실시간 세포 대사 플럭스 분석은 pH 및 산소 센서를 사용하여 미토콘드리아 및 글리콜 아데노신 삼인산염 생산에 해당하는 산소 소모율 및 세포외 산성화 속도를 측정합니다. 원고는 조골 세포의 에너지 상태와 세포 생물 에너지 상태의 특성화 및 해석을 이해하는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
조골 세포에 의한 뼈 형성은 골격 항상성을 유지하고 궁극적으로 골절을 예방하기 위해 적절한 뼈 획득 및 뼈 회전율을위한 필수 과정입니다. 피크 골량을 최적화하고 다양한 근골격계 질환 (즉, 폐경 후 골다공증, 신경성 식욕 부진증, 제 1 형 및 2 형 당뇨병)과 싸우기 위해 골 생물학 분야에서 놀라운 노력이 이루어졌으며 분화 과정 전반에 걸쳐 조골 세포를 완전히 특성화했습니다. 매트릭스 단백질과 미네랄화 소포를 분비하는 성숙한 조골세포의 주된 역할을 감안할 때, 이러한 과정은 엄청난 양의 세포 에너지 또는 아데노신 삼인산염 (ATP)을 필요로한다는 것이 주목 받았다. 전반적인 세포 에너지 상태는 종종 세포 생물 에너지 요법이라고하며, 세포 요구를 충족시키기 위해 ATP를 유도하기 위해 기질 가용성을 감지하는 일련의 대사 반응을 포함합니다. 따라서, 현재의 방법은 원발성 뮤린 골수 기질 세포 (BMSCs)를 분리하고 조골 세포 분화의 다양한 단계에서 실시간 세포 대사 플럭스 분석기를 사용하여 생체 에너지 상태를 모니터링하는 과정을 자세히 설명합니다. 중요하게도, 이러한 데이터는 대사 프로파일이 조골세포 분화 전반에 걸쳐 극적으로 변화한다는 것을 입증하였다. 따라서, 이러한 생리학적으로 관련된 세포 유형을 사용하는 것은 세포의 생물에너지 상태가 어떻게 전체 기능을 조절할 수 있는지를 완전히 인식하기 위해 요구된다.
서론
조골 세포에 의한 뼈의 형성은 파골 세포에 의한 뼈의 조정 된 파괴 또는 재 흡수를 동반합니다. 조골 세포 뼈 형성과 파골세포 재 흡수 사이의 균형은 골격 항상성에 필수적인 뼈 회전율 또는 리모델링을 설명하는 결합 과정입니다. 조골 세포 기능 장애는 뼈 형성 장애를 일으키고 골다공증 1,2,3을 포함한 다양한 질병을 초래합니다. 골수 기질 줄기 세포 (BMSCs)를 조골 세포 전구체 및 성숙 조골 세포로의 Ex vivo / in vitro 분화는 시간이 지남에 따라 배양 용기에서 미네랄 화 된 골 매트릭스의 형성 및 침착을 초래합니다 4,5,6. 조골 세포에 의한 이러한 뼈 형성은 상당한 양의 세포 에너지를 필요로합니다. 구체적으로, 콜라겐 합성 및 분비는 세포 ATP에 크게 의존하는 것으로 나타났다 : ADP 비율, 그리고 아마도, 미네랄화 된 소포 밀매 및 분비는 추가적인 ATP 7,8,9,10,11을 필요로한다. 많은 연구자들은 조골 세포 생성 및 조골 세포 기능의 과정이 뼈 형성12,13,14,15,16의 대사 요구를 충족시키기 위해 적절한 에너지 공급을 필요로한다는 것을 입증했습니다. 따라서, 이 방법의 목표는 실시간 세포 대사 플럭스 분석기를 사용하여 조골세포 분화 전반에 걸쳐 일차, 뮤린 기질 세포의 생체에너지 상태를 특성화하는 것이다. 이러한 기술은 골격 항상성에 대한 더 나은 이해를 개발하는 데 도움이되며, 이는 궁극적으로 골격 장애를 개선 할 수있는 새로운 치료 옵션의 개발로 이어질 수 있습니다.
