Method Article

순차모세혈관 보조 어셈블리를 통한 미생물 및 미생물 입자의 패터닝

DOI:

10.3791/63131

⸱

November 4th, 2021

 ,  ,  , 
1Institute of Environmental Engineering, Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, ETH Zurich, 2Department of Materials, ETH Zurich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 미세 유체 플랫폼에서 모세혈관 보조 어셈블리를 사용하여 박테리아 및 콜로이드와 같은 액체에 매달려있는 미세 크기의 물체를 폴리디메틸실록산 기판에 규정 된 배열로 패턴화하는 기술을 제시합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

정의된 공간 배열로 미생물의 통제된 패터닝은 미생물 생리학 및 상호 작용의 연구를 포함하여 생물학 응용의 넓은 범위에 대한 독특한 가능성을 제공합니다. 가장 간단한 수준에서, 미생물의 정확한 공간 패터닝은 개별 세포의 많은 수의 믿을 수 있고 장기적인 화상 진찰을 가능하게 하고 거리 의존적인 미생물 상호 작용을 정량적으로 공부하는 기능을 변환할 것입니다. 보다 유일하게, 미세유체 기술이 제공하는 바와 같이 정확한 공간 패터닝과 환경 조건에 대한 완전한 제어를 결합하면 미생물 생태학의 단일 세포 연구를 위한 강력하고 다재다능한 플랫폼을 제공할 것입니다.

이 논문은 미생물 채널 내에서 다재다능하고 사용자 정의한 미생물 패턴을 생성하는 미세 유체 플랫폼을 제공하여 장기적이고 높은 처리량 모니터링을 위한 완벽한 광학 액세스를 제공합니다. 이 새로운 미세 유체 기술은 모세혈관 보조 입자 조립을 기반으로 하며 미세 유체 채널 내부의 증발 현탁액의 제어된 모션으로 발생하는 모세관력을 악용하여 폴리디메틸실록산(PDMS) 기판에 미세매단된 트랩 배열에 개별 미세 크기의 물체를 증착합니다. 순차 적 기탁은 트랩의 형상및 충진 시퀀스에 의해서만 지시되는 단일 또는 다중 유형의 마이크로 크기의 객체의 원하는 공간 레이아웃을 생성합니다.

플랫폼은 다양한 치수와 재료의 콜로이드 입자를 사용하여 보정되었습니다 : 그것은 다양한 콜로이드 패턴을 생성하고 갇힌 입자의 표면 기능화를 수행하는 강력한 도구로 입증되었습니다. 더욱이, 플랫폼은 모델 박테리아로 대장균 세포를 사용하여 미생물 세포에서 시험되었다. 수천 개의 개별 세포가 표면에 패턴화되었고 시간이 지남에 따라 성장을 모니터링했습니다. 이 플랫폼에서 단일 세포 증착 및 미세 유체 기술의 결합을 통해 미생물의 기하학적 패턴화와 환경 조건의 정밀한 제어를 모두 허용합니다. 그것은 이렇게 단 하나 세균의 생리학 및 예비 실험에 의해 도시된 세균 성 상호 작용의 생태로 창을 엽니다.

Introduction

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단일 미생물의 공간 패터닝, 특히 미세 유체 장치와 같은 환경 조건을 완전히 제어 할 수있는 실험 분야 내에서 광범위한 맥락에서 매우 바람직합니다. 예를 들어, 미생물을 정규 배열로 배열하면 많은 수의 개별 세포와 그들의 성장, 생리학, 환경 자극에 대한 반응의 유전자 발현 및 약물 감수성에 대한 연구의 정확한 이미징을 허용할 것입니다. 또한 세포 통신(예를 들어, 쿼럼 센싱), 교차 공급(예를 들어, 조류 세균 공생증) 또는 길항성(예를 들어, 알로파증)으로 연구에 특히 관심이 있는 세포 상호 작용을 연구할 수 있으며, 서로 에 비해 세포의 공간 국산화를 완전히 제어할 수 있습니다. 세포 생리학 및 진화 연구1, 세포 세포 상호 작용 연구2, 표현형 분화 스크리닝3, 환경 모니터링4 및 약물 스크리닝5 는 이러한 정량적 단일 세포 분석을 달성 할 수있는 기술로부터 크게 혜택을 누릴 수있는 분야 중 하나입니다.

