박테리아 집단에서 계층적 유전자형과 부속 게놈 유전자형의 휴리스틱 마이닝

요약

이 분석 전산 플랫폼은 박테리아 집단 유전체학에 관심이있는 미생물 학자, 생태 학자 및 역학자에게 실질적인 지침을 제공합니다. 구체적으로, 여기에 제시된 연구는 수행 방법을 보여주었습니다 : i) 계층 적 유전자형의 계통 유도 매핑; ii) 유전자형의 빈도 기반 분석; iii) 친족관계 및 클론성 분석; iv) 혈통 차별화 액세서리 유전자좌의 확인.

초록

박테리아 전체 게놈 시퀀싱 (WGS)의 일상적이고 체계적인 사용은 공중 보건 실험실 및 규제 기관이 수행하는 역학 조사의 정확성과 해상도를 향상시키고 있습니다. 공개적으로 이용 가능한 대량의 WGS 데이터를 사용하여 병원성 집단을 대규모로 연구 할 수 있습니다. 최근에는 박테리아 WGS 데이터를 사용하여 재현 가능하고 자동화되고 확장 가능한 계층 적 기반 집단 게놈 분석을 가능하게하기 위해 ProkEvo라는 자유롭게 사용할 수있는 계산 플랫폼이 게시되었습니다. ProkEvo의 이러한 구현은 생태 추론을위한 액세서리 게놈 콘텐츠의 마이닝과 인구의 표준 유전자형 매핑을 결합하는 것이 중요하다는 것을 보여주었습니다. 특히, 여기서 강조된 연구는 R 프로그래밍 언어를 사용한 인구 규모 계층적 분석을 위해 ProkEvo 파생 출력을 사용했습니다. 주요 목표는 미생물 학자, 생태 학자 및 역학자를위한 실용적인 가이드를 제공하는 것이 었습니다 : i) 계층 적 유전자형의 계통 안내 매핑을 사용하는 방법; ii) 생태적 적합성을 위한 프록시로서 유전자형의 빈도 분포를 평가하고; iii) 특정 유전자형 분류를 사용하여 혈연 관계 및 유전 적 다양성을 결정; iv) 부속 유전자좌를 차별화하는 계보를 지도한다. 재현성과 이식성을 향상시키기 위해 R markdown 파일을 사용하여 전체 분석 접근 방식을 시연했습니다. 예제 데이터 세트에는 동물 유행성 식품 매개 병원균 살모넬라 뉴포트의 2,365 단리물로부터의 게놈 데이터가 포함되었습니다. 계층적 유전자형(Serovar -> BAPS1 -> ST-> cgMLST)의 계통-앵커 매핑은 집단 유전 구조를 밝혀내고, 서열 유형(ST)을 키스톤 분화 유전자형으로 강조했다. 세 가지 가장 지배적 인 혈통에 걸쳐, ST5와 ST118은 고도로 클론 ST45 계통형보다 더 최근에 공통 조상을 공유했습니다. ST-기반 차이는 부속 항미생물 내성 (AMR) 유전자좌의 분포에 의해 더욱 강조되었다. 마지막으로, 계통 고정 시각화를 사용하여 계층 적 유전자형과 AMR 함량을 결합하여 혈연 구조 및 혈통 별 게놈 서명을 밝혀 냈습니다. 결합된이 분석 접근법은 범 게놈 정보를 사용하여 휴리스틱 박테리아 집단 게놈 분석을 수행하기위한 몇 가지 지침을 제공합니다.

서론

공중 보건 실험실 및 규제 기관의 일상적인 감시 및 역학 조사의 기초로 박테리아 전체 게놈 시퀀싱 (WGS)의 사용이 증가함에 따라 병원체 발병 조사 1,2,3,4가 크게 향상되었습니다. 그 결과, 대량의 비식별된 WGS 데이터가 현재 공개적으로 이용 가능하며, 여러 저장소, 지리적 지역 및 환경 유형에 걸친 집단 구조, 유전자형 빈도 및 유전자/대립유전자 빈도에 기초한 연구를 포함하여 전례 없는 규모로 병원성 종의 집단 생물학의 측면을 연구하는 데 사용될 수 있습니다⁵ . 가장 일반적으로 사용되는 WGS 유도 역학 조사는 공유 코어 게놈 콘텐츠만을 사용하는 분석을 기반으로하며, 공유 (보존 된) 콘텐츠 만으로는 유전자형 분류 (예 : 변형 호출)에 사용되며 이러한 변형은 역학 분석 및 추적 1,2,6,7의 기초가됩니다. . 전형적으로, 박테리아 코어-게놈-기반 유전자형은 7 내지 수천 개의 유전자좌 ^8,9,10을 사용하는 다중 유전자좌 서열 타이핑(MLST) 접근법으로 수행된다. 이러한 MLST 기반 전략은 고도로 큐레이팅된 데이터베이스 상에 미리 조립되거나 조립된 게놈 서열의 매핑을 포함하며, 이에 따라 대립유전자 정보를 역학 및 생태학적 분석을 위한 재현 가능한 유전자형 단위로 결합한다^(11,12). 예를 들어, 이러한 MLST 기반 분류는 두 가지 수준의 분해능에서 유전자형 정보를 생성할 수 있다: 저수준 서열 유형(STs) 또는 ST 계보(7개 유전자좌), 및 상위 레벨 코어-게놈 MLST(cgMLST) 변이체(~300-3,000 유전자좌)¹⁰.