실시간 세포 대사 플럭스 분석기는 각각 미토콘드리아 및 글리콜 ATP 생산에 해당하는 살아있는 조골세포의 산소 소모율(OCR) 및 세포외 산성화 속도(ECAR)를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법론의 기본은 포도당이 젖산으로 전환되는 동안 젖산 당 하나의 H + 이온이 방출되어 ECAR 값에 반영된 매체 pH를 변경한다는 사실입니다. 반대로, TCA(트리카르복실산) 사이클 동안, 미토콘드리아를 통한 산화적 인산화는 산소를 이용하거나 소비함으로써CO2를 생성하고, 따라서 OCR을 모니터링하는 것은 이러한 대사 과정을 반영한다. 분석기는 세포 외 미세 환경에서 OCR과 ECAR을 동시에 실시간으로 측정하여 세포 생물 에너지 6,17을 연구 할 때 엄청난 잠재력을 허용합니다. 또한 이러한 분석을 수행하는 것은 실험 목표에 따라 비교적 간단하고 쉽게 사용자 정의 할 수 있습니다. 유사한 기술들이 면역계(18,19), 암 개시 및 진행(20)의 T-세포 대사 조절, 대사 증후군(21,22)에 기여하는 다수의 다른 세포 유형들을 더 이해하기 위해 이용되었다.
대체 기술에 비해 실시간 대사 플럭스 분석기의 장점은 (1) 살아있는 세포의 세포 생체 에너지를 실시간으로 측정 할 수있는 능력, (2) 상대적으로 적은 수의 세포로 분석을 수행 할 수있는 능력 (5,000 세포만큼 낮은 필요), (3) 고처리량 96-well 시스템에서 여러 치료법을 병렬로 조작하는 주입 포트, (4) 정상화를 위해 방사성 표지가없는 자동화 된 세포 이미저의 사용18, 23,24년. 다음의 방법은 분석기를 사용하여 조골세포 분화 전반에 걸쳐 뮤린 BMSCs에서 세포 생물에너지를 모니터링하는 일반화되었지만 상세한 설명을 제공하는 것을 목표로 한다. 일상적으로 수행되는 분석이 포함될 것이며; 그러나 많은 기술과 방법과 마찬가지로 개별 실험실에서 실험에 대한 구체적인 세부 사항을 결정하는 것이 좋습니다.
분석 및 다양한 유형의 분석 가능: 실험 결과의 신뢰성과 일관성을 보장하면서 세포의 생물에너지를 연구하기 위해 다양한 분석 키트 및 시약을 사용할 수 있습니다. 또한 데스크탑 소프트웨어는 쉽게 사용자 정의 할 수있는 분석 템플릿을 제공합니다. 상기 분석은 상이한 대사 파라미터를 측정하기 위한 사용자의 요구에 기초하여 정의될 수 있다. 이러한 분석은 실험 목표 및/또는 과학적 질문에 기초하여 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 네 개의 주사 포트로, 다수의 화합물이 분석 배지에 주입되어 각각의 대사 경로에 특이적인 세포 반응을 분석할 수 있다.
세포 에너지 표현형 시험: 이 분석은 살아있는 세포의 대사 표현형과 대사 잠재력을 측정합니다. 이 분석은 또한 경로 특이적 신진 대사에 대한 일반화 된 아이디어를 얻는 첫 번째 단계로 권장됩니다. ATP 합성효소의 억제제인 올리고마이신 A와 카보닐시아나이드 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존(FCCP)-미토콘드리아 언커플링제의 혼합물이 세포 에너지 잠재력을 이해하기 위해 주입된다. 올리고마이신 A의 주입은 ATP의 합성을 억제하여, 세포가 그들의 에너지 요구를 충족시킬 수 있도록 당분해 속도(ECAR)의 증가를 초래한다; 한편, FCCP의 주입은 미토콘드리아 막의 탈분극으로 인해 더 높은 OCR을 초래한다. 본질적으로,이 분석은 기초 대사 호흡을 묘사하고, 이중 주사, 푸시 또는 스트레스에 이어 대사 반응을 묘사합니다. 이러한 파라미터에 기초하여, 소프트웨어는 시간25,26에 따라 세포를 호기성, 정지, 글리콜 또는 에너지 상태로 분류함으로써 세포의 OCR 및 ECAR을 플로팅한다.
ATP 실시간 생산 속도 분석 : 이것은 글리코 분해와 미토콘드리아 호흡으로부터 동시에 세포 ATP 생산을 측정합니다. 이 분석은 두 가지 에너지 경로로부터의 대사 이동을 정량적으로 측정하고 시간에 따른 미토콘드리아 및 글리콜 ATP 생산 속도에 대한 데이터를 제공합니다. 이 분석은 기저 OCR 및 ECAR 데이터를 얻은 다음 로테논 + 안티마이신 A 혼합물의 주입을 통한 올리고마이신 A와 글리콜 ATP 생산 비율 (미토콘드리아 기능의 총 억제)의 주입을 통해 미토콘드리아 ATP 생성률을 계산하여 미토콘드리아 산성화17,27을 초래합니다.