단일 세포를 분리하고 처리하기 위한 몇 가지 전략이 최근 몇 년 동안 제안되었으며, 홀로그램 광학 트랩

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Protocol

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1. 실리콘 마스터 준비

참고: 콜로이드 및 미생물 패터닝을 위한 템플릿을 형성하는 마이크로 패브릭 트랩을 포함하는 PDMS 템플릿은 가이슬러 등에서 도입한 방법에 따라 제작되었다. 17. 실리콘 마스터는 클린룸에서 기존의 리소그래피에 의해 제조되었다. 장비의 절차 및 재료 표에 대한 다음 단계를 참조하십시오.

  1. CAD(컴퓨터 지원 설계) 소프트웨어를 사용하여 기능을 디자인합니다.
  2. UV 다이렉트 레이저 라이터로 디자인된 기능을 노출하여 긍정적인 포토레지스트 레이어로 크롬 글래스 마스크를 준비합니다.
    1. 1:4 포토레지스트대 물 비율을 1:4로 사용하여 스핀 개발자와 함께 크롬 유리 마스크를 개발합니다.
    2. 50 s에 대 한 크롬 etchant에 마스크를 담그다.
    3. 플라즈마 처리 는 600 W에서 3 분 동안 10cm 실리콘 웨이퍼를 처리합니다.
    4. 증기-예틸드실리자네층을 예치하고 110°C에서 굽아 포토레지스트쪽으로 접착을 개선한다.
    5. 포토레지스트 레이어를 4,500× g 로 2분 ....

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Results

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모세혈관 보조 어셈블리를 이도하여 콜로이드 입자와 박테리아를 PDMS 템플릿에 미세하게 제작된 트랩으로 패턴화하는 미세유체 플랫폼이 개발되었습니다. 두 개의 서로 다른 채널 지오메트리는 모세관 보조 어셈블리를 통해 콜로이드와 박테리아의 패터를 최적화하도록 설계되었습니다. 첫 번째 채널 지오메트리(그림 1B)는 물리적 장벽이 없는 3개의 23mm 길이의 평행 섹션으로 구성됩니다. 측면의 두 섹션은 폭 5mm, 높이 1mm이며 중앙 부분은 폭 7mm, 높이는 500 μm입니다. 이 디자인은 후퇴 볼록 모양의 반월 상연으로 잘 정의 된 움직이는 물방울을 유지하는 데 도움이됩니다. 이 플랫폼의 작동 원리는 Pioli 등 al.11에 의해 자세히 설명됩니다. 실험이 박테리아 배양의 경우와 같이 측면 채널을 채우는 것이 필요한 경우 공기 주머니가 일반적으로 형성됩니다. 이러한 이유로 채널이 매체로 플러시될 때 충진 프로세스를 간소화하는 두 번째.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 설명된 미세유체 플랫폼은 콜로이드 및 박테리아와 같은 마이크로 크기의 물체를 PDMS 기판에 규정된 공간 배열로 패터닝할 수 있게 합니다. 미세 유체학이 제공하는 환경 조건과 sCAPA 기술로 부여된 미세 메트릭 정밀도로 세포를 패턴화하는 능력은 미래의 생리학 및 생태 연구를 위한 매우 유망한 플랫폼입니다.

이 작품에 제시된 실험에서 실리콘 마스터는 재료표에 보고된 포토레지스트를 사용하여 실현되었다. 그러나 PDMS 성형으로 설명되고 사용할 수 있는 크기 범위에서 피처를 생성하는 데 적합한 모든 포토레지스트를 사용할 수 있습니다. 마이크로채널 금형을 준비하는 데 사용되는 3D 프린팅 수지도 마찬가지입니다. 설명된 치수의 특징을 생성할 수 있고 PDMS 성형과 호환가능한 모든 수지도 사용될 수 있다.