MLST 기반 유전자형 분류는 실험실에서 계산적으로 휴대가 용이하고 재현성이 높기 때문에 박테리아 종 수준^13,14 아래의 정확한 하위 타이핑 접근법으로 널리 받아 들여지고 ^있습니다. 그러나, 박테리아 집단은 종-특이적 다양한 정도의 클론성(즉, 유전자형 균질성), 유전자형 15,16,17 사이의 계층적 친족관계의 복잡한 패턴, 및 부속 게놈 함량의 분포에서의 광범위한 변동으로 구조화된다 ^18,19 . 따라서보다 전체적인 접근 방식은 MLST 유전자형으로의 개별 분류를 넘어 다양한 해상도의 유전자형의 계층 적 관계를 통합하고 액세서리 게놈 내용을 유전자형 분류에 매핑하여 인구 기반 추론을 용이하게합니다 18,20,21 . 더욱이, 분석은 또한 멀리 관련된 유전자형^21,22 사이에서 액세서리 게놈 유전자좌의 상속의 공유 패턴에 초점을 맞출 수 ^있다. 전반적으로, 결합된 접근법은 집단 구조 사이의 관계와 지리공간적 또는 환경적 구배들 사이의 특정 게놈 조성물(예를 들어, 유전자좌)의 분포에 대한 불가지론적 심문을 가능하게 한다. 이러한 접근법은 특정 집단의 생태 학적 특성에 대한 근본적이고 실용적인 정보를 제공 할 수 있으며, 이는 차례로 식량 동물이나 인간과 같은 저수지에 걸친 그들의 트로피즘과 분산 패턴을 설명 할 수 있습니다.

이 시스템 기반 계층적 집단 중심 접근법은 구별 가능한 게놈 서명을 예측하기에 충분한 통계적 능력을 위해 대량의 WGS 데이터를 필요로 한다. 결과적으로이 접근법은 수천 개의 박테리아 게놈을 한 번에 처리 할 수있는 전산 플랫폼을 필요로합니다. 최근에, ProkEvo는 개발되었으며 자유롭게 이용 가능하고, 자동화되고, 휴대가 가능하며, 확장 가능한 생물 정보학 플랫폼으로, 범게놈 매핑(pan-genomic mapping⁾⁽²⁰)을 포함한 통합 계층적 기반 박테리아 집단 분석을 가능하게 한다. ProkEvo는 중대형 박테리아 데이터 세트를 연구하는 동시에 사용자가 사용자 정의 할 수있는 검증 가능하고 추론 가능한 역학 및 생태 학적 가설 및 표현형 예측을 생성하는 프레임 워크를 제공합니다. 이 작업은 ProkEvo 파생 출력 파일을 계층 적 집단 분류 및 액세서리 게놈 마이닝의 분석 및 해석을위한 입력으로 활용하는 방법에 대한 가이드를 제공하는 파이프 라인을 보완합니다. 여기에 제시된 사례 연구는 살모넬라 엔테리카 혈통 I zoonotic serovar S의 인구를 활용했습니다. Newport를 예로 들자면, 미생물학자, 생태학자 및 역학자에게 다음과 같은 방법에 대한 실질적인 지침을 제공하는 것을 특별히 목표로 하였다: i) 계층적 유전자형을 매핑하기 위해 자동화된 계통학-의존적 접근법을 사용한다; ii) 생태학적 적합성을 평가하기 위한 프록시로서 유전자형의 빈도 분포를 평가하는 단계; iii) 독립적 인 통계적 접근법을 사용하여 혈통 별 클론성 정도를 결정; iv) 집단 구조의 맥락에서 부속 게놈 함량을 마이닝하는 방법의 예로서 혈통-차별화 AMR 유전자좌를 지도화한다. 보다 광범위하게,이 분석 접근법은 표적 종에 관계없이 진화 및 생태 패턴을 추론하는 데 사용할 수있는 규모로 인구 기반 게놈 분석을 수행하는 일반화 가능한 프레임 워크를 제공합니다.