세포 미토콘드리아 스트레스 테스트 (또는 세포 미토 스트레스 테스트) : 이것은 ATP와 연결된 호흡을 통해 미토콘드리아 기능을 측정하고, 세포 생물 에너지를 정량화하고, 미토콘드리아 기능 장애를 확인하고, 스트레스에 대한 세포의 반응을 측정합니다. 기저 및 예비 호흡 용량, ATP 연결 호흡, 최대 호흡 및 비미토콘드리아 산소 소비를 포함하는 다양한 파라미터가 하나의 분석에서 수득될 수 있다. 이 분석은 올리고마이신 A, FCCP (미토콘드리아 비커플링제), 로테논/안티마이신 A 억제제의 혼합물의 순차적 주사를 수반하여 미토콘드리아 기능에 대한 이들의 효과를 효율적으로 분석한다28.
유연성 미토 연료 플렉스 테스트 : 이것은 그들의 억제제의 존재 및 부재에 의해 세 가지 일차 미토콘드리아 연료의 산화에 의해 미토콘드리아 호흡 속도를 측정한다. 포도당, 글루타민 및 지방산의 순차적 억제는 세포의 의존성, 용량 및 유연성과 다양한 세포 경로에서 세포의 의존성을 측정하여 에너지 수요를 충족시키는 데 도움이됩니다. 미토콘드리아가 다른 연료를 산화시켜 차단된 관심 경로의 요구를 충족시킬 수 없을 때, 세포는 의존성 상태로 들어간다. 세포의 용량은 관심있는 경로의 억제에 이어 다른 두 가지 대안적인 경로의 억제에 의해 계산된다. 세포의 유연성은 억제 된 경로의 연료 요구를 보상하고 충족시키는 미토콘드리아의 능력을 이해하는 데 도움이됩니다. 그것은 세포의 용량에서 세포의 의존성을 뺀 것으로 계산됩니다. 세 가지 상이한 억제제가 독립적으로 또는 두 개의 혼합물로서 사용되어 분석 파라미터를 효과적으로 계산한다. 2-시아노-3-(1-페닐-1H-인돌-3-일)-2-프로페노산(UK5099)은 당분해에서 피루베이트 담체를 차단함으로써 글루코스의 산화를 억제한다. 비스-2-(5-페닐아세트아미도-1,3,4-티아디아졸-2-일)(BPTES) 에틸 설파이드는 글루타민 산화 경로를 억제하고, 에토목시르는 장쇄 지방산29의 산화를 억제한다.
그림 1 : 분석을 위해 조골세포를 배양하고 준비하기위한 방법론의 개략적 표현. 뮤린 BMSC는 긴 뼈에서 분리되고, 배양되고, 25,000 세포/웰 밀도의 96-웰 플레이트에 시딩된다. 조골세포 특이적 배지에서 이들 세포를 배양하는 것은 이들이 분화를 시작하기 위해 80%-100% 컨플루언시에 도달할 때 시작된다. 분석은 분화의 다른 단계에서 수행된다. 카트리지 플레이트는 분석 하루 전에 수화된다. 분석 당일, 분석 요구 사항에 따라 센서 카트리지의 포트에 다른 억제제가 주입되고 교정 버퍼가 96-웰 교정 플레이트에 추가됩니다. 교정 후, 실시간 세포 대사 플럭스 분석이 수행되고, 이어서 마이크로플레이트 이미저를 사용하여 세포 배양 마이크로플레이트를 이미징하여 실시간 세포 대사 플럭스 분석기 데이터를 세포 수로 정규화한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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프로토콜
모든 절차는 밴더빌트 대학 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침과 승인을 기반으로했습니다.
1. 시약의 제조 및 분석 셋업
- 골수 기질 세포의 분리 및 배양 (또한 이전 기사30 참조).
- 알파 변형으로 최소 필수 배지를 10% FBS(태아 소 혈청), 100 U/mL의 페니실린 및 100 μg/mL의 스트렙토마이신으로 보충하여 완전한 알파 최소 필수 배지(αMEM) 세포 배양 배지를 준비합니다.
- 세포가 통과할 수 있도록 0.6 mL 마이크로원심분리 튜브의 끝을 트리밍하고 이를 100 μL의 완전한 αMEM이 들어있는 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 삽입하여 골수 수집 튜브를 준비한다.
