방법 논문

Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

DOI:

10.3791/63136

⸱

2022년 4월 11일

 ,  , 
1National Centre for Biological Sciences, TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering, The University of Texas at Austin

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 최대 36 시간 동안 지속적인 식품 공급이있는 상태에서 C. elegans를 성장시키는 데 사용되는 간단한 미세 유체 칩 설계 및 미세 가공 방법론을 설명합니다. 성장 및 이미징 장치는 또한 며칠 동안 개발 중에 세포 및 하위 세포 프로세스의 간헐적 인 장기 고해상도 이미징을 가능하게합니다.

초록

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Caenorhabditis elegans (C. elegans) 는 발달 및 세포 생물학적 과정을 연구하기위한 귀중한 모델 시스템임이 입증되었습니다. 이러한 생물학적 과정을 이해하려면 종종 동일한 동물의 장기적이고 반복적 인 이미징이 필요합니다. 한천 패드에서 수행되는 기존의 고정 방법과 관련된 긴 회복 시간은 동물 건강에 해로운 영향을 미치므로 장기간에 걸쳐 동일한 동물을 반복적으로 이미지화하는 것은 부적절합니다. 이 논문은 미세 유체 칩 설계, 제조 방법, 온칩 C. elegans 배양 프로토콜 및 개별 동물의 발달 과정을 연구하기위한 장기 이미징의 세 가지 예를 설명합니다. 폴리 디메틸 실록산으로 제작되고 커버 유리에 접착 된이 칩은 질소 가스를 사용하여 편향되는 엘라스토머 멤브레인을 사용하여 유리 기판에 동물을 고정시킵니다. C. elegans 의 완전한 고정화는 마취 없는 방식으로 세포 및 하위 세포 이벤트의 강력한 타임 랩스 이미징을 가능하게 합니다. 단면이 큰 채널 형상을 통해 동물은 부분적으로 밀봉 된 두 개의 격리 막 내에서 자유롭게 움직일 수있어 지속적인 먹이 공급으로 채널에서 성장할 수 있습니다. 이 간단한 칩을 사용하여 동물이 채널 내부에서 성장함에 따라 PVD 감각 뉴런의 신경 과정 성장, 외음부 발달 및 수지상 수목 화와 같은 발달 현상의 이미징을 수행 할 수 있습니다. 장기 성장 및 이미징 칩은 단일 압력 라인, 외부 밸브 없음, 저렴한 유체 소모품으로 작동하며 C. elegans를 사용하는 다른 실험실에서 쉽게 적용할 수 있는 표준 웜 처리 프로토콜을 활용합니다.

서론

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Caenorhabditis elegans는 세포 생물학, 노화, 발달 생물학 및 신경 생물학을 연구하는 강력한 모델 유기체임이 입증되었습니다. 투명한 몸체, 짧은 수명주기, 쉬운 유지 관리, 정의 된 수의 세포, 여러 인간 유전자와의 상 동성 및 잘 연구 된 유전학과 같은 장점으로 인해 C. elegans는 기초 생물학 발견과 응용 연구 1,2 모두에서 인기있는 모델이되었습니다. 개별 동물에 대한 반복적 인 장기 관찰을 통해 세포의 생물학적 및 발달 과정을 이해하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 통상적으로, C. elegans는 한천 패드에 마취되고 현미경으로 이미지화된다. 동물의 건강에 대한 마취제의 부작용은 동일한 동물의 장기간 및 반복 간헐적 인 영상에 마취 된 동물의 사용을 제한합니다 3,4. 최근 미세 유체 기술의 발전과 건강 위험이 무시할 수있는 C. elegans의 마취없는 포획에 대한 적응은 단기간에 걸쳐 동일한 동물의 고해상도 이미징을 가능하게합니다.

미세....

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프로토콜

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1. 성장 및 이미징 장치의 제작

  1. SU8 금형 제작
    1. 워드 프로세싱 소프트웨어 (또는 컴퓨터 지원 설계 CAD 소프트웨어)에서 직사각형 모양을 사용하여 패턴 1 (플로우 레이어) 및 2 (제어 레이어)를 설계하고 폴리 에스테르 기반 필름에 최소 피처 크기가 8μm 인 레이저 플로터를 사용하여 포토 마스크를 인쇄합니다 (그림 1).
    2. 실리콘 웨이퍼를 2.5cm× 2.5cm 조각으로 자르고 20% KOH로 1분 동안 청소합니다. 웨이퍼를 탈이온수(DI)로 헹굽니다. 흐름과 제어 레이어에 각각 하나의 웨이퍼를 사용하십시오.
      주의 : KOH는 부식성이있어주의해서 취급해야합니다.
    3. 조각을 14psi 압축 질소 가스로 건조시킨 다음 120°C의 핫 플레이트에서 4시간 동안 탈수합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 두 조각을 실온으로 식히십시오.
    4. 실리콘 조각 중 하나를 스핀 코터의 척에 놓고 진공을 켜서 웨이퍼를 제자리에 고정합니다. 실리콘 조각에 ~20μL의 헥사메틸디실란(HMDS)을 넣고 스핀 코터를 사용하여 분당 500회전(rpm)으로 5초 동안 코팅한 다음 3,000rpm으로 30초 동안 코팅합니다.
      주의: 이 단계는 노란....