프로토콜

1. 입력 파일 준비

참고: 프로토콜은 여기에서 사용할 수 있습니다 - https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/tree/main/code. 이 프로토콜은 연구원이이 Figshare 저장소에서 사용할 수있는 필요한 출력을 얻기 위해 ProkEvo (또는 유사한 파이프 라인)를 특별히 사용했다고 가정합니다 (https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503 - 로그인 자격 증명이 필요합니다 - 사용자는 파일에 액세스 할 수있는 무료 계정을 만들어야합니다!). 참고로, ProkEvo는 NCBI-SRA 저장소에서 게놈 서열을 자동으로 다운로드하며 입력²⁰으로 게놈 식별 목록을 포함하는 .txt 파일 만 필요하며 S에서이 작업에 사용되는 파일 만 있으면됩니다. 뉴포트 USA 격리물은 여기에 제공됩니다 (https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025729).  이 박테리아 유전체학 플랫폼을 설치하고 사용하는 방법에 대한 자세한 정보는 여기에서 확인할 수 있습니다 (https://github.com/npavlovikj/ProkEvo/wiki/2.-Quick-start)²⁰

1. 앞서 기술한 바와 같이 FastTree⁽²³)를 사용하여 코어-게놈 계통학을 생성하며, 이는 생물정보학 플랫폼⁽²⁰)의 일부가 아니다. FastTree는 Roary²⁴ 코어-게놈 정렬을 입력 파일로 필요로 합니다. 필로제니 파일의 이름은 newport_phylogeny.tree(https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025690)입니다.
2. 살모넬라 균 및 cgMLST 변이체 호출 데이터에 대한 혈청 분류에 관한 정보를 포함하는 SISTR²⁵ 출력을 생성합니다 (sistr_output.csv - https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025699).
3. BAPS 수준^1-6 게놈을 하위 그룹 또는 일배체형으로 분류하는 것을 포함하는 패스트밥 ^26,27에 의해 BAPS 파일을 생성한다(fastbaps_partition_baps_prior_l6.csv - https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025684).
4. MLST 프로그램 (https://github.com/tseemann/mlst)²⁸ (salmonellast_output.csv - https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025696)을 사용하여 게놈을 ST로 분류하는 MLST 기반 분류를 생성합니다.
5. ABRicate (https://github.com/tseemann/abricate)²⁹ 출력을 게놈 당 매핑된 AMR 유전자좌를 포함하는 .csv 파일로 생성합니다 (sabricate_resfinder_output.csv - https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025693).
   참고: 사용자는 ProkEvo 생물정보학 파이프라인의 특정 부분을 끌 수 있습니다(자세한 내용은 여기를 확인하십시오 - https://github.com/npavlovikj/ProkEvo/wiki/4.2.-Remove-existing-bioinformatics-tool-from-ProkEvo). 여기에 제시된 분석 접근법은 생물 정보학 파이프 라인이 실행 된 후 집단 기반 분석을 수행하는 방법에 대한 지침을 제공합니다.

2. 통계 소프트웨어 및 통합 개발 환경(IDE) 응용 프로그램을 다운로드하여 설치합니다.

1. Linux, Mac 또는 PC³⁰용 R 소프트웨어의 최신 버전을 무료로 다운로드할 수 있습니다. 기본 설치 단계를 따릅니다.
2. RStudio 데스크탑 IDE의 최신 버전을 여기에서 자유롭게 사용할 수 있는 버전을 다운로드³¹. 설치의 기본 단계를 따릅니다.
   참고: 다음 단계는 코드 사용률에 대한 자세한 정보를 포함하여 사용 가능한 스크립트에 포함되어 있으며 이 작업에 제공된 출력과 수치를 생성하기 위해 순차적으로 실행해야 합니다(https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/data_analysis_R_code.Rmd). 사용자는 파이썬과 같은 분석적/통계적 분석을 수행하기 위해 다른 프로그래밍 언어를 사용하기로 결정할 수 있다. 이 경우 스크립트의 단계를 프레임워크로 사용하여 분석을 수행합니다.