- 다음과 같이CO2 처리를 이용하여 마우스를 안락사시킨다. 동물을CO2 챔버에 2-3분 동안 또는 호흡이 멈출 때까지 놓는다. 동물이 의식을 잃은 후 적어도 1 분 동안 기다렸다가 챔버에서 마우스를 제거하고 자궁 경부로 탈구하십시오.
- 멸균 포셉과 한 쌍의 가위를 사용하여 안락사 된 마우스의 하복부를 열어 작은 절개를 만듭니다. 마우스의 긴 뼈 (대퇴골, 경골 및 장골 볏)를 분리하십시오.
- 긴 뼈를 다듬어 모든 연조직을 제거하십시오. 뼈가 청소되면 원위 및 근위 끝에서 ~ 1-2mm를 잘라 골수가 플러시 할 수있는 개구부를 만듭니다.
참고 :이 개구부는 골수를 잃어 버리지 않도록 보수적이어야하며 골수가 플러시 될 수 있도록해야합니다. - 뼈를 1x 멸균 PBS(포스페이트 완충 식염수)의 100 μL를 함유하는 수집 튜브에 넣어 총 골수를 분리한다.
- 실온에서 15-20 초 동안 10,000 x g 에서 원심분리하여 골수를 플러시한다. 골수 세포는 튜브의 바닥에 펠릿.
- 골강이 흰색으로 나타나고 대부분의 골수 요소가없는 것처럼 보일 때까지 원심분리를 반복하십시오. 골수의 혼합 된 개체군을 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 재현탁하십시오.
- 한 동물(대퇴골 및 경골 둘 다)로부터의 세포를 10 mL의 세포 배양 배지에서 75 cm2 세포 배양 플라스크에서 배양하고, 5%CO2가 있는 세포 배양 배양기에서 37°C에서 인큐베이션한다. 2-3 마리의 동물에서 세포를 풀링하는 경우 150cm2 세포 배양 플라스크를 사용하십시오 (권장).
- 혼합 집단의 24-48 h 인큐베이션 후, 배양 배지 내에 포함된 비부착성 조혈 세포 집단을 흡인하고 부착성 세포를 1x PBS로 세척한다.
- BMSCs 및 조골세포 분화로부터의 세포 시딩
- 부착성 세포를 플라스크 표면을 약간 덮기에 충분한 0.25% 트립신-EDTA (약 3-4 mL)를 첨가하여 부착성 세포를 트립신화시키고, 이어서 37°C에서 3분 인큐베이션하였다.
- 플라스크/트립신에 6-7mL의 완전한 αMEM을 첨가하여 조심스럽게 위아래로 피펫팅하여 부착성 BMSC를 재현탁시킵니다. BMSC 현탁액을 원뿔형 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- BMSC 현탁액의 50 μL 분취량을 제거하고 50 μL의 트리판 블루 (1:1 희석액)를 첨가한다. 이 혼합물 10 μL를 혈구측정기 상에 피펫팅하고 현미경으로 관찰함으로써 염료를 배제하는 생존 세포의 총 수를 계수한다. 파란색으로 보이는 죽거나 건강에 해로운 세포(<10% 세포)는 세지 마십시오.
- 세포 수를 기준으로, 플레이트 당 적어도 10 mL의 총 부피에 대해 2.4 x 106 cells/mL의 최종 농도에 필요한 완전한 αMEM에서 세포 현탁액의 부피를 계산한다.
그림 2: 분석기를 위해 특별히 설계된 세포 배양 마이크로플레이트 . (A) 네 개의 배경 보정 웰인 A1, A12, H1, H12가 강조 표시되어 있습니다. 이들 웰은 어떠한 세포도 없는 분석 배지만을 함유한다. (b) 플레이트의 측면에 있는 바코드를 이미징 리더 및 분석기를 이용하여 플레이트를 스캔한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 세포를 원뿔형 튜브에서 1,000 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 세포를 원하는 최종 농도인 2.4 x 106 cells/mL로 재현탁시킨다.
- 세포 현탁액을 저장소로 옮기고, 다채널 피펫을 사용하여, 세포의 균질한 혼합물을 보장하기 위해 세포를 조심스럽게 재현탁시킨다.
- 80 μL의 완전한 αMEM을 갖는 96-웰 세포 배양 마이크로플레이트에 웰 당 2.5 x 104 세포를 시드한다. 백그라운드 보정 웰 (A1, A12, H1, H12)에 세포를 시드하지 마십시오. 대신,이 네 개의 우물에 매체를 추가하십시오.
