실시간 세포 대사 플럭스 분석은 pH 및 산소 센서를 사용하여 미토콘드리아 및 글리콜 아데노신 삼인산염 생산에 해당하는 산소 소모율 및 세포외 산성화 속도를 측정합니다. 원고는 조골 세포의 에너지 상태와 세포 생물 에너지 상태의 특성화 및 해석을 이해하는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
조골 세포에 의한 뼈 형성은 골격 항상성을 유지하고 궁극적으로 골절을 예방하기 위해 적절한 뼈 획득 및 뼈 회전율을위한 필수 과정입니다. 피크 골량을 최적화하고 다양한 근골격계 질환 (즉, 폐경 후 골다공증, 신경성 식욕 부진증, 제 1 형 및 2 형 당뇨병)과 싸우기 위해 골 생물학 분야에서 놀라운 노력이 이루어졌으며 분화 과정 전반에 걸쳐 조골 세포를 완전히 특성화했습니다. 매트릭스 단백질과 미네랄화 소포를 분비하는 성숙한 조골세포의 주된 역할을 감안할 때, 이러한 과정은 엄청난 양의 세포 에너지 또는 아데노신 삼인산염 (ATP)을 필요로한다는 것이 주목 받았다. 전반적인 세포 에너지 상태는 종종 세포 생물 에너지 요법이라고하며, 세포 요구를 충족시키기 위해 ATP를 유도하기 위해 기질 가용성을 감지하는 일련의 대사 반응을 포함합니다. 따라서, 현재의 방법은 원발성 뮤린 골수 기질 세포 (BMSCs)를 분리하고 조골 세포 분화의 다양한 단계에서 실시간 세포 대사 플럭스 분석기를 사용하여 생체 에너지 상태를 모니터링하는 과정을 자세히 설명합니다. 중요하게도, 이러한 데이터는 대사 프로파일이 조골세포 분화 전반에 걸쳐 극적으로 변화한다는 것을 입증하였다. 따라서, 이러한 생리학적으로 관련된 세포 유형을 사용하는 것은 세포의 생물에너지 상태가 어떻게 전체 기능을 조절할 수 있는지를 완전히 인식하기 위해 요구된다.
서론
조골 세포에 의한 뼈의 형성은 파골 세포에 의한 뼈의 조정 된 파괴 또는 재 흡수를 동반합니다. 조골 세포 뼈 형성과 파골세포 재 흡수 사이의 균형은 골격 항상성에 필수적인 뼈 회전율 또는 리모델링을 설명하는 결합 과정입니다. 조골 세포 기능 장애는 뼈 형성 장애를 일으키고 골다공증 1,2,3을 포함한 다양한 질병을 초래합니다. 골수 기질 줄기 세포 (BMSCs)를 조골 세포 전구체 및 성숙 조골 세포로의 Ex vivo / in vitro 분화는 시간이 지남에 따라 배양 용기에서 미네랄 화 된 골 매트릭스의 형성 및 침착을 초래합니다 4,5,6. 조골 세포에 의한 이러한 뼈 형성은 상당한 양의 세포 에너지를 필요로합니다. 구체적으로, 콜라겐 합성 및 분비는 세포 ATP에 크게 의존하는 것으로 나타났다 : ADP 비율, 그리고 아마도, 미네랄화 된 소포 밀매 및 분비는 추가적인 ATP 7,8,9,10,11....
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프로토콜
모든 절차는 밴더빌트 대학 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침과 승인을 기반으로했습니다.
1. 시약의 제조 및 분석 셋업
- 골수 기질 세포의 분리 및 배양 (또한 이전 기사30 참조).
- 알파 변형으로 최소 필수 배지를 10% FBS(태아 소 혈청), 100 U/mL의 페니실린 및 100 μg/mL의 스트렙토마이신으로 보충하여 완전한 알파 최소 필수 배지(αMEM) 세포 배양 배지를 준비합니다.
- 세포가 통과할 수 있도록 0.6 mL 마이크로원심분리 튜브의 끝을 트리밍하고 이를 100 μL의 완전한 αMEM이 들어있는 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 삽입하여 골수 수집 튜브를 준비한다.
- 다음과 같이CO2 처리를 이용하여 마우스를 안락사시킨다. 동물을CO2 챔버에 2-3분 동안 또는 호흡이 멈출 때까지 놓는다. 동물이 의식을 잃은 후 적어도 1 분 동안 기다렸다가 챔버에서 마우스를 제거하고 자궁 경부로 탈구하십시오.
- 멸균 포셉과 한 쌍의 가위를 사용하여 안락사 된 마우스의 하복부를 열어 작은 절개를 만듭니다. 마우스의 긴 뼈 (대퇴....
