방법 논문

세포 분류 없이 스냅 동결 이종 조직 샘플에서 세포 유형 특이적 RNA 분리

DOI:

10.3791/63143

⸱

2021년 12월 8일

 , 
1Department of Anatomy, Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine, Auburn University

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 세포 유형 특이적 번역 리보솜 mRNA를 분리하는 것을 목표로 합니다.

초록

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세포 이질성은 전사체 수준에서 복잡한 조직의 기능을 이해하는 데 어려움을 겪습니다. 세포 유형 특이적 RNA를 사용하면 조직의 이질성으로 인한 잠재적인 위험을 방지하고 강력한 전사체 분석을 가능하게 합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 번역 리보솜 친화성 정제(TRAP) 방법을 사용하여 세포 분류 없이 복잡한 조직에서 소량의 EGFP 발현 세포에서 리보솜 결합 RNA를 분리하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 최근 이용 가능한 NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 세포 유형 특이적 RNA를 분리하는 데 적합하며 EGFP 발현 세포에서 RNA를 분리하는 데에도 사용할 수 있습니다.

서론

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RNA 시퀀싱(RNA-seq) 및 마이크로어레이를 포함한 고처리량 접근 방식을 통해 게놈 전체 수준에서 유전자 발현 프로필을 조사할 수 있게 되었습니다. 심장, 뇌 및 고환과 같은 복잡한 조직의 경우 세포 유형 특이적 데이터는 전체 조직 1,2,3의 RNA 사용을 비교하는 더 자세한 정보를 제공합니다. 세포 이질성의 영향을 극복하기 위해, 번역 리보솜 친화성 정제(TRAP) 방법은 2010년대 초부터 개발되어 왔다4. TRAP는 조직 해리없이 특정 세포 유형에서 리보솜 결합 RNA를 분리 할 수 있습니다. 이 방법은 초파리 배아5에서 극히 드문 근육 세포 집단을 표적으로 삼고, 모델 식물 Arabidopsis thaliana6에서 다른 뿌리 세포를 연구하고, 포유류7에서 내피 세포의 전사체 분석을 수행하는 것을 포함하여 다양한 유기체에서 트랜스플라톰(번역을 위해 리보솜에 모집되는 mRNA) 분석에 사용되었습니다.

TRAP은 모델 유기체의 리보솜에 태그를 지정하기 위해 유전자 변형이 필요합니다. Evan Rosen과 동료들은 최근 Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) 마우스8이라는 마우스 모델을 개발했으며, 이는 2017 년부터 Jackson Laboratory를 통해 제공되었습니다. 연구자들은 Cre 마우스 라인과 교차함으로써 이 NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 세포 분류 없이 Cre 발현 세포에서 리보솜 결합 RNA와 세포핵을 분리할 수 있습니다. NuTRAP 대립 유전자도 운반하는 Cre 발현 세포에서 EGFP/L10a 태그가 지정된 리보솜을 사용하면 친화성 풀다운 분석을 사용하여 번역 mRNA를 분리할 수 있습니다. 동일한 세포에서 비오틴 리가아제 인식 펩타이드(BLRP) 태그가 부착된 핵막(mCherry 양성이기도 함)은 친화성 또는 형광 기반 정제를 사용하여 핵 분리를 허용합니다. 같은 연구팀은 또한 핵막이 비오틴8없이 mCherry로만 표지 된 유사한 마우스 라인을 생성했습니다. 이 두 개의 유전자 변형 마우스 라인은 관심 있는 특정 유형의 세포의 쌍을 이루는 후성유전체 및 전사체 프로필을 특성화할 수 있는 액세스를 제공합니다.

고슴도치(Hh) 신호 전달 경로는 조직 발달에 중요한 역할을 합니다9. GLI 계열의 구성원인 GLI1은 전사 활성제 역할을 하며 Hh 신호 전달을 매개합니다. Gli1+ 세포는 부신과 고환을 포함한 많은 호르몬 분비 기관에서 찾을 수 있습니다. NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 Gli1+ 세포로부터 세포 유형 특이적 DNA 및 RNA를 분리하기 위해, Gli1-CreERT2 마우스를 NuTRAP 마우스와 교차시켰다. Shh-CreERT2 마우스는 또한 소닉 헤지혹(Shh) 발현 세포를 단리하는 것을 목표로 하는 NuTRAP 마우스와 교차하였다. 다음 프로토콜은 Gli1-CreERT2를 사용하는 방법을 보여줍니다. NuTRAP 마우스를 사용하여 성인 마우스 고환의 Gli1+ 세포에서 리보솜 결합 RNA를 분리합니다.