참고: 분석을 위한 BMSC는 센서 카트리지와 함께 분석기용으로 설계된 96웰 세포 배양 마이크로플레이트에 플레이팅됩니다. 이 플레이트의 표면적은 일반 96웰 플레이트와 다릅니다. 플레이트 내의 각 웰의 표면적은 0.106cm2이며, 이는 전형적인 96-웰 플레이트 면적의 약 40%이다. 최적의 세포 시딩 밀도는 세포 유형에 따라 선택됩니다. 전형적으로, 분석기는 웰 당 0.5-4 x 104 세포 사이에서 검출할 수 있다. 조골 세포는 효과적으로 분화하기 위해 접촉해야합니다. 이를 위해, 완전한 αMEM의 80 μL에서 2.0 x 10 4-3.0 x 104 BMSCs/웰 사이의 도금이 선택되었다. - 플레이트를 부드럽게 교반하여 웰 내의 세포의 균일한 분포를 보장하고 37°C, 5%CO2에서 인큐베이션한다. 세포의 성장과 세포 합류성을 48 h 후 현미경으로 확인하였다. 필요한 경우 세포 배양 배지를 변경하십시오.
- 분석의 목표에 따라, BMSC가 60%-80% 컨플루언트(전형적으로 48-72h)일 때, 세포 배양 배지를 조골세포 분화 배지로 변경함으로써 조골세포 분화를 개시한다(5 mM β-글리세롤 포스페이트 및 50 μg/mL의 L-아스코르브산으로 보충된 완전한 αMEM).
- 미분화된 기질 세포(Day 0)가 분석될 경우, 세포를 완전한 αMEM 하에 유지한다.
- 조골 세포 분화 배지를 격일로 변경하고 현미경으로 세포를 시각화하여 분석 당일까지 건강한지 확인하십시오. 바람직하게는, 예정된 분석 24시간 전에, 배지를 변경하고 일관된 배지 변경 스케줄을 유지한다(권장).
참고: 플레이트를 비스듬히 약간 기울여 미디어를 조심스럽게 교체하십시오. 이것은 세포 배양 플레이트에 피펫 팁의 우발적 인 접촉과 세포의 단층의 파괴를 방지합니다.
2. 세포외 플럭스 교정을 위한 센서 카트리지 제조
- 분석 하루 전에 세포외 분석 키트로부터 센서 카트리지를 수화시킨다. 센서 카트리지(녹색 플레이트)를 분리하고 센서를 거꾸로 놓습니다.
- 다중 채널 피펫을 사용하여 200μL의H2O를 유틸리티 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 위에 조심스럽게 다시 놓고 플레이트를 실온에서 밤새 인큐베이션합니다.
참고: 제조업체는 센서 카트리지를 비CO2 37°C 인큐베이터에서 하룻밤 동안 인큐베이션할 것을 권장합니다. 그러나 센서 카트리지가 크게 증발할 수 있습니다. 이 경우 센서 카트리지를 실온에서 인큐베이션할 수 있습니다. 이들 플레이트는 최소 4시간 및 최대 72시간 동안 배양되어야 한다. - 분석 당일에, 유틸리티 플레이트로부터H2O를 버리고 200 μL의 캘리브란트를 첨가한다. 시험 전에 적어도 1 h 동안 유틸리티 플레이트를 인큐베이션한다.
3. 실시간 세포 대사 플럭스 분석기 배지 준비
- BMSCs로 검정을 실행하기 위해 7.4의 미리 조정된 pH(권장)를 갖는 페놀 적색 유리 DMEM 매질을 사용하십시오.
- DMEM 배지에 1 mM 피루베이트 나트륨, 2 mM 글루타민, 10 mM 글루코스, 200 nM 인슐린, 50-200 μM 올레산 BSA를 보충하여 80 mL의 분석 배지를 제조하였다.
- 완전한 분석 배지를 수조에서 37°C에서 인큐베이션한다.
4. 센서 카트리지용 화합물의 제조
- 올리고마이신 A, 로테논, 및 안티마이신 A를 얼음 위에 해동시킨다. 사용 전에 화합물을 가용화하기 위해 위아래로 피펫을 만듭니다.
- 제조된 분석 배지 3 mL를 각 튜브에 첨가하고, 이어서 각각의 화합물-튜브 A를 첨가한다: 26.4 μL의 2.5 mM 올리고마이신 A; 튜브 B: 3.1 μL의 12.67 mM 로테논 + 4.1 μL의 9.4 mM 안티마이신 A + 30 μL의 헉스트염색.
- 이들 억제제의 10x 농도를 상응하는 포트에 로딩한다. 필요한 주사액의 최종 농도는 2 μM의 올리고마이신 A, 1 μM의 로테논, 및 4.1 μM의 안티마이신 A이다.
