방법 논문

고정화된 트로포미오신 키나제 수용체 B와 상호작용하는 특수 식물 대사산물을 확인하기 위한 세포막 친화성 크로마토그래피 컬럼

DOI:

10.3791/63118

⸱

2022년 1월 19일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, The University of Alabama, 2Department of Pharmaceutical Botany, Faculty of Pharmacy, Hacettepe University

이 논문에서

요약

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상기 프로토콜은 기능적 막횡단 트로포미오신 키나제 수용체 B 단백질을 함유하는 고정화된 세포막 단편을 갖는 세포막 친화성 크로마토그래피(CMAC) 컬럼의 제조를 기술한다. 이러한 수용체와 상호 작용하고 복잡한 천연 혼합물에 존재하는 특수 식물 대사 산물의 확인에 CMAC 컬럼의 사용도 설명됩니다.

초록

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식물, 곰팡이, 박테리아 및 해양 무척추 동물에 의해 합성 된 화학 물질은 신약 히트 및 리드의 풍부한 원천이었습니다. 스타틴, 페니실린, 파클리탁셀, 라파마이신 또는 아르테미시닌과 같은 의약품은 의료 행위에서 일반적으로 사용되며 천연 제품에서 먼저 확인되고 분리되었습니다. 그러나 생물학적 활성 특수 대사 산물을 천연 공급원으로부터 식별하고 분리하는 것은 어렵고 시간이 많이 걸리는 과정입니다. 전통적으로, 개별 대사 산물은 바이오 매스의 추출에 따라 복잡한 혼합물로부터 분리되고 정제됩니다. 이어서, 단리된 분자는 그들의 생물학적 활성을 검증하기 위해 기능적 분석에서 시험된다. 여기서 우리는 복잡한 혼합물로부터 직접 생물학적 활성 화합물을 확인하기 위해 세포막 친화성 크로마토그래피 (CMAC) 컬럼의 사용을 제시한다. CMAC 컬럼은 천연 인지질 이중층 환경에 내재된 고정화된 기능성 막횡단 단백질(TMP)과 상호작용하는 화합물의 동정을 가능하게 한다. 이것은 표적화 된 접근법이며, 이는 새로 확인 된 소분자 약물 후보로 조절하려는 활성을 가진 TMP를 알아야합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 수많은 신경계 장애에 대한 약물 발견의 실행 가능한 표적으로 부상 한 고정화 된 트로포미오신 키나제 수용체 B (TrkB)로 CMAC 컬럼을 제조하는 접근법을 제시합니다. 이 기사에서는 TrkB 수용체를 과발현하는 신경 모세포종 세포주를 사용하여 고정화 된 TrkB 수용체로 CMAC 컬럼을 조립하는 상세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 또한 컬럼의 기능을 조사하기위한 접근법과 TrkB 수용체와 상호 작용하는 특수 식물 대사 산물의 확인에 그 사용을 제시합니다.

서론

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식물 혼합물은 약리학적 활성 화합물1이 풍부하여 신약 히트의 식별을 위한 좋은 공급원 으로 작용하며 2,3,4,5를 리드한다. 천연 제품에서 새로운 의약품을 발견하는 것은 유익한 접근 방식이었으며 현재 승인 된 많은 약물은 자연에서 처음 확인 된 화합물에서 유래했습니다. 천연 화합물의 화학적 다양성은 화학적으로 합성 된 분자의 인공 라이브러리와 일치하기가 어렵습니다. 많은 천연 화합물이 인간 단백질 표적과 상호작용하고 조절하며, 진화적으로 최적화된 약물-유사 분자6로 간주될 수 있다. 이들 천연 화합물은 신경 장애6에 사용하기 위한 약물 납 확인에 특히 매우 적합하다. 알츠하이머 병 (AD)의 관리를위한 현재 FDA 승인 약물 중 두 가지는 천연 알칼로이드, 즉 갈란 타민과 리바 스티그민 (피소스티그민의 유도체)6에서 파생됩니다. 현재 파킨슨 병에 가장 일반적으로 처방되는 약물 인 L-DOPA는....

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프로토콜

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1. SH-SY5Y 신경모세포종 세포의 세포 배양 (TrkB 및 TrkB-NULL (비경구) 세포주)

참고: 세포주 (SH-SY5Y 세포주 (TrkB, BR6) 및 SH-SY5Y 부모 세포주 (TrkB NULL))49,50은 케라파스트로부터 구입하였다. 배양된 세포는 CMAC 컬럼의 제조를 위해 고정화되는 막횡단 수용체의 공급원으로서 사용된다. 다음 단계는 세포막 단편을 얻고 기능적 CMAC 컬럼을 조립하는 방법을 설명합니다.

  1. RPMI 배지 450mL, FBS 50mL, 페니실린/스트렙토마이신 용액 5mL, 제네티신(G418) 0.3mg/mL를 5%CO2가 있는 습한 분위기에서 37°C의 150mm 세포 배양 접시에 혼합하여 준비한 세포 배양 배지에서 세포를 성장시킨다.

2. 세포 수확

  1. 현미경을 이용하여 세포 컨플루언시(80%-90%)를 확인하고, 세포 통과 후 3-4일 후에 도달하였다.
  2. 세포 위로부터의 흡인물 세포 배양 배지는 세포를 인산완충식염....

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결과

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프로토콜에 따라, 두 개의 CMAC 크로마토그래피 컬럼이 조립되었다: 하나는 과발현된 TrkB를 갖는 고정화된 SH-SY5Y 신경모세포종 세포막 단편과 SH-SY5Y TrkB-NULL 세포막 단편을 갖는 것이다. 정확하게 조립된 CMAC 컬럼은 도 1 에 제시되어 있고, 세포막 단편 고정화에 관여하는 단계들은 도 2에 제시되어 있다.