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프로토콜

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수행 된 모든 동물 실험은 Auburn University의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에서 승인 한 프로토콜을 따랐습니다.

참고: 다음 프로토콜은 Gli1-CreERT2의 P28에서 하나의 고환(약 100mg)을 사용합니다. NuTRAP 마우스 (무스 근육). 시약의 부피는 샘플 유형과 조직 수에 따라 조정해야 할 수도 있습니다.

1. 조직 수집

  1. CO2 챔버를 사용하여 마우스를 안락사시키고, 복부 표면을 70% 에탄올로 살균한다.
  2. 가위로 하복부를 열고 고환을 제거하십시오. 액체 질소 (LN2)를 사용하여 고환을 즉시 스냅 동결하십시오.
  3. 사용할 때까지 LN2 의 증기상에 샘플을 보관하십시오.

2. 시약 및 비드 준비

  1. 균질화 원액 준비: 50 mM 트리스(pH 7.4), 12 mMMgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40 및 1 mg/mL 헤파린을 추가합니다. 사용할 때까지 (최대 1 개월) 4 ° C에서 용액을 보관하십시오.
  2. 사용하기 전에 원액(단계 2.1)에서 균질화 작업 완충액을 새로 준비합니다: DTT(최종 농도: 1mM), 시클로헥시미드(최종 농도: 100μg/mL), 재조합 리보뉴클레아제(최종 농도: 200단위/mL) 및 프로테아제 억제제 칵테일(최종 농도: 1x)을 균질화 원액에 추가하여 필요한 양의 균질화 작업 완충액을 만듭니다. 사용할 때까지 새로 준비한 작업 버퍼를 얼음에 보관하십시오.
  3. 저염 및 고염 세척액을 준비하십시오.
    1. 저염 세척 완충액을 제조하여 50 mM 트리스(pH 7.4), 12 mMMgCl2, 100 mM KCl, 및 1% NP-40을 혼합하였다. 사용하기 전에 DTT(최종 농도: 1mM)와 사이클로헥시미드(최종 농도: 100μg/mL)를 추가합니다.
    2. 고염 세척 완충액을 제조하여 50 mM 트리스(pH 7.4), 12 mMMgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40을 혼합하였다. 사용하기 전에 DTT(최종 농도: 2mM)와 사이클로헥시미드(최종 농도: 100μg/mL)를 추가합니다.
  4. 단백질 G 비드 준비 (재료 표) :
    1. 각 샘플에는 50μL의 단백질 G 비드가 필요합니다. 필요한 양의 비드를 1.5mL 원심분리 튜브에 넣고 튜브를 랙에 30-60초 동안 그대로 두어 마그네틱 랙을 사용하여 비드를 용액에서 분리합니다.
    2. 피펫팅으로 상청액을 제거합니다. 매번 얼음처럼 차가운 저염 세척 완충액 1mL로 구슬을 세 번 씻습니다.

3. 조직 용해 및 균질화

  1. 2mL의 얼음처럼 차가운 균질화 작업 완충액(2.2단계에서 새로 준비)을 유리 티슈 그라인더 세트에 추가합니다. 냉동 샘플을 분쇄기에 빠르게 넣고 느슨한 유봉을 사용하여 얼음 위에서 30 스트로크로 조직을 균질화하십시오.
  2. 균질액을 2mL 둥근 바닥 튜브에 옮기고 12,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
  3. 상청액을 새 2mL 튜브로 옮깁니다. 1.5mL 튜브에 100μL를 "입력"으로 저장합니다.
  4. 상청액을 항-GFP 항체(5μg/mL; 1:400)와 함께 2mL 튜브에서 엔드 오버엔드 회전기(24rpm)에서 4°C에서 밤새 배양합니다.