3. 데이터 과학 라이브러리 설치 및 활성화

1. 분석의 첫 번째 단계로 모든 데이터 과학 라이브러리를 한 번에 설치합니다. 스크립트를 다시 실행해야 할 때마다 라이브러리를 설치하지 마십시오. 라이브러리 설치에 install.packages() 함수를 사용하십시오. 또는 사용자는 IDE 내부의 패키지 탭을 클릭하고 패키지를 자동으로 설치할 수 있습니다. 필요한 모든 라이브러리를 설치하는 데 사용되는 코드는 다음과 같습니다.
   # 티디버스 설치
   install.packages("tidyverse")
   # 스키머 설치
   install.packages("skimr")
   # 비건 설치
   install.packages("vegan")
   # 포캣 설치
   install.packages("forcats")
   # 나니아르 설치
   install.packages("naniar")
   # ggpubr 설치
   install.packages("ggpubr")
   # ggrepel 설치
   install.packages("ggrepel")
   # 재구성 설치2
   install.packages("reshape2")
   # RColorBrewer 설치
   install.packages("RColorBrewer")
   # ggtree 설치
   if (!requireNamespace("BiocManager", 조용히 = TRUE))
   install.packages("BiocManager")
   BiocManager::install("ggtree")
   # ggtree의 설치는 설치에 대한 질문을 표시합니다 - 대답은 모든 종속성을 설치 / 업데이트하는 "a"입니다.
2. 설치 직후 스크립트 시작 부분에 library() 함수를 사용하여 모든 라이브러리 또는 패키지를 활성화합니다. 다음은 필요한 모든 패키지를 활성화하는 방법에 대한 데모입니다.
   # 라이브러리와 패키지 활성화
   도서관 (깔끔한)
   도서관 (스키머)
   도서관(비건)
   도서관 (포캣)
   도서관 (나니아르)
   라이브러리 (ggtree)
   라이브러리 (ggpubr)
   도서관 (ggrepel)
   라이브러리 (모양 변경2)
   도서관 (RColorBrewer)
3. 다음과 같이 코드 척에 {r, include = FALSE}를 사용하여 라이브러리 및 패키지 설치 및 활성화에 사용되는 코드를 출력하지 않습니다.
   ''' {r, 포함 = FALSE}
   # 티디버스 설치
   install.packages("tidyverse")
   ```
   참고: 이 단계는 선택 사항이지만 최종 html, doc 또는 pdf 보고서에 불필요한 코드 청크가 표시되지 않도록 합니다.
4. 모든 라이브러리의 특정 기능에 대한 간략한 설명과 추가 정보를 수집하는 몇 가지 유용한 링크는 3.4.1-3.4.11단계를 참조하십시오.
   1. Tidyverse - 데이터 입력, 시각화, 구문 분석 및 집계, 통계 모델링을 포함하여 데이터 과학에 사용되는 이 패키지 컬렉션을 사용합니다. 전형적으로, ggplot2(데이터 시각화) 및 dplyr(데이터 랭글링 및 모델링)는 이 라이브러리(<sup>32</sup>)에 존재하는 실용적인 패키지들이다.
   2. skimr - 누락된 값(<sup>33</sup>)의 식별을 포함하는 데이터 프레임의 요약 통계를 생성하기 위해 이 패키지를 사용한다.
   3. 비건 - 다양성 기반 통계 (예 : 알파 및 베타 다양성) 계산과 같은 지역 사회 생태 통계 분석에이 패키지를 사용하십시오.<sup>34</sup>).
   4. forcats -이 패키지를 사용하여 분류 순서 재정렬과 같은 범주 변수로 작업하십시오. 이 패키지는 Tidyverse 라이브러리(<sup>32</sup>)의 일부이다.
   5. naniar - 이 패키지를 사용하여 viss_miss() 함수<sup>35</sup>를 사용하여 데이터 프레임의 변수에 걸쳐 누락된 값의 분포를 시각화합니다.
   6. ggtree - 계통 발생 나무(<sup>36</sup>)의 시각화를 위해 이 패키지를 사용한다.
   7. ggpubr - ggplot2 기반 시각화(<sup>37</sup>)의 품질을 향상시키기 위해 이 패키지를 사용하십시오.
   8. ggrepel - 그래프<sup>38</sup> 내부의 텍스트 라벨링을 위해이 패키지를 사용하십시오.
   9. reshape2 - 이 패키지의 melt() 함수를 사용하여 데이터 프레임을 와이드 포맷<sup>39</sup>로 변환합니다.
   10. RColorBrewer - ggplot2 기반 시각화(<sup>40</sup>)에서 색상을 관리하기 위해 이 패키지를 사용하십시오.