이후 IAM에 TrkB 수용체를 고정화시킨다. 개인용 컴퓨터. DD2 크로마토그래피 고정상은 이전에 시도되지 않았으며, 수용체의 성공적인 고정화는 마커 리간드를 이용한 항체 염색 및 전두엽 친화성 크로마토그래피에 의해 확인되었다: 7,8-DHF. 항체 염색 실험의 개략적인 표현이 도 2에 제시되어 있다. TrkB 수용체를 과발현하는 신경모세포종 세포주로부터 수득된 세포막 단편 및 TrkB 수.......

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토론

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특수 대사 산물의 복잡한 혼합물에 존재하는 활성 화합물의 확인은 매우 어려운 과제입니다23. 전통적으로, 개별 화합물은 단리되고, 그들의 활성은 상이한 검정에서 시험된다. 이러한 접근법은 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며, 종종 가장 풍부하고 잘 특성화된 화합물(23)의 분리 및 동정으로 이어진다. 현재 사용되는 고처리량 스크리닝 분석은 이미 알려진 표적을 갖는 조합 화학 라이브러리를 스크리닝하는 데 크게 의존하며, 복합 혼합물(53)에 존재하는 생물학적 활성 화합물을 확인하고 분리하도록 설계되지 않았다.

CMAC는 TMP 23,24,54를 표적화하는 화합물의 동정을 허용한다. 이 기.......

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공개 사항

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Lukasz Ciesla는 IAM 제공업체인 Regis Technologies와 협력하고 있습니다. 개인용 컴퓨터. DD2 입자.

감사의 글

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Z.C.A.는 터키 과학 기술 연구위원회 (TUBITAK) 2219- 국제 박사후 연구 펠로우십 프로그램의 지원을 받았습니다. 이 간행물에보고 된 연구는 수상 번호 1R41AT011716-01로 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 무료 및 통합 의학 센터 (National Center for Complimentary and Integrative Medicine)의 지원을 받았다. 이 연구는 또한 미국 약리학 연구 스타터 그랜트 (American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant), Regis Technologies 보조금 (Regis Technologies)이 L.C.에 부분적으로 지원했습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
7-8 디하이드록시플라본 수화물시그마-알드리치D5446-10 mg≥ 98% (HPLC)
아데노신 5'-트리포스페이트 (ATP) 디소듐 염 수화물시그마-알드리치A2383-1 g
암모늄 아세테이트VWR 화학물질 BDHBDH9204-500 g
BDNF 항체인비트로젠PA5-15198-400 μ L일차 항체; 농도 2 mg/mL
Benzamidine hydrochloride hydrateSigma-AldrichB6506-25 g
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) humanSigma-AldrichB3795-10 μ g재조합, 대장균으로 발현, 동결건조 분말, 세포 배양에 적합
염화칼슘VWR 분석BDH9224-1kg
콜산 나트륨 염Alfa AesarJ62050-100 g
Dounce 균질화VWR71000-51640 mL, 285 mm (전체 길이), 32 x 140 mm (OD x H)
에탄올시그마-알드리치493511
에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)VWR 분석BDH-9232-500 g
소 태아 혈청Sigma-AldrichF2442-500 mL멸균 여과, 세포 배양에 적합
G418 이황산염 염 용액Sigma-AldrichG8168-100 mL50 mg / mL in H2O, 0.1 μ m 필터링, 세포 배양에 적합
글리세롤VWR 생명 과학E520-100 mL
고정 인공 멤브레인(IAM. 개인용 컴퓨터. DD2)레지스 테크놀로지스, Inc.1-771050-500
염화마그네슘 육수화물VWR 분석BDH9244-500mL
메탄올시그마-알드리치322425
니콘 C2 DUVb니콘컨포칼 레이저 스캐닝 현미경
일반 염소 혈청(10%)Life Technologies50197Z
페니실린-스트렙토마이신시그마-알드리치P4333-100 mL
페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF)Thermo Scientific36978-5 g
인산염 완충 식염수(PBS)VWR Life ScienceK812-500 mL1x
염화칼VWR 화학 물질 BDH0395-1 kg
프로테아제 억제제 칵테일VWR Life Science AmbresoM221-1 mL50 mM AEBSF, 30 µ를 포함하는 단백질체학 등급; M 아프로토닌, 1mM 베스타틴, 1mM E-64 및 1mM 류펩틴
RPMI-1640 LSigma-AldrichR8758-500 mL, 액체, 멸균 여과, 세포 배양에 적합
2차 항체 염소 항토끼 IgG (H+L)Invitrogen Alexa Flour Plus 488A32731
SH-SY5Y Trk-BKerafastECP007
SH-SY5Y Trk-NULL 세포주KerafastECP005
뱀 피부 투석 튜빙Thermo Scientific8824510K MWCO, 35mm 건조 I.D.
아지드화 나트륨시그마-알드리치S2002
염화나트륨BDH VWR 분석BDH9286-2.5 kg
트리콘 5/20 열GE 헬스케어24-4064-08
트리스-HClVWR 생명 과학0497-1 kg
트립신-EDTA 용액시그마-알드리치T4049-500 mL0.25%, 멸균 여과, 세포 배양에 적합, 2.5 g 돼지 트립신 및 0.2  g 에타
륨 -글루타민 및 중탄산나트륨이 포함된 을 발현하는 신경모세포종 세포주

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomford, N. E., et al. Natural Products for Drug Discovery in the 21st Century: Innovations for Novel Drug Discovery. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1578(2018).
  2. Atanasov, A. G., Zotchev, S. B., Dirsch, V. M.

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