4. 면역침전

  1. 균질액/항체 혼합물을 단계 2.4에서 세척된 단백질 G 비드를 포함하는 새로운 2mL 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다. 엔드 오버 엔드 로테이터(24rpm)에서 4°C에서 2시간 동안 배양합니다.
  2. 자석 랙을 사용하여 상청액으로부터 자성 비드를 분리한다. 상청액을 "음수 분획"으로 저장하십시오. 음성 분획에는 (1) EGFP 음성 세포의 RNA와 (2) 리보솜에 결합하지 않은 EGFP 양성 세포의 RNA가 포함됩니다.
  3. 비드에 고염 세척 버퍼 1mL를 추가하고 튜브를 잠시 와류하여 비드를 세척합니다. 튜브를 자석 랙에 놓습니다.
  4. 세척 버퍼를 제거합니다. 세척 단계를 두 번 더 반복하십시오. 비드는 이제 EGFP 양성 세포의 비드-리보솜-RNA 복합체를 포함합니다.

5. RNA 추출

참고: 다음 단계는 RNA 분리 키트(재료 표)에서 채택된 것입니다. 각 분획(즉, 입력, 양성 및 음성)을 독립적인 샘플로 처리하고 RNA를 독립적으로 분리합니다.

  1. 단계 4.4의 비드를 50μL의 추출 버퍼(RNA 분리 키트에서)와 함께 써모믹서(42°C, 500rpm)에서 30분 동안 인큐베이션하여 비드에서 RNA를 방출합니다.
  2. 자석 랙으로 비드를 분리하고 비드-리보솜-RNA 복합체가 포함된 상청액을 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
  3. 튜브를 3000 x g 에서 2분 동안 원심분리한 다음 상층액을 새 1.5mL 튜브에 피펫팅합니다. 이 튜브에는 TRAP 단계의 "양의 분획"이 포함되어 있습니다.
    참고: 입력 및 음성 분획의 경우 1mL의 추출 버퍼를 사용하여 25μL의 샘플에서 RNA를 추출합니다. 써모믹서(42°C, 500 rpm)에서 30분 동안 배양한다.
  4. RNA 정제 컬럼의 사전 컨디셔닝: 250μL의 컨디셔닝 버퍼를 정제 컬럼에 피펫팅합니다. 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다. 컬럼을 16,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
  5. 피펫 동량의 70% EtOH를 단계 5.3으로부터의 상청액 내로 넣는다(약 50 μL의 70% EtOH 양성 분획 및 1 mL의 70% EtOH 및 1 mL의 70% EtOH 및 음성 분획). 위아래로 피펫팅하여 잘 섞는다.
  6. 혼합물을 5.4단계의 컬럼에 피펫팅합니다.
  7. 컬럼의 멤브레인에 RNA가 결합할 수 있도록 컬럼을 100 x g에서 2분 동안 원심분리한 다음 즉시 16,000 x g 에서 30초 동안 원심분리를 계속합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.
    참고: 입력 및 음수 분획의 경우 매번 250μL의 혼합물을 컬럼에 추가합니다. 모든 혼합물이 사용될 때까지 5.6단계와 5.7단계를 반복합니다.
  8. 컬럼에 100μL의 세척 버퍼 1(W1)을 피펫팅하고 8,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.
  9. 피펫 75 μL의 DNase 용액을 정제 컬럼 멤브레인에 직접 혼합합니다. RT에서 15 분 동안 배양하십시오.
  10. 컬럼에 W1 40μL를 피펫팅하고 8,000 x g 에서 30초 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.
  11. 100 μL의 세척 완충액 2(W2)를 컬럼에 피펫팅하고 8,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.
  12. 100 μL의 W2를 컬럼에 피펫팅하고 16,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다. 동일한 컬럼을 16,000 x g 에서 1분 동안 다시 원심분리하여 용리 단계 전에 세척 버퍼의 모든 흔적을 제거합니다.
  13. 컬럼을 새 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
  14. RNase가 없는 물 12μL를 정제 컬럼의 멤브레인에 직접 피펫팅합니다. 피펫 팁이 멤브레인에 닿지 않아야합니다. RT에서 1 분 동안 배양하고 1000 x g 에서 1 분 동안 원심 분리합니다. 그런 다음 16,000 x g 에서 1분 동안 원심분리를 계속하여 RNA를 용리합니다.

6. RNA 농도 및 품질

  1. 추출된 RNA10의 품질과 양을 평가하기 위해 바이오분석기를 사용한다.

7. 저장 및 추가 분석

  1. 추가 분석(예: 마이크로어레이, 정량적 PCR(qPCR) 및 RNA-seq 등)이 있을 때까지 RNA를 -80°C(최대 1년)에서 저장합니다.
    참고: cDNA 합성을 포함한 qPCR 분석에 대한 자세한 내용은 Lyu et al.11을 참조하십시오. qPCR용 프라이머는 재료표에 나열되어 있습니다.

