이 프로토콜은 생체 내에서 SARS-CoV-2 감염을 연구하는 데 필요한 2차 접근법의 필요성을 극복하기 위해 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서 루시페라아제 및 형광 발현 재조합 (r)SARS-CoV-2 및 생체내 이미징 시스템 (IVIS)을 사용하는 바이러스 감염의 역학을 기술한다.
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방법 논문
리포터 발현 재조합 SARS-CoV-2를 이용한 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서의 바이러스 감염의 라이브 이미징 및 정량화
이 논문에서
요약
초록
코로나 바이러스 질병 2019 (COVID-19) 전염병은 심각한 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 (SARS-CoV-2)에 의해 발생했습니다. 현재까지 SARS-CoV-2는 전 세계적으로 242 백만 명이 넘는 감염과 4.9 백만 명 이상의 사망자를 담당했습니다. 다른 바이러스와 마찬가지로 SARS-CoV-2를 연구하려면 감염된 세포 및 / 또는 동물 모델에서 바이러스의 존재를 탐지하기 위해 실험 방법을 사용해야합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 생체발광 (나노루시페라제, Nluc) 또는 형광 (금성) 단백질을 발현하는 복제 적격 재조합 (r) SARS-CoV-2를 생성하였다. 이러한 리포터-발현 rSARS-CoV-2는 Nluc 및 금성 리포터 유전자의 발현에 기초하여 시험관내 및 생체내에서 바이러스 감염을 추적할 수 있게 한다. 여기에서 연구는 앞서 기술한 K18 인간 안지오텐신-전환 효소 2(hACE2) 생체내 영상 시스템(IVIS)을 이용한 감염의 형질전환 마우스 모델에서 SARS-CoV-2 감염을 검출하고 추적하기 위해 rSARS-CoV-2/Nluc 및 rSARS-CoV-2/Venus의 사용을 기술 한다 . 이 rSARS-CoV-2/Nluc 및 rSARS-CoV-2/Venus는 생체 내에서 rSARS-CoV-2/WT와 같은 병원성 및 바이러스 복제를 보여줍니다. 중요하게도, Nluc 및 Venus 발현은 우리가 감염된 마우스에서 생체 내 및 생체외에서 바이러스 감염을 직접 추적할 수 있게 해준다. 이러한 rSARS-CoV-2/Nluc 및 rSARS-CoV-2/Venus는 생체 내에서 SARS-CoV-2의 생물학을 연구하고, 바이러스 감염 및 관련 COVID-19 질병을 이해하고, SARS-CoV-2 감염과 싸우기 위한 효과적인 예방 및/또는 치료 치료법을 식별하는 데 탁월한 옵션을 제공합니다.
서론
중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 (SARS-CoV-2)는 코로나 비리 대 (Coronaviridae) 계열1의 베타 코로나 바이러스 계통에 속하는 외피, 양성 감각, 단일 가닥 RNA 바이러스입니다. 이 바이러스 군은 알파-, 베타-, 감마-, 델타-코로나바이러스1로 나뉜다. 알파 및 베타 코로나 바이러스는 주로 포유류를 감염시키는 반면, 감마 및 델타 코로나 바이러스는 거의 독점적으로 조류를 감염시킵니다 2. 현재까지 일곱 개의 코로나바이러스(CoV)가 종 장벽을 넘어 인간 코로나바이러스(HCoV)로 등장했다: 두 개의 알파-CoV(HCoV-229E 및 HCoV-NL63)와 5개의 베타-CoV(HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, 중동호흡기 증후군 코로나바이러스[MERS-CoV], SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV 및 SARS-CoV-2는 병원성이 높아 ....
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프로토콜
K18 hACE2 트랜스제닉 마우스와 관련된 프로토콜은 Texas Biomedical Research Institute (TBRI) Institutional Biosafety Committee (IBC) 및 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았다. 모든 실험은 국가 연구위원회 (National Research Council)40의 실험실 동물 관리 및 사용 안내서의 권장 사항을 따릅니다. 마우스와 함께 작업 할 때 적절한 개인 보호 장비 (PPE)가 필요합니다.
1. K18 hACE2 트랜스제닉 마우스의 사용
- 특정 병원체가 없는 조건 하에서 생물안전 수준(BSL)-2 동물 보호 시설에서 4-6주령 암컷 B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J 마우스(K18 hACE2 형질전환 마우스)를 구입하고 유지합니다.
- BSL2 시설에 도착한 후 동물들이 7 일 동안 적응하고 감염 및 기타 실험 절차를 위해 BSL-3 동물 시설로 옮길 수 있도록하십시오.
- IACUC 프로토콜에 따라 케이지 당 4 마리의 마우스를 놓습니다. 동물이 사망했는지 확인하기 위해 쥐....
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결과
K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서의 rSARS-CoV-2/Nluc 감염 (도 1 및 2)
도 1A는 생체내 감염을 평가하기 위해 사용된 rSARS-CoV-2/WT(상단) 및 rSARS-CoV-2/Nluc(하단)의 개략적인 표현을 보여준다. 도 1B는 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서 rSARS-CoV-2/Nluc 감염 역학을 평가하기 위해 적용된 개략적인 흐름도를 보여준다. 4 내지 6주령의 암컷 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스 (N=4)를 모의-감염시키거나, 105 PFU의 rSARS-COV-2/WT 또는 rSARS-CoV-2/Nluc를 비강내 감염시켰다. 감염 후 1-, 2-, 4- 및 6-일째에, 마우스를 격리 챔버를 사용하여 침전시킨 다음, Nluc.......