   11. 탐색적 데이터 분석을 위해 다음과 같은 기본 함수를 사용합니다. head() 는 데이터 프레임의 첫 번째 관측치를 확인하고, tail()은 데이터 프레임의 마지막 관측치를 확인하고, is.na()는 데이터 프레임에서 누락된 값이 있는 행의 수를 계산하고, dim()은 데이터 세트의 행과 열 수를 확인하고, table()은 변수에서 관측치를 계산하고, sum() 을 사용하여 관측치 또는 인스턴스의 총 수를 계산합니다.

4. 데이터 입력 및 분석

참고: 이 분석의 각 단계에 대한 자세한 내용은 사용 가능한 스크립트(https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/data_analysis_R_code.Rmd)에서 찾을 수 있습니다. 그러나 고려해야 할 몇 가지 중요한 사항은 다음과 같습니다.

1. read_csv() 함수를 사용하여 모든 유전자형 분류(혈청형, BAPS, ST 및 cgMLST)를 포함한 모든 게놈 데이터 입력을 수행합니다.
2. 다중 데이터 집합 집계 전에 이름을 바꾸고, 새 변수를 만들고, 각 데이터 세트에서 관심 있는 열을 선택합니다.
3. 독립 데이터 세트에서 누락된 값을 제거하지 마십시오. 누락된 값을 수정하거나 제외하기 위해 모든 데이터 세트가 집계될 때까지 기다립니다. 각 데이터 세트에 대해 새 변수가 만들어지면 누락된 값은 기본적으로 새로 생성된 분류 중 하나로 분류됩니다.
4. 하이픈이나 심문 표시와 같은 잘못된 문자가 있는지 확인하고 NA로 바꿉니다(해당되지 않음). 누락 된 값에 대해서도 동일한 작업을 수행하십시오.
5. 유전자형의 계층적 순서 (혈청-> BAPS1 -> ST-> cgMLST)에 기초하고, 개별 게놈 식별에 기초하여 그룹화함으로써 데이터를 집계한다.
6. 여러 전략을 사용하여 누락 된 값을 확인하고 이러한 불일치를 명시 적으로 처리하십시오. 분류가 신뢰할 수없는 경우에만 게놈을 제거하거나 데이터에서 분리하십시오. 그렇지 않으면 수행 중인 분석을 고려하고 사례별로 NA를 제거합니다.
   참고 : 이러한 값을 선험적으로 다루는 전략을 수립하는 것이 좋습니다. 모든 게놈을 제거하거나 변수에서 누락 된 값을 가진 격리물을 제거하지 마십시오. 예를 들어, 게놈은 cgMLST 변이체 번호를 갖지 않고 ST 분류를 가질 수 있다. 이 경우, 게놈은 여전히 ST 기반 분석에 사용될 수 있다.
7. 모든 데이터 세트가 집계되면 후속 분석의 여러 위치에서 사용할 수 있는 데이터 프레임 이름 또는 개체에 할당하여 논문의 모든 그림에 대해 동일한 메타데이터 파일을 생성할 필요가 없도록 합니다.

5. 분석 수행 및 시각화 생성

참고: 모든 분석 및 시각화를 생성하는 데 필요한 각 단계에 대한 자세한 설명은 이 문서의 마크다운 파일(https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/tree/main/code)에서 찾을 수 있습니다. 각 그림의 코드는 청크로 구분되며 전체 스크립트를 순차적으로 실행해야 합니다. 또한 각 기본 및 보충 그림에 대한 코드는 별도의 파일로 제공됩니다(보충 파일 1 및 보충 파일 2 참조). 다음은 각 기본 및 보충 수치를 생성하는 동안 고려해야 할 몇 가지 필수 사항 (코드 스 니펫 포함)입니다.

1. ggtree를 사용하여 유전자형 정보와 함께 계통수를 플로팅합니다(그림 1).
   1. xlim() 및 gheatmap(width = ) 함수 내부의 숫자 값을 각각 변경하여 링의 직경과 너비를 포함한 ggtree 그림 크기를 최적화합니다(아래 예제 코드 참조).
      tree_plot <- ggtree (트리, 레이아웃 = "원형") + xlim (-250, NA)
      figure_1 <- gheatmap(tree_plot, d4, 오프셋=.0, 너비=20, colnames = FALSE)
      참고 : 계통 발생 플로팅에 사용할 수있는 프로그램을보다 자세히 비교하려면이 작업<sup>20</sup>을 확인하십시오. 이 작업은 데이터 세트 크기를 줄이는 것과 같은 ggtree 기반 시각화를 개선하기위한 전략을 식별하려는 시도를 강조했지만 분기 길이와 트리 토폴로지는 phandango<sup>41</sup>에 비해 명확하게 구별되지 않았습니다.
   2. 계통발생 트리(https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/figure_1.Rmd)로 여러 계층의 데이터를 플로팅할 때 색상 패널을 쉽게 선택할 수 있도록 모든 메타데이터를 가능한 한 적은 범주로 집계합니다. 관심 및 도메인 지식에 대한 질문을 기반으로 데이터 집계를 수행합니다.
