식별할 것입니다.

이러한 문제를 해결하기 위해 탈세포화(decellularization)를 통해 천연 간 ECM을 이미지화하도록 빠르고 효율적인 프로토콜을 최적화했습니다7. 전체 간 탈세포화는 세제 관류를 통해 기본 3D ECM 네트워크를 유지하면서 간 세포 내용물을 제거하는 접근 방식입니다. 마우스는 14주 동안 차우 또는 패스트푸드 식단(FFD)을 먹였습니다. 탈세포화는 삼중 나선 및 천연 원섬유 콜라겐 구조를 보존하기 위해 중성 세제와 낮은 유속으로 현장 문맥 관류 후 수행되었습니다. ECM의 콜라겐 구조 변화를 분석하기 위해 이광자 현미경을 적용했습니다. 정상 및 NASH 간에서 기본 ECM 구조의 3D 이미지를 재구성하고 분석했습니다. 현장 관류 탈세포화를 수행하고 이광자 현미경으로 스캐폴드를 분석하면 간에서 동적 ECM 리모델링을 시각화할 수 있는 실용적이고 저렴한 플랫폼을 제공합니다.

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프로토콜

동물 실험은 스탠포드 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUCs)와 팔로 알토의 재향 군인 병원에서 승인 한 실험 절차에 따라 수행됩니다. 6-8주령의 수컷 C57BL/6J 마우스에게 14주 동안 식수에 4.2% 고과당 옥수수 시럽( 표 참조)이 첨가된 사료 또는 패스트푸드 사료를 먹였다5. 마우스는 12시간 어두운/밝은 주기로 표준 케이지에 보관되었습니다.

1. 간 관류의 외과적 준비 및 절차

  1. 시술 전에 마우스의 무게를 잰다.
  2. 복강 주사를 통해 케타민(90mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)( 재료 표 참조)을 투여하여 마우스를 마취합니다. 다음 단계를 진행하기 전에 발가락을 꼬집어 마우스가 완전히 마취되었는지 확인하십시오.
    참고: 이소플루란은 비생존 수술이기 때문에 여기에 필요하지 않습니다.
  3. 머리 깎기를 사용하여 복부 부위를 면도하고 70 % 에탄올로 피부를 소독하십시오. 마우스를 뒤쪽에 놓고 테이프로 수술 보드에 다리를 고정시킵니다.
  4. 발가락 꼬집음으로 마취 깊이를 재확인한 후 Mayo 가위와 Adson 집게( 재료 표 참조)를 사용하여 하복부를 옆으로 3cm 절개한 다음 하복부에서 검상돌기까지 수직으로 5cm 절개합니다. 흉강이 열리지 않도록 주의하십시오.
  5. 복막을 연 후 장을 동물의 왼쪽에 부드럽게 놓고 레이온 팁 어플리케이터( 재료 표 참조)로 간 오른쪽 엽을 들어 올려 문맥을 노출시킵니다.
  6. 24G IV 카테터를 사용하여 문맥을 카테터로 삽입합니다. 문맥의 말단부에 카테터를 삽입합니다. 문맥이 간엽으로 분기되기 전에 카테터 팁을 놓습니다.
  7. 카테터가 정맥에 들어가면 즉시 바늘을 빼십시오. 카테터를 통해 1mL 주사기를 사용하여 PBS로 간을 관류하여 카테터가 정맥 내부에 올바르게 위치하는지 확인합니다.
    참고: PBS 관류 시 모든 로브는 즉시 희미해져야 합니다. 카테터가 올바르게 배치되면 정맥혈이 카테터를 통해 빠르게 흐릅니다.
  8. Dumont 마이크로 집게, Castroviejo 미세 바늘 홀더 및 4-0 봉합사( 재료 표 참조)를 사용하여 문맥 분기 아래에 스티치를 배치하고 1cm 아래에 두 번째 스티치를 배치하여 카테터를 고정합니다.

2. 조직 탈세포화

  1. Luer 커넥터를 사용하여 카테터를 실리콘 튜브(길이 ~1m, 내경 3mm, 외경 4.1mm)에 연결합니다. 실리콘 튜브를 연동 펌프와 탈이온수가 들어 있는 저장소에 연결합니다( 재료 표 참조).
  2. 튜브 내부의 기포를 조심스럽게 제거하고 관류 중에 새로운 기포가 생성되지 않도록 하십시오. 연동 펌프를 0.2mL/분(즉, 288mL/24시간)의 유량으로 설정합니다.
  3. 먼저 탈이온수(~50mL/마우스)로 2시간 동안 관류합니다. 관류 중에 간색이 빨간색에서 노란색으로 바뀝니다.
    참고: 동물은 관류 10분 후에 만료됩니다.
  4. 관류 용액을 0.5%(wt/vol) 나트륨 데옥시콜레이트(DOC, 재료 표 참조)로 전환하고 밤새(18시간, ~250mL/마우스) 계속합니다. 간은 관류가 끝나면 하얗게 됩니다(그림 1).
  5. 관류 용액을 탈이온수(~50mL/마우스)로 전환하고 2시간 동안 관류합니다.
  6. Dumont 마이크로 집게와 마이크로 스프링 가위( 재료 표 참조)를 사용하여 탈세포화된 간을 채취하고 PBS가 포함된 페트리 접시에서 조심스럽게 세척합니다.
  7. 탈세포화된 조직을 작은 조각으로 절단하여 즉각적인 이미징을 수행하거나 탠덤 질량 분석법, ELISA 또는 웨스턴 블롯과 같은 추가 생화학적 분석을 위해 -80°C에서 동결합니다.