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토론
이 프로토콜은 생체 내에서 바이러스 감염을 모니터링하기 위해 이러한 rSARS-CoV-2 발현 리포터 유전자를 사용하는 타당성을 입증한다. 두 리포터 발현 재조합 바이러스는 생체 내에서 SARS-CoV-2 감염을 연구하기위한 훌륭한 도구를 제공합니다. 기술된 생체 외 (rSARS-CoV-2/금성) 및 생체내 (rSARS-CoV-2/Nluc) 이미징 시스템은 SARS-CoV-2 감염, 바이러스 병인의 역학을 이해하고 바이러스 감염 후 다른 시기에 감염된 세포/기관을 식별하는 데 탁월한 옵션을 제공합니다. 생체 외 (rSARS-CoV-2 / 금성) 및 생체 내 (rSARS-CoV-2 / Nluc) 연구를 수행하기 위해서는 정확하고 재현 가능한 감염뿐만 아니라 rSARS-CoV-2 / Nluc의 적절한 예방 접종을 갖는 것이 탁월합니다.
rSARS-CoV-2/Nluc를 사용하여 생체.......
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공개 사항
저자들은 연구 결과가 설명 된 작업과 관련하여 상업적, 재정적 및 비 재정적 또는 개인적인 이해 상충이없는 상태에서 수행되었다고 선언합니다.
감사의 글
우리는 COVID-19 전염병 기간 동안 시설을 완전히 운영하고 안전하게 유지하려는 노력에 대해 우리 연구소 (Texas Biomedical Research Institute)의 회원들에게 감사드립니다. 우리는 또한 우리의 프로토콜을 시간 효율적인 방식으로 검토해 주신 IBC(Institutional Biosafety Committee)와 주문(IACUC)에 감사드립니다. 우리는 SARS-CoV 교차 반응성 1C7C7 뉴클레오캡시드 (N) 단백질 모노클로날 항체를 제공해준 마운트 시나이 의과 대학의 토마스 모란 박사에게 감사드립니다. 마르티네즈-소브리도 실험실에서의 SARS-CoV-2 연구는 현재 NIAID/NIH 보조금 RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 및 R43AI165089-01에 의해 지원되고 있습니다. 국방부 (DoD)는 W81XWH2110095 및 W81XWH2110103을 부여합니다. 정밀 치료를위한 샌 안토니오 파트너십; 텍사스 생물 의학 연구소 포럼; 샌 안토니오에있는 텍사스 대학 건강 과학 센터; 샌안토니오 의료 재단; 인플루엔자 병인 및 전염 연구 센터 (CRIPT), NIAID가 자금을 지원하는 인플루엔자 연구 및 대응 우수 센터 (CEIRR, 계약 # 75N93021C00014)에 의해.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.5% Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | 실온(RT)에서 보관 1 |
| % DEAE-Dextran | MP Biomedicals | 195133 | |
| 10% 포르말린 용액, 중성 완충 | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Agar | Oxoid | LP0028 | |
| 24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
| 5% 중탄산나트륨 | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| 6웰 세포 배양 플레이트 | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 96웰 세포 배양 플레이트 | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| 아프리카 녹색 원숭이 신장 상피 세포(Vero E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Ami HT | 스펙트럼 기기 이미징 | ||
| 아우라 이미징 소프트웨어 3.2.0 | 스펙트럼 기기 이미징 | 이미지 분석 소프트웨어 | |
| 소 혈청 알부민 (BSA), 35 % | 시그마 - 알드리치 | A9647 | 4 °에 저장; C |
| 세포 배양 등급 물 | 코닝 | 25-055-CV | |
| Dulbecco' s 변형 된 독수리' s 매체 (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4 ° C |
| 마취 가스 기계 | 수의학 마취 시스템, Inc. | VAS 2001R | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | -20 °에 보관; C |
| 생후 4-6주 된 암컷 K18-hACE2 형질전환 마우스 | The Jackson Laboratory | 34860 | |
| Graphpad Prism Version 9.1.0 | GraphPad | ||
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | RT에 저장 |
| MARS 데이터 분석 소프트웨어 | BMG LABTECH | ||
| MB10 정제 | QUIP Laboratories | MBTAB1.5 | RT에 저장 |
| Nano-Glo Luciferase 분석 시약 | Promega | N1110 | 이 시약은 Nluc 활성을 측정하는 데 사용됩니다. -20 °에서 보관하십시오. C |
| Nunc MicroWell 96-Well 마이크로플레이트 | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Nunc MicroWell 96-Well 마이크로플레이트 | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민 (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | -20 °에 저장; C |
| PHERAstar FSX | BMG LABTECH | PHERAstar FSX | |
| Precelleys Evolution 균질화 | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| 연조직 균질화 CK14 – 7 mL | Bertin Instruments | P000940-LYSK0-A | |
| T75 EasYFlask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP 키트, 과산화효소 | Vector Laboratories | PK-4002 | ABC 키트 및 DAB 과산화효소 기판 키트 |
참고문헌
- V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
- Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome cor....
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재인쇄 및 허가