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결과
도 6: 각각의 표준 오차를 갖는 대조군 대 치료군의 세포 생체에너지 프로파일을 이해하기 위해 일상적으로 수행된 분석에 대한 대표적인 그래프 . (A) 세포 에너지 표현형 검정. 플롯은 대조군 대 두 처리군(n=3)의 당분해(ECAR) 대 미토콘드리아 호흡(OCR)을 나타낸다. 올리고마이신 A 및 FCCP 스트레스 요인의 주입은 개방 기호로 표시된 기준선 활성을 상승시키는 반면, 닫힌 기호는 다른 스트레스 요인에 대한 세포의 반응을 나타냅니다. (b) 실시간 ATP 속도 분석법. ATP 속도 분석은 대조군 및 처리군 (.......
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토론
실시간 세포 대사 플럭스 분석기는 다양한 조건에서 세포 에너지를 탐색하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 BMSCs의 효율적인 단리, 적절한 세포 배양 플레이트에서 세포 배양, 성숙 조골세포로의 분화를 보여주며, 이는 세포외 플럭스 분석기를 사용하는 다양한 분석에 사용될 수 있다. 또한, 센서 카트리지의 수화, 주입 포트의 로딩, 분석 수행, 데이터의 정규화 및 데이터 분석을 포함한 실시간 세포 대사 플럭스 분석의 중요한 단계도 자세히 설명됩니다. 이 분석은 세포의 생물에너지를 이해하기 위해 상이한 미토콘드리아 및 글리콜 억제제에 대한 조골세포의 반응을 평가한다. 이 프로토콜은 세포 유형에 따라 조골 세포에 특별히 최적화되어 있으며,이 방법은 제조업체의 표준 프로토콜에 비해보다 강력하고 정확한 가이드를 제공합니다. 세포 시딩 밀도, 화합물의 농도, 배지에 외인성 기질의 첨가, 완충 능력을 포함하는 이 프로토콜의 몇몇 파라미터는 특정 세포 유형 및 그의 배경에 기초하여 최적화될 필요가 있다.
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 국립 보건원 (NIH) 국립 관절염 및 근골격계 및 피부 질환 연구소 (NIAMS) 그랜트 AR072123 및 국립 노화 연구소 (NIA) 그랜트 AG069795 (ERR)의 지원을 받았다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 트립신 EDTA | 시그마-알드리치 | T4049 | |
| 2-시아노-3-(1-페닐-1H-인돌-3-일)-2-프로펜산 | 시그마 - 알드리치 | PZ0160 | UK5099 |
| 안티마이신 A | 시그마 - 알드리치 | A8674 | |
| 아스코르브산 | 시그마-알드리치 | A4544-100G | |
| 비스-2-(5-페닐아세타미도-1,3,4-티디아졸-2-일)에틸 설파이드 | 시그마 - Aldrich | SML0601 | BPTES |
| 카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존 | 시그마 - Aldrich | C2920 | FCCP |
| Cytation 5 이미징 리더 | BioTek | N/A | 마이크로플레이트 이미저 |
| 에토목시르 나트륨 염 수화물 | 시그마 - Aldrich | E1905 | |
| Hoechst 33342 용액(20mM) | Thermo Scientific | 62249 | |
| 인슐린 | 시그마 - Aldrich | I6634 | |
| 소 혈청의 올레산 알부민 | 시그마 - Aldrich | O3008 | |
| 올리고마이신 A - 5mg | 시그마 - Aldrich | 75351 | |
| 로테논 | 시그마 - Aldrich | R8875-1G | |
| Seahorse XF 1.0 M 포도당 용액 | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100mM 피루브산 솔루션 | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200mM 글루타민 솔루션 | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF DMEM 매체 | Agilent Technologies | 103575-100 | DMEM 분석 매체 5mM HEPES, pH 7.4, 페놀 적색, 중탄산나트륨, 포도당, 피루베이트 및 L-글루타민 없음 |
| Seahorse XFe96 분석기 | Agilent Technologies | S7800B | 실시간 대사 플럭스 분석기 |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | XFe96 센서 카트리지, 세포 배양 마이크로플레이트 및 Seahorse XF Calibrant 솔루션 포함 |
| 세포 이미징 1.1.0.11 소프트웨어 | Agilent Technologies - BioTek | ||
| Wave 소프트웨어 2.6.1 | Agilent Technologies | ||
| β-glycerol phosphate | 시그마-알드리치 | G9422-50G |
참고문헌
- Rodan, G. A. Bone homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (23), 13361-13362 (1998).
- Nakahama, K. I. Cellular communications in bone homeostasis and repair. Cellular and Molecular Life Science....
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재인쇄 및 허가