2. 막대 그림을 사용하여 상대 주파수를 평가합니다(그림 2).
   1. ST 계보 및 cgMLST 변형 모두에 대한 데이터를 집계하여 시각화를 용이하게 합니다. 데이터 집계에 사용되는 경험적 또는 통계적 임계값을 선택하면서 묻는 질문을 고려합니다.
   2. 차단을 결정하기 위해 ST 계보의 주파수 분포를 검사하는 데 사용할 수 있는 예제 코드는 아래를 참조하십시오.
      st_dist <- d2 %>% group_by(ST) %>% # ST 컬럼에 의한 그룹
      count() %>% # 관측치 수를 계산합니다.
      arrange(desc(n)) # 카운트를 감소 순서로 정렬합니다.
   3. 마이너(저주파) ST를 집계하는 방법을 보여주는 예제 코드는 아래를 참조하십시오. 아래에 설명된 바와 같이, 5, 31, 45, 46, 118, 132 또는 350으로 번호가 매겨지지 않은 ST는 함께 "다른 ST"로 그룹화됩니다. cgMLST 변형(https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/figure_2.Rmd)에 대해 유사한 코드를 사용합니다.
      d2$st <- ifelse(d2$ST == 5, "ST5", # 마이너 S T가 기타로 집계되는 새 ST 열을 만듭니다.
      ifelse(d2$ST == 31, "ST31",
      ifelse(d2$ST == 45, "ST45",
      ifelse(d2$ST == 46, "ST46",
      ifelse(d2$ST == 118, "ST118",
      ifelse(d2$ST == 132, "ST132", ifelse(d2$ST == 350, "ST350", "Other STs"))))))
3. 중첩된 접근 방식을 사용하여 각 BAPS1 하위 그룹 내의 각 ST 계보의 비율을 계산하여 조상과 관련된(동일한 BAPS1 하위 그룹에 속하는) ST를 식별합니다(그림 3). 아래 코드는 BAPS1 하위 그룹(https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/figure_3.Rmd)에서 ST 기반 비율을 계산하는 방법을 보여 줍니다.
   baps <- d2b %>% filter(serovar == "Newport") %>% # filter Newport serovars
   선택(baps_1, ST) %>% # baps_1 및 ST 열 선택
   mutate(ST = as.numeric(ST)) %>% # ST 열을 숫자로 변경
   drop_na(baps_1, ST) %>% # NA 드롭
   group_by(baps_1, ST) %>% # baps_1 및 ST에 의한 그룹
   summarise(n = n()) %>% # 카운트 관측치
   mutate(prop = n/sum(n)*100) # 비율 계산
4. Resfinder 기반 유전자 주석 결과를 사용하여 ST 계통에 걸친 AMR 유전자좌의 분포를 플로팅한다(그림 4).
   참고 : Resfinder는 생태 및 역학 연구<sup>42</sup>에서 널리 사용되었습니다. 단백질 코딩 유전자의 주석은 데이터베이스가 얼마나 자주 큐레이팅되고 업데이트되는지에 따라 달라질 수 있다. 제안된 생물정보학 파이프라인을 사용하는 경우, 연구원은 상이한 데이터베이스<sup>(20</sup>)에 걸친 AMR 기반 유전자좌 분류를 비교할 수 있다. 지속적으로 업데이트되는 데이터베이스를 확인해야 합니다. 오콜을 피하기 위해 오래되었거나 잘못 큐레이팅된 데이터베이스를 사용하지 마십시오.
   1. 경험적 또는 통계적 역치를 사용하여 시각화를 용이하게 하기 위해 가장 중요한 AMR 유전자좌를 필터링합니다. 여기에 표시된 것과 같이 모든 ST 계보에 걸쳐 모든 AMR 유전자좌의 계산된 비율을 포함하는 원시 .csv 파일을 제공합니다(https://figshare.com/account/projects/116625/articles/15097503?file=29025687).
   2. 다음 코드를 사용하여 각 ST에 대한 AMR 비율을 계산합니다(https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/figure_4.Rmd).
      # ST45에 대한 계산
      d2c <- data6 %>% filter(st == "ST45") # ST45 데이터를 먼저 필터링
      # ST45의 경우 AMR 유전자좌의 비율을 계산하고 10 %보다 큰 비율 만 유지하십시오.
      d3c <- d2c %>% select(id, gene) %>% # 선택 열
      group_by(id, gene) %>% # id 및 유전자별 그룹