참고: Hoechst는 이미징 및 정상화 목적으로 핵을 형광 염색하기 위해 최종 주입 포트에 추가됩니다. 이러한 농도는 세포 유형에 기초하여 최적화될 수 있다. - 이들 화합물 20 μL를 180 μL의 분석 배지에 세포에 로딩한다.
5. 분석을 위한 세포 배양 마이크로플레이트 준비
- 세포배양 마이크로플레이트를 37°C 배양기에서 제거하고 현미경으로 세포를 관찰하였다.
- 수조에서 분석 배지를 제거한다.
- 세포를 200 μL의 분석 배지로 두 번 부드럽게 세척하고 웰 당 200 μL의 분석 배지를 첨가한다.
참고: 최종 분석 매질이 세포에 추가되면 플레이트가 분석기에 들어갈 때까지의 시간이 중요합니다. 따라서 1시간 이내에 다음 단계를 수행할 때까지 미디어 교체를 시작하지 마십시오. - 현미경으로 세포를 검사하여 세포가 웰에 부착되어 있는지 확인하십시오.
- D5 및 E8 내의 세포가 일관된 단층으로 부착되도록 하고, 세척 단계 동안 세척되지 않았다. 세포 이미징 소프트웨어는 자동 초점 및 자동 노출을 설정하기 위해이 두 웰을 사용합니다.
참고: 제조업체는 플레이트를 비CO2 37°C 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션할 것을 권장합니다. 자동화 된 이미징이 선호되는 경우이 단계를 건너 뛸 수 있습니다. 예를 들어, 마이크로플레이트 이미저는 폐쇄된 챔버 내에서 동일한 조건을 유지하고, 셀은 브라이트필드 하에서 이미징될 수 있다.
6. 분석 및 이미징 설정
그림 3: 컨트롤러 소프트웨어 소프트웨어는 장비가 연결되어 있고 37°C로 설정되어 있는지 확인합니다. 세포외 플럭스 분석기로 수행될 수 있는 상이한 어세이를 위한 템플릿 파일들은 실험 목표에 기초하여 어세이를 추가로 맞춤화하도록 선택될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 장비 옆의 컴퓨터에서 데스크톱 소프트웨어를 엽니다.
- 컨트롤러 소프트웨어의 왼쪽 아래 모서리에서 연결 상태를 확인합니다.
- 템플릿으로 이동하여 XF ATP 속도 분석 템플릿 파일 또는 적절한 분석 템플릿을 선택합니다.
- 화면 상단에서 그룹 정의를 선택하고 그룹을 정의합니다.
- 플레이트 맵 레이아웃을 선택하고 정의된 그룹에 따라 웰을 할당합니다.
- 계측기 프로토콜을 확인하고, 추가된 화합물이 올바르게 나열되었는지 확인하고, 향후 참조를 위해 프로젝트 정보를 포함하십시오.
- 실행 분석을 클릭하십시오. 그러면 결과 파일 저장 위치를 선택하라는 메시지가 표시됩니다.
- 결과 파일을 저장할 위치를 선택합니다.
- 분석 날짜와 함께 파일을 저장하고 실행 시작을 클릭하십시오.
- 센서 카트리지와 유틸리티 플레이트를 트레이에 놓고 교정을 시작할 준비가 되었습니다 를 클릭합니다.
- 교정을 시작하기 전에 카트리지 뚜껑이 제거되고 센서 카트리지가 유틸리티 플레이트의 올바른 방향으로 놓여 있는지 확인하십시오. 이 단계는 10-20 분이 걸리고 완료되면 소프트웨어가 로드 셀 플레이트 대화 상자를 표시합니다.
7. 밝은 필드 이미지 얻기
참고: 이 단계는 선택 사항입니다. 사용 가능한 이미징 장비가 없으면 8단계로 건너뜁니다.
그림 4: 세포 이미징 소프트웨어는 컴퓨터를 통해 이미징 리더와 통신합니다. 마이크로플레이트에 있는 세포는 분석 전후에 이미징될 수 있고, 세포 수/웰은 데이터를 정규화하기 위해 분석 후에 얻어진다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 컴퓨터에서 셀 이미징 소프트웨어를 엽니다.
- 마이크로플레이트 이미저가 켜져 있고 포트가 컴퓨터에 연결되어 있는지 확인합니다.
- 화면 왼쪽 하단의 상태 표시줄을 확인하여 온도가 37°C로 설정되어 있고 연결 상태가 준비되면 녹색으로 강조 표시되어야 하는지 확인합니다.
- 플레이트 바코드를 스캔하여 이미징 프로세스를 시작하십시오.