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결과

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Gli1-CreERT2 마우스 (잭슨 랩 스톡 번호: 007913)를 먼저 NuTRAP 리포터 마우스 (잭슨 랩 스톡 번호: 029899)와 교차시켜 이중 돌연변이 마우스를 생성하였다. 유전자 조작 유전자 대립 유전자 (즉, Gli1-CreERT2 및 NuTRAP)를 모두 보유한 마우스에 하루에 한 번, 격일로 3 회 주사 할 때 타목시펜을 주사 하였다. 조직 샘플은 주사 후 1일째 되는 날인 7일째에 수집하였다. 면역 형광 분석 결과 EGFP는 고환의 간질 세포에서 발현되었습니다 (그림 1). 부신 캡슐은 Gli112,13의 또 다른 세포 집단 양성인 것으로 알려져 있습니다. EGFP는 또한 Gli1-CreERT2...

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토론

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전체 조직 전사체 분석의 유용성은 특히 복잡한 이종 조직을 연구할 때 저해될 수 있습니다. 세포 유형 특이적 RNA를 얻는 방법은 강력한 RNA-seq 기술을 발휘하는 것이 시급한 필요성이 되고 있다. 세포 유형 특이적 RNA의 분리는 일반적으로 미세 조작, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 레이저 포획 미세 해부(LCM)18를 사용한 특정 유형의 세포 수집에 의존합니다. 다른 현대의 고처리량 단일 세포 수집 방법 및 기기도 개발되었습니다(19). 이러한 방법은 일반적으로 미세 유체 기술을 사용하여 단일 세포에 바코드를 적용한 다음 단일 세포 RNA-seq를 바꿉니다. 세포 해리는 부유 세포 용액을 얻는 데 필요한 단계이며, 그런 다음 세포 분류기 또는 미세 유체 장치를 통해 각 세포를 바코드화합니다. 세포 해리 단계는 효소 처리가 조직을 분해할 뿐만 아니라 세포 생존율 및 전사 프로파일에도 영향을 미치기 때문에 세포 유형 특이적 연구를 ...

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 작업은 NIH R00HD082686에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 우리는 HSZ에 내분비 학회 여름 연구 펠로우십에 감사드립니다. 우리는 또한 마우스 식민지를 번식시키고 유지 한 Yuan Kang 박사에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
ActbeurofinsqPCR 프라이머ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (정방향 프라이머/역방향 프라이머)
바이오분석기Agilent2100 바이오분석기 기기
cOmplete Mini EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일밀리포어11836170001
사이클로헥시미드밀리포어239764-100MG
Cyp11a1eurofinsqPCR 프라이머CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer)
dNTPThermo Fisher ScientificR0191
DTT, DithiothreitolThermo Fisher ScientificP2325
DynaMag-2 magnetThermo Fisher Scientific12321D
Falcon tubes 15 mLVWR89039-666
GFP 항체Abcamab290
유리 그라인더 세트DWK Life Sciences357542
heparinBEANTOWN CHEMICAL139975-250MG
em>Hsd3beurofinsqPCR 프라이머GACAGGAGCAGGAGGGTGTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (정방향 프라이머/역방향 프라이머)
KClBiosciencesR005
MgCl2BiosciencesR004
마이크로 원심분리기 튜브 2mLThermo Fisher Scientific02-707-354
마우스 Clariom S 분석 마이크로어레이 ThermoFisher Scientific마이크로어레이 서비스
NP-40Millipore492018-50 Ml
올리고(dT)20Invitrogen18418020
PicoPure RNA 분리 키트Thermo Fisher ScientificKIT0204
단백질 G, DynabeadThermo Fisher Scientific10003D
RNase-free 수생세포NUPW-0500
RNaseOUT 재조합 리보뉴클레아제 억제제Thermo Fisher Scientific
Sox9eurofinsqPCR 프라이머TGAAGAACGGACCAAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (정방향 프라이머/역방향 프라이머,
Superscript IV, 역전사효소Invitrogen18090050
SYBR Green PCR 마스터 믹스Thermo Fisher Scientific
Sycp3eurofinsqPCR 프라이머GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (정방향 프라이머/역방향 프라이머)
트리스알파 AesarJ62848
<, , 10777019, , 4309155

참고문헌

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