이 프로토콜은 NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 세포 유형 특이적 번역 리보솜 mRNA를 분리하는 것을 목표로 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
세포 이질성은 전사체 수준에서 복잡한 조직의 기능을 이해하는 데 어려움을 겪습니다. 세포 유형 특이적 RNA를 사용하면 조직의 이질성으로 인한 잠재적인 위험을 방지하고 강력한 전사체 분석을 가능하게 합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 번역 리보솜 친화성 정제(TRAP) 방법을 사용하여 세포 분류 없이 복잡한 조직에서 소량의 EGFP 발현 세포에서 리보솜 결합 RNA를 분리하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 최근 이용 가능한 NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 세포 유형 특이적 RNA를 분리하는 데 적합하며 EGFP 발현 세포에서 RNA를 분리하는 데에도 사용할 수 있습니다.
서론
RNA 시퀀싱(RNA-seq) 및 마이크로어레이를 포함한 고처리량 접근 방식을 통해 게놈 전체 수준에서 유전자 발현 프로필을 조사할 수 있게 되었습니다. 심장, 뇌 및 고환과 같은 복잡한 조직의 경우 세포 유형 특이적 데이터는 전체 조직 1,2,3의 RNA 사용을 비교하는 더 자세한 정보를 제공합니다. 세포 이질성의 영향을 극복하기 위해, 번역 리보솜 친화성 정제(TRAP) 방법은 2010년대 초부터 개발되어 왔다4. TRAP는 조직 해리없이 특정 세포 유형에서 리보솜 결합 RNA를 분리 할 수 있습니다. 이 방법은 초파리 배아5에서 극히 드문 근육 세포 집단을 표적으로 삼고, 모델 식물 Arabidopsis thaliana6에서 다른 뿌리 세포를 연구하고, 포유류7에서 내피 세포의 전사체 분석을 수행하는 것을 포함하여 다양한 유기체에서 트랜스플라톰(번역을 위해 리보솜에 모집되는 mRNA) 분석에 사용되었습니다.
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프로토콜
수행 된 모든 동물 실험은 Auburn University의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에서 승인 한 프로토콜을 따랐습니다.
참고: 다음 프로토콜은 Gli1-CreERT2의 P28에서 하나의 고환(약 100mg)을 사용합니다. NuTRAP 마우스 (무스 근육). 시약의 부피는 샘플 유형과 조직 수에 따라 조정해야 할 수도 있습니다.
1. 조직 수집
- CO2 챔버를 사용하여 마우스를 안락사시키고, 복부 표면을 70% 에탄올로 살균한다.
- 가위로 하복부를 열고 고환을 제거하십시오. 액체 질소 (LN2)를 사용하여 고환을 즉시 스냅 동결하십시오.
- 사용할 때까지 LN2 의 증기상에 샘플을 보관하십시오.
2. 시약 및 비드 준비
- 균질화 원액 준비: 50 mM 트리스(pH 7.4), 12 mMMgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40 및 1 mg/mL 헤파린을 추가합....
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결과
Gli1-CreERT2 마우스 (잭슨 랩 스톡 번호: 007913)를 먼저 NuTRAP 리포터 마우스 (잭슨 랩 스톡 번호: 029899)와 교차시켜 이중 돌연변이 마우스를 생성하였다. 유전자 조작 유전자 대립 유전자 (즉, Gli1-CreERT2 및 NuTRAP)를 모두 보유한 마우스에 하루에 한 번, 격일로 3 회 주사 할 때 타목시펜을 주사 하였다. 조직 샘플은 주사 후 1일째 되는 날인 7일째에 수집하였다. 면역 형광 분석 결과 EGFP는 고환의 간질 세포에서 발현되었습니다 (그림 1). 부신 캡슐은 Gli112,13의 또 다른 세포 집단 양성인 것으로 알려져 있습니다. EGFP는 또한 Gli1-CreERT2.......
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토론
전체 조직 전사체 분석의 유용성은 특히 복잡한 이종 조직을 연구할 때 저해될 수 있습니다. 세포 유형 특이적 RNA를 얻는 방법은 강력한 RNA-seq 기술을 발휘하는 것이 시급한 필요성이 되고 있다. 세포 유형 특이적 RNA의 분리는 일반적으로 미세 조작, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 레이저 포획 미세 해부(LCM)18를 사용한 특정 유형의 세포 수집에 의존합니다. 다른 현대의 고처리량 단일 세포 수집 방법 및 기기도 개발되었습니다(19). 이러한 방법은 일반적으로 미세 유체 기술을 사용하여 단일 세포에 바코드를 적용한 다음 단일 세포 RNA-seq를 바꿉니다. 세포 해리는 부유 세포 용액을 얻는 데 필요한 단계이며, 그런 다음 세포 분류기 또는 미세 유체 장치를 통해 각 세포를 바코드화합니다. 세포 해리 단계는 효소 처리가 조직을 분해할 뿐만 아니라 세포 생존율 및 전사 프로파일에도 영향을 미치기 때문에 세포 유형 특이적 연구를 .......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 NIH R00HD082686에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 우리는 HSZ에 내분비 학회 여름 연구 펠로우십에 감사드립니다. 우리는 또한 마우스 식민지를 번식시키고 유지 한 Yuan Kang 박사에게 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Actb | eurofins | qPCR 프라이머 | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (정방향 프라이머/역방향 프라이머) |
| 바이오분석기 | Agilent | 2100 바이오분석기 기기 | |
| cOmplete Mini EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일 | 밀리포어 | 11836170001 | |
| 사이클로헥시미드 | 밀리포어 | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR 프라이머 | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP 항체 | Abcam | ab290 | |
| 유리 그라인더 세트 | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| em>Hsd3b | eurofins | qPCR 프라이머 | GACAGGAGCAGGAGGGTGTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (정방향 프라이머/역방향 프라이머) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브 2mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| 마우스 Clariom S 분석 마이크로어레이 Thermo | Fisher Scientific | 마이크로어레이 서비스 | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| 올리고(dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA 분리 키트 | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| 단백질 G, Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free 수생 | 세포 | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT 재조합 리보뉴클레아제 억제제 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sox9 | eurofins | qPCR 프라이머 | TGAAGAACGGACCAAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (정방향 프라이머/역방향 프라이머, |
| Superscript IV, 역전사효소 | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR 마스터 믹스 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sycp3 | eurofins | qPCR 프라이머 | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (정방향 프라이머/역방향 프라이머) |
| 트리스 | 알파 Aesar | J62848 |
참고문헌
- Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
- Soumillon, M., et al.
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