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결과

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장치 특성화: 성장 및 이미징 장치는 비가역적 플라즈마 결합을 사용하여 함께 결합된 두 개의 PDMS 층(그림 1)으로 구성됩니다. 길이가 10mm이고 높이가 40μm 또는 80μm 인 유동층 (패턴 1)을 통해 액체 배양에서 동물을 키울 수 있습니다 (그림 1A). 트래핑 층(패턴 2)은 고해상도 이미징을 위해 동물을 고정화하기 위한 2mm 너비의 멤브레인(그림 1B)을 갖는다. 트래핑 층을 위한 마스크는 또한 연속적인 이미징 시점들 사이의 유동 채널의 섹션 내에서 동물의 움직임을 제한하기 위한 한 쌍의 격리 멤브레인을 생성한다. 장치의 트래핑 멤브레인은 이전 이미징 장치3에서 채택되었습니다. 현재 장치(그림 1C, L

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토론

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이 논문에서는 개발 과정에서 단일 동물의 지속적인 식량 공급과 고해상도 이미징으로 C. elegans 를 성장시키기위한 간단한 미세 유체 장치의 제조 및 사용을위한 프로토콜이 설명되었습니다. 이 제조 공정은 간단하며 비멸균 환경에서 수행할 수 있습니다. 먼지가 없는 환경은 제조 단계에서 매우 중요합니다. 먼지 입자가 있으면 두 접합 표면 사이에 부적절한 접촉이 발생하여 C. elegans 가 고정되어있는 동안 고압 적용 중에 장치의 접착 불량 및 누출이 발생합니다. 제작 된 모든 장치 중에서 장치의 95 %가 실험에 적합합니다. 제조 또는 사용 중 부적절한 접착으로 인해 소수의 장치가 고장납니다(5%). 접착 실패는 전 세계 여러 학술 기관에서 사용할 수 있는 먼지가 없는(> 1,000등급 클린룸) 내부에서 제조 공정을 수행함으로써 줄일 수 있습니다. 흐름 채널에서 박테리아 음식을 청소하고 장치를 재사용하려면 모든 실험 후에 알코올을 흘려 장치를 세척하십시오.

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공개 사항

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S.M. 및 SPK는 미세유체 성장 및 이미징 장치에 대한 출원 중인 특허(특허 출원 번호 640/CHE/2011)의 저자입니다.

감사의 글

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우리는 CIFF 이미징 시설, NCBS가 DST - 나노 기술 센터에서 지원하는 컨포칼 현미경을 사용해 주셔서 감사합니다. SR/55/NM-36-2005). DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK 및 Gautam Menon)가 지원하는 스피닝 디스크, HHMI-IECS 보조금 번호 55007425 (SPK)의 연구 자금에 감사드립니다. HB101, PS3239 및 wdIs51 균주는 NIH 연구 인프라 프로그램 사무소 (P40 OD010440)에서 자금을 지원하는 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)에서 제공했습니다. SPK는 Mike Nonet의 실험실에서 jsIs609 를 만들었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
18G 바늘Sigma-Aldrich, Bangalore, IndiaGauge 18
3방향 마개Cole-ParmerWW-30600-02루어 잠금 CCD 카메라가 있는 Masterflex 피팅
Andor TechnologyEMCCD C9100-13no
회로 기판 필름Fine Line Imaging, 콜로라도, 미국디자인은 65,024dpi로 인쇄됩니다.
컨벡션 오븐Meta-Lab Scientific Industries, 인도MSI-5
CoverslipsBlue stat 현미경 커버 유리22mm x 10Gms
에탄올하이 미디어
Harris 유니 코어 펀처 1mmQiagenZ708801
HexamethyldisilazaneSigma-Aldrich, 방갈로르, 인도440191
핫 플레이트  IKARCT B S 22
이소프로판올Fisher Scientific26895
KOHFisher Scientific
레이저 스캐닝 현미경ZEISSLSM 5 LIVE
마이크로피펫 팁Tarsons0.5-10 µ L 마이크로피펫 팁은 식품 공급에 사용됩니다
. 네거티브 포토레지스트-1MicrochemSU8-2025http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
네거티브 포토레지스트-2MicrochemSU8-2050http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
질소 가스현지 공급업체상업용 질소 가스실린더 부피 7 입방 미터
PDMS(경화 용액)다우코닝 코퍼레이션, 미시건, 미국  Sylgard 경화 용액경화제
페트리 플레이트Praveen Scientific Corporation
플라즈마 세척Harrick Plasma, NY, USA  PDC-32G
면도기 및 블레이드리스터 수술 블레이드
실리콘 엘라스토머 (베이스)다우 코닝 공사, 미시건, 미국실가드 184 기본엘라스토머 기본
실리콘 튜브피셔 사이언티픽내경 1.59 mm 및 외경 3.18 mm
실리콘 웨이퍼대학 웨이퍼 (매사추세츠, 미국) [100] 방향, 4 인치 직경100mm 직경의 웨이퍼에서 작은 조각(2mm × 2mm)을 절단했습니다
CoaterSPS-Europe BV, The NetherlandsSPIN 150
Spinning Disk microscopePerkin Elmer ultra-view VOX systemCSU-X1-A3 N이 시스템에는 4개(405/488/561/640nm) 레이저가 장착되어 있으며 Volocity 소프트웨어 패키지로 제어되었습니다.
SU8 개발자Microchem, MA, USASU8 개발자
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 실란Sigma-Aldrich, Bangalore, India448931Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 실란 증기는 독성
UV 램프Oriel Instruments, Bangalore, India200 Watt 및 collimated UV 광원
Volocity 소프트웨어Perkin-ElmerImage 분석
제 . Spin 입니다

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435(2010).
  2. Hobert, O. Neurogenesis in the nema....

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Microfluidic ChipCaenorhabditis ElegansLong Term ImagingWorm ImmobilizationPDMS DeviceNeuronal Process GrowthDendritic ArborizationNitrogen Gas ImmobilizationTime Lapse ImagingDevelopmental Biology

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