      요약(개수 = n()) %>% # 관측치 개수
      mutate(count = replace(count, count == 2, 1)) %>% #2와 같은 카운트를 1로 대체하여 각 유전자의 사본 하나만 고려하지만(중복은 신뢰할 수 없을 수 있음), 연구원은 이를 제외하거나 유지하기로 결정할 수 있습니다. 연구원이 그들을 배제하고 싶다면 필터 (count != 2) 함수를 사용하거나 그대로 두십시오.
      filter(개수 <= 1) # 필터 카운트가 1보다 작거나 같음
      d4c <- d3c %>% group_by(유전자) %>% # 유전자별 군
      요약(값 = n()) %>% # 카운트 관측치
      mutate(total = table(data1$st)[6]) %>% # st mutate 의 총 카운트를 가져옵니다 (prop = (value/total)*100) # 백분율 계산
      d5c <- d4c %>% mutate(st = "ST45") # st 열 만들기 및 ST 정보 추가
   3. 모든 ST에 대해 계산이 완료되면 다음 코드를 사용하여 데이터 세트를 하나의 데이터 프레임으로 결합합니다.
      # 데이터 세트 결합
      d6 <- rbind(d5a, d5b, d5c, d5d, d5e, d5f, d5g, d5h) # 행 바인딩 데이터 세트
   4. 계산된 비율이 포함된 .csv 파일을 내보내려면 코드를 사용합니다.
      # ST 및 AMR 유전자좌 정보를 포함하는 데이터 테이블 내보내기
      abx_newport_st <- d6 쓰기.csv(abx_newport_st,"abx_newport_st.csv", row.names = FALSE)
   5. ST 계보 전반에 걸친 AMR 기반 분포를 플로팅하기 전에 아래와 같이 임계값을 기준으로 데이터를 필터링하여 시각화를 용이하게 합니다.
      # 10%보다 높거나 같은 비율을 가진 AMR 유전자좌 필터링
      d7 <- d6 %>% filter(prop >= 10) # 경험적 또는 통계적으로 역치를 결정
5. 계층적 유전자형 분류 및 AMR 데이터와 함께 코어-게놈 계통학을 ggtree를 사용하여 단일 플롯에 플로팅합니다(그림 5).
   1. 위에서 언급 한 매개 변수를 사용하여 ggtree 내부의 그림 크기를 최적화하십시오 (5.1.1 단계 참조).
   2. 변수를 집계하거나 유전자 존재 또는 부재와 같은 이진 분류를 사용하여 시각화를 최적화합니다. 플롯에 피쳐가 추가될수록 채색 선택 과정이 어려워집니다(https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/figure_5.Rmd).
      참고 : 보충 그림 - 전체 코드에 대한 자세한 설명은 여기에서 찾을 수 있습니다 (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/data_analysis_R_code.Rmd).
6. 데이터 집계 없이 ggplot2의 산점도를 사용하여 ST 계통 또는 cgMLST 변이체의 분포를 표시하면서 가장 빈번한 유전자형을 강조 표시합니다(보충 그림 1)(https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/supplementary_figure_s1.Rmd).
7. ST 기반 유전 다양성을 엿볼 수 있도록 cgMLST 변이체의 비율을 통해 ST 혈통의 구성을 평가하기 위해 중첩 분석을 수행하면서 가장 빈번한 변이체와 유전 관계 (즉, 동일한 ST에 속하는 cgMLST 변이체는 별개의 ST에 속하는 것보다 더 최근에 조상을 공유했습니다) (보충 그림 2 ) (https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/supplementary_figure_s2.Rmd).
8. 지역 사회 생태학 지표, 즉 Simpson의 다양성 D 지수를 사용하여 각 주요 ST 계통<sup>43</sup> 의 클론성 또는 유전자형 다양성의 정도를 측정하십시오 (보충 그림 3).
   1. BAPS 레벨 1~6 및 cgMLST를 포함한 다양한 수준의 유전자형 분해능에서 ST 계통에 걸친 다양성 지수를 계산합니다. 다음은 유전자형 분해능의 BAPS 레벨 1(BAPS1)에서 이 계산을 수행하는 방법에 대한 코드 예제입니다.
      # BAPS 레벨 1 (BAPS1)
      # ST와 BAPS1을 NA로 드롭하고 ST와 BAPS1로 그룹화 한 다음 Simpson의 인덱스를 계산합니다.
      baps1 <- 데이터6 %>%
      선택(st, BAPS1) %>% # 열 선택
      drop_na(st, BAPS1) %>% # NA 드롭