- 셀 플레이트에 이름을 입력하고 저장을 누르십시오 (밝은 필드와 형광 이미지가 모두 저장 되는 이름입니다). Brightfield 스캔 수행을 클릭하십시오.
- 다음 화면, 플레이트 및 스캔 메뉴에는 이미징 옵션이 표시됩니다. 분석 전에 브라이트필드 스캔 시작을 선택합니다.
- 세포 배양 마이크로플레이트를 플레이트 커버/뚜껑과 함께 트레이 홀더에 놓고 A1을 A1 마크와 잘 정렬합니다. 트레이 닫기를 클릭합니다.
- 다음 화면인 브라이트필드 이미지 획득(platemap map)이 나타납니다. 모든 웰 스캔을 클릭하면 시스템 초기화 프로세스가 시작되고 30 ~ 35 분의 스캔이 시작됩니다.
- 브라이트필드 스캔 후, 세포 배양 마이크로플레이트를 제거하고 이를 분석기에 넣어 분석을 수행한다.
8. 분석 실행
- 보정이 완료되면 소프트웨어는 로드 셀 플레이트 대화 상자를 표시합니다.
- 트레이 열기를 클릭하여 유틸리티 트레이를 세포 배양 마이크로플레이트로 교체합니다. 뚜껑이 제거되고 플레이트의 A1이 올바른 방향으로 맞는지 확인하십시오.
- 그런 다음 로드 셀 플레이트 를 클릭하여 분석을 시작하십시오. 센서 카트리지는 분석 주입을 위해 분석기 내부에 남아 있습니다.
- 분석이 시작될 때까지 기다렸다가 예상 완료 시간을 표시합니다.
- 분석이 완료되면 소프트웨어는 센서 카트리지 언로드 대화 상자를 표시합니다. 꺼내기를 클릭하고 분석기에서 세포 배양 마이크로플레이트를 제거합니다.
- 센서 카트리지를 조심스럽게 분리하고 세포판 덮개를 교체합니다. 세포는 형광 이미징 및 세포 계수를 위해 준비됩니다.
- 셀 플레이트와 센서 카트리지를 분리한 후 분석 완료 대화 상자가 나타납니다.
- 결과 보기를 클릭하여 분석 결과 파일을 열고 데이터를 즉시 정규화하거나 홈을 클릭합니다.
9. 형광 이미지 획득 및 정규화
참고: 이 단계는 BMSC 및 조골세포의 정상화를 위해 선택적이지만 선호되는 방법입니다. 이미징 장비를 사용할 수 없는 경우 단백질 또는 DNA 분리 및 정량화와 같은 또 다른 정규화 방법을 수행해야 합니다.
도 5: 분석으로부터의 데이터의 정규화에 사용된 이미징 소프트웨어로부터의 대표적인 이미지 . (A) 웰 전체에 걸친 세포 합류를 보여주는 밝은 필드 이미지를 스티치한다. (b) 분석 결과를 정규화하기 위해 세포 수를 계수하는 데 사용되는 조골세포의 Hoechst-염색된 핵을 보여주는 스티치된 형광 이미지. 이들은 분화 7 일 후의 조골 세포입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 분석이 완료된 후 핸드헬드 바코드 판독기로 플레이트 바코드를 스캔합니다. 플레이트가 이미 이미지화 된 경우 새 이름이 필요하지 않습니다.
- 형광 및 셀 카운트를 선택하고 세포판을 트레이 홀더에 놓은 다음 트레이 닫기를 클릭합니다.
- 이미지 수집 창에서 모든 웰 스캔 을 선택하여 이미징을 시작합니다. 형광 이미징은 전체 플레이트를 스캔하는 데 약 15-20 분이 걸립니다. 스캔이 완료되었음을 나타내는 녹색 눈금 표시를 관찰하십시오.
- 이미징 및 세포 이미징 적용에서 형광 이미지 및 세포 계수를 검토하여 두 개의 웰을 무작위로 클릭합니다.
참고: 화면 오른쪽 하단에 카운트된 셀을 볼 수 있는 옵션이 있습니다. 이 옵션은 마스크된 이미지를 표시하여 계산된 객체를 강조 표시합니다. - 형광 이미징이 완료되면 추가 참조를 위해 이미지를 내보냅니다.
- 이미징 및 셀 수가 완료되면 결과 파일을 열고 정규화를 클릭합니다. 정규화 화면은 플레이트 레이아웃과 셀 수를 가져올 수있는 옵션을 제공합니다.