이 프로토콜에서, 미세 유체 칩을 70°C에서 5일 동안 저장하면 Tween 20이 세균 또는 .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 SNSF PRIMA 보조금 179834 (E.S.), ETH 연구 보조금 ETH-15 17-1 (R. S.), 수생 미생물 심바이오시스 (보조금 GBMF9197) (R. S.)에 대한 고든과 베티 무어 재단 조사관 상을 인정합니다. 저자는 박테리아의 SEM 화상 진찰및 통찰력 있는 토론을 위한 박사 미겔 엔젤 페르난데스-로드리게스 (그라나다 대학, 스페인) 감사합니다. 저자들은 젠 응우옌 박사(캐나다 브리티시 컬럼비아 대학), 로라 알바레즈 박사(스위스 ETH 취리히), 카메론 보곤(ETH 취리히, 스위스), 파비오 그릴로 박사에게 감사의 인사를 전합니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alcatel AMS 200SE I-SpeederAlcatel Micro Machining System깊은 반응성 이온 교환 시스템
Alconox세제
AZ400K 현상액MicroChemicalsAZ400K
BD 10 mL 주사기 (Luer-Lock)BD300912신선한 Lysogeny 국물을 미세유체 채널로 플러시하는 데 사용됩니다.
인큐베이터수명 채널의 균일하고 일정한 온도를 보장하기 위해 사용되는
CentrifugeEppendorf5424R하룻밤 동안 매질한 배지를 최소한의 새 배지로 교체하는 데 사용
원심분리기 바이알Eppendorf301200861.5 mL
CETONI Base 120CETONI GmbH주사기 펌프
직경 0.98 µ의 형광 PS 입자; m (red)microParticles GmbHPS-FluoRed-Fi267
직경 1.08 µ의 형광 PS 입자; m (녹색)microParticles GmbHPS-FluoGreen-Fi182
직경 2.07 µ의 형광 PS 입자; m (녹색)microParticles GmbHPS-FluoGreen-Fi183
직경 2.08 µ의 형광 PS 입자; m (red)microParticles GmbHPS-FluoRed-Fi180
Gigabatch 310 MPVA TePla플라즈마 처리에 사용 10cm 실리콘 웨이퍼
H401-T-CONTROLLER유리판
Okolab가열 유리판
하이델베르크 DWL 2000하이델베르크 기기UV 직접 레이저 작가
인슐린 주사기, U 100, 루어Codan Medical ApSCODA6216401 mL 주사기는 패터닝 공정 중 액체 현탁액을 회수하는 데 사용됩니다
KlayoutOpensource실리콘 마스터
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)Fisher Scientific244610미세유체 채널 Masterflex로 플러시된 용원 국물
전송 튜빙MasterflexHV-06419-050.020'' ID, 0.06'' OD
MOPS(10x)TeknovaM2101milliQ 물로 10배 희석되어
설계하는 데 사용되는
51-0002-01-00스핀 현상액
플라즈마 챔버 ZeptoDiener 전자ZEPTO-1템플릿과 마이크로 채널을 플라즈마 처리하여 결합하는 데 사용됩니다
포지티브 포토 레지스트 AZ1505MicroChemicalsAZ1505
인산 칼륨 이염기성 시그마 AldrichP3786MOPS 1x
Prusa 경화 및 세탁기 CW1SPrusa에 추가되었습니다.모든 폴리머가 경화되고 경화되지 않은 폴리머가 금형에서 제거되도록 하는 데 사용됩니다.
3D 프린팅용 UV 감광성 405nm 액체 수지
Prusa SL1 3d 프린터Prusa는금형 인쇄에 사용
ScaleVWR-CH611-2605PDMS 혼합물 무게에 사용
실리콘 웨이퍼(10cm)Silicon Materials Inc.N/포스 < 100> 1-10 & 오메가; cm
Sü ss MA6 Mask alignerSUSS MicroTec Group은 크롬 유리 마스크와 기판을 정렬하고 기판
Sylgard 184Dow Corning실리콘 엘라스토머 키트를
Techni Etch Cr01Technicchromium etchant
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 실란Sigma Aldrich4489313D 프린팅 금형을 실리아화하는 데 사용됩니다.
TWEEN 20시그마 AldrichP1379패터닝 과정에서 최적의 후퇴 접촉각을 보장하는 데 사용됩니다
Veeco Dektak 6 MVeeco프로파일 로미터
VTC-100 진공 스핀 코터MTI 공사진공 스핀 코터
박스 이미징 서비스 가열 H601-NIKON-TS2R-GLASS 는 은 금형 OPTIspin SB20 ATM 그룹을 야간 매체 Nikon Eclipse Ti2 Nikon Instruments 현미경 openSCAD Opensource 를 대체하는 데 사용됩니다.은 이 노출시키는 데 사용됩니다. 경화제 는

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Choi, C. H., et al. Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer. Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).
  2. Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R.

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