      group_by(st, BAPS1) %>% # 열별 그룹
      summarise(n = n()) %>% # 카운트 관측치
      mutate(simpson = diversity(n, "simpson")) %>% # 다양성 계산
      열별로 group_by(st) %>% # 그룹
      summarise(simpson = mean(simpson)) %>% # 인덱스의 평균을 계산합니다.
      melt(id.vars=c("st"), measure.vars="simpson",
      variable.name="index", value.name="value") %>% # 긴 형식으로 은밀한
      mutate(strat = "BAPS1") # strat 열 만들기
      참고: 보다 유전적으로 다양한 집단(즉, 유전자형 분해능의 상이한 계층에서 더 많은 변이체)은 cgMLST 수준에서 더 높은 지수를 가지며 BAPS 레벨 2에서 6(https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/supplementary_figure_s3.Rmd)으로 증가하는 인덱스 기반 값을 생성합니다.
9. 모든 분해능 수준(BAPS1-6)에서 BAPS 하위집단의 상대적 빈도를 플로팅하여 ST 계통의 유전자형 다양성 정도를 조사한다(보충 그림 4). 모집단이 다양할수록 BAPS 하위 그룹(일배체형)의 분포가 BAPS1(낮은 해상도 수준)에서 BAPS6(더 높은 수준의 분해능)(https://github.com/jcgneto/jove_bacterial_population_genomics/blob/main/code/supplementary_figure_s4.Rmd)으로 이동하게 됩니다.

결과

집단 유전체학 분석을 위해 전산 플랫폼 ProkEvo를 활용함으로써, 박테리아 WGS 데이터 마이닝의 첫 번째 단계는 코어-게놈 계통학의 맥락에서 계층적 집단 구조를 조사하는 것으로 구성됩니다(그림 1). S의 경우. 엔테리카 계보 I, S에 의해 예시된 바와 같이 . 뉴포트 데이터 세트는, 모집단이 다음과 같이 계층적으로 구조화된다: 세로바(최저 해상도 수준), BAPS1 하위군 또는 일배체형, ST 계통 및 cgMLST 변이체(최고 수준의 분해능)<sup>20</sup>. 계층적 집단 구조에 대한 이러한 계통학-유도 분석은 구체적으로 다음과 같은 점들이 조사될 수 있게 한다: i) 살모넬라균의 경우에 SISTR-기반 잘못 분류된 게놈의 계통발생학적 분포를 다른 혈청으로 분포; ii) 집단의 유전적 또는 친족관계 구조; iii) 유전자형 분해능의 상이한 수준에서의 다양화 패턴; iv) ...

토론

시스템 기반 휴리스틱 및 계층적 집단 구조 분석의 활용은 독특한 생태학적 및 역학적 패턴<sup>(20</sup>)을 설명할 수 있는 잠재력을 갖는 박테리아 데이터세트에서 새로운 게놈 서명을 식별하기 위한 프레임워크를 제공한다. 추가적으로, 집단 구조에 대한 부속 게놈 데이터의 매핑은 저장고<sup>(6,20,21,45,46</sup>)에 걸쳐 ST 계통 또는 cgMLST 변이체의 확산을 용이하게 하는 조상-획득 및/또는 최근 유래된 형질을 추론하는데 사용될 수 있다. 보다 광범위하게, 박테리아 집단의 범 게놈 함량 분포에 대한 세계적인 평가는 인구가 최근에<sup>18,21</sup>

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
			https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28758762
amr_data_raw			https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28547994
baps_output			https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28548003
Core-genome 계통 발생			https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28548006
genome_sra
https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28639209 Linux, Mac 또는 PC			고성능 플랫폼
https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28547997
			sistr_output https://figshare.com/account/projects/116625/articles/14829225?file=28548000
figshare 자격 증명이 필요하며 파일에