3. 이미징을 위한 슬라이드 준비(다광자/공초점 형광 현미경 사용)

  1. 탈세포화된 간 조각(<3 x 3 x 3mm)을 현미경 슬라이드로 옮기고 조직을 중간에 놓습니다.
  2. 조직 건조를 방지하기 위해 피펫으로 10μL의 페이드 방지 마운팅 배지( 재료 표 참조)를 조직에 추가합니다.
  3. 커버 유리로 조직을 덮고 작은 힘을 가하여 샘플을 평평하게 만듭니다. 커버 유리의 가장자리를 무색 투명 매니큐어로 밀봉합니다(그림 2).
    참고: 현미경을 통한 직립 이광자의 설정으로 인해 샘플에 커버 유리가 사용되었습니다. 그러나 도립 현미경을 사용하는 경우 샘플을 다르게 배치할 수 있습니다.

4. 이미지 획득

  1. 커버 유리 상단에 침지 오일 한 방울을 떨어뜨리고 슬라이드를 현미경 슬라이드 홀더에 놓습니다. 이멀젼 오일에 닿을 때까지 20x 오일 대물 렌즈를 내립니다.
  2. 보라색(405nm) 채널로 전환하고 셔터를 켜고 샘플에 초점을 맞춥니다. 이미징을 위해 관심 영역을 탐색하고 배치합니다. 레이저 광을 사용한 이미지 획득으로 이동하기 전에 셔터를 끄십시오.
  3. 컴퓨터 제어로 전환하고 이광자 레이저를 시작합니다. 먼저 이광자 레이저를 켠 다음(그림 3A) 이광자 레이저 컨트롤러(재료 표 참조)와 셔터(그림 3B, C)를 켭니다. 출력 전력이 2.5W보다 높은지 확인하십시오.
    형광 소광을 방지하기 위해 레이저 출력을 줄입니다. 선택한 형광단을 수용하기 위해 검출기(광전자 증배관과 하이브리드 모두)를 선택하고 조정합니다.
    참고: 이광자 이미징은 860nm의 여기 파장에서 수행되었습니다. 콜라겐 SHG 및 이광자 여기 형광(TPEF) 이미지를 위해 각각 2개의 채널을 선택했습니다. 415-445 nm의 파장 범위에 해당하는 하나의 채널은 SHG 신호에서 콜라겐의 상세한 구조를 감지했습니다. 또 다른 채널은 TPEF 신호를 수집하기 위해 465-669nm 범위를 커버했습니다.
  4. 동시 또는 순차적 이미지 획득을 선택합니다. 핀홀을 가장 높은 값으로 조정합니다. 레이저 파장, 게인, 전력 및 오프셋을 조정합니다. 픽셀 유지 시간, 픽셀 크기, 평균화 및 확대/축소를 조정합니다(그림 4A).
  5. 컴퓨터 z-컨트롤러를 스크롤하여 z-치수를 설정하고, 시작 및 끝점을 정의하고, 볼륨(z-스택) 내에서 제공되는 이미지 수를 선택합니다. 이미지를 획득합니다.
    참고: 여기서는 20μm Z 부피와 1μm Z 단계 크기를 선택했습니다(그림 4B).

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결과

콜라겐 섬유는 2차 고조파 생성 및 이광자 현미경으로 검출되었습니다. 신호는 부서지기 쉬운 삼중 나선 및 천연 원섬유 콜라겐 구조에서 비롯됩니다. 콜라겐 아형을 분석하기 위해 특정 항체를 사용하지 않았습니다. 그러나 이것은 이미징 기술에 추가될 수 있습니다.

탈세포화 없이 간 조직을 연구할 때 콜라겐 네트워크의 고해상도 이미지를 얻는 것은 어렵습니다 (그림 5A). 탈세포화된 ECM에서 콜라겐 섬유(녹색)는 평행하거나 서로 얽혀 있는 것처럼 보입니다 (그림 5B). Chow와 FFD 간 사이의 ECM 구성 요소의 형태 및 공간 분포에 명백한 차이가 있었습니다. 차우 식단을 섭취한 쥐의 콜라겐 섬유는 서로 얽히고 잘 조직된 네트워크를 나타냈습니다. 그러나 FFD를 사용하는 마우스에서는 콜라겐 다발이 더 적은 연결성으...

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토론

현재 프로토콜은 저유속 DOC in situ 관류를 통한 탈세포화가 부서지기 쉬운 삼중 나선 및 천연 원섬유 콜라겐 구조를 보존하여 NASH 간 섬유증에서 동적 ECM 리모델링을 캡처하기 위한 안정적이고 비용 효율적인 플랫폼을 제공한다는 것을 보여줍니다. ECM 성분을 확인하거나 세포 배양을 위한 생물학적 스캐폴드를 생성하기 전에 정상 및 섬유성 간에서 탈세포화를 수행했지만, 간 섬유증에서 ECM 리모델링의 역학은 잘 연구되지 않았습니다 8,9,10. 이 방법을 통해 연구자는 다양한 섬유증 모델을 비교할 수 있습니다.

현재 DNase, 소듐 도데실 설페이트(SDS) 또는 Triton X-10011을 사용하는 다양한 관류 프로토콜이 있다. DNase는 대량의...

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공개 사항

저자는이 기사와 관련하여 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

기술적인 도움을 주신 박혜석 의원님께 감사드립니다. 이 연구는 국립 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소 (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, NJT), 국립 노화 연구소 (NIA), NIH (1R01AG060726, NJT)의 자금 지원으로 지원되었습니다. 이광자 현미경 이미징에 대한 기술 지원을 제공한 Beckman Center의 Cell Sciences Imaging Facility의 Jon Mulholland와 Kitty Lee에게 감사드립니다.

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재료

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참고문헌

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  11. Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33 (3), 448-458 (2013).
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