- 가져오기를 클릭하고 데스크톱 소프트웨어에 대한 적용을 선택하여 세포 수로 검정을 자동으로 정규화합니다.
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결과
도 6: 각각의 표준 오차를 갖는 대조군 대 치료군의 세포 생체에너지 프로파일을 이해하기 위해 일상적으로 수행된 분석에 대한 대표적인 그래프 . (A) 세포 에너지 표현형 검정. 플롯은 대조군 대 두 처리군(n=3)의 당분해(ECAR) 대 미토콘드리아 호흡(OCR)을 나타낸다. 올리고마이신 A 및 FCCP 스트레스 요인의 주입은 개방 기호로 표시된 기준선 활성을 상승시키는 반면, 닫힌 기호는 다른 스트레스 요인에 대한 세포의 반응을 나타냅니다. (b) 실시간 ATP 속도 분석법. ATP 속도 분석은 대조군 및 처리군 (...
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토론
실시간 세포 대사 플럭스 분석기는 다양한 조건에서 세포 에너지를 탐색하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 BMSCs의 효율적인 단리, 적절한 세포 배양 플레이트에서 세포 배양, 성숙 조골세포로의 분화를 보여주며, 이는 세포외 플럭스 분석기를 사용하는 다양한 분석에 사용될 수 있다. 또한, 센서 카트리지의 수화, 주입 포트의 로딩, 분석 수행, 데이터의 정규화 및 데이터 분석을 포함한 실시간 세포 대사 플럭스 분석의 중요한 단계도 자세히 설명됩니다. 이 분석은 세포의 생물에너지를 이해하기 위해 상이한 미토콘드리아 및 글리콜 억제제에 대한 조골세포의 반응을 평가한다. 이 프로토콜은 세포 유형에 따라 조골 세포에 특별히 최적화되어 있으며,이 방법은 제조업체의 표준 프로토콜에 비해보다 강력하고 정확한 가이드를 제공합니다. 세포 시딩 밀도, 화합물의 농도, 배지에 외인성 기질의 첨가, 완충 능력을 포함하는 이 프로토콜의 몇몇 파라미터는 특정 세포 유형 및 그의 배경에 기초하여 최적화될 필요가 있다.
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 국립 보건원 (NIH) 국립 관절염 및 근골격계 및 피부 질환 연구소 (NIAMS) 그랜트 AR072123 및 국립 노화 연구소 (NIA) 그랜트 AG069795 (ERR)의 지원을 받았다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 트립신 EDTA | 시그마-알드리치 | T4049 | |
| 2-시아노-3-(1-페닐-1H-인돌-3-일)-2-프로펜산 | 시그마 - 알드리치 | PZ0160 | UK5099 |
| 안티마이신 A | 시그마 - 알드리치 | A8674 | |
| 아스코르브산 | 시그마-알드리치 | A4544-100G | |
| 비스-2-(5-페닐아세타미도-1,3,4-티디아졸-2-일)에틸 설파이드 | 시그마 - Aldrich | SML0601 | BPTES |
| 카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존 | 시그마 - Aldrich | C2920 | FCCP |
| Cytation 5 이미징 리더 | BioTek | N/A | 마이크로플레이트 이미저 |
| 에토목시르 나트륨 염 수화물 | 시그마 - Aldrich | E1905 | |
| Hoechst 33342 용액(20mM) | Thermo Scientific | 62249 | |
| 인슐린 | 시그마 - Aldrich | I6634 | |
| 소 혈청의 올레산 알부민 | 시그마 - Aldrich | O3008 | |
| 올리고마이신 A - 5mg | 시그마 - Aldrich | 75351 | |
| 로테논 | 시그마 - Aldrich | R8875-1G | |
| Seahorse XF 1.0 M 포도당 용액 | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100mM 피루브산 솔루션 | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200mM 글루타민 솔루션 | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF DMEM 매체 | Agilent Technologies | 103575-100 | DMEM 분석 매체 5mM HEPES, pH 7.4, 페놀 적색, 중탄산나트륨, 포도당, 피루베이트 및 L-글루타민 없음 |
| Seahorse XFe96 분석기 | Agilent Technologies | S7800B | 실시간 대사 플럭스 분석기 |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | XFe96 센서 카트리지, 세포 배양 마이크로플레이트 및 Seahorse XF Calibrant 솔루션 포함 |
| 세포 이미징 1.1.0.11 소프트웨어 | Agilent Technologies - BioTek | ||
| Wave 소프트웨어 2.6.1 | Agilent Technologies | ||
| β-glycerol phosphate | 시그마-알드리치 | G9422-50G |
참고문헌
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