DNA 단백질 상호 작용을 연구하는 CD 분광법

요약

DNA 리간드를 이용한 ATP 의존형 크로마틴 리모델링기의 상호 작용은 CD 분광법을 사용하여 설명된다. 생성된 봉우리에 의해 분석된 유전자 프로모터에 대한 유도된 변형 변화는 전사 조절의 메커니즘을 이해하는 데 사용될 수 있다.

초록

원형 이색성 (CD) 분광법은 생체 분자의 이차 구조 및 상호 작용을 조사하는 간단하고 편리한 방법입니다. CD 분광기의 최근 발전은 생체 내 전사 조절에 대한 이해를 위해 다양한 미세 환경에서 DNA 단백질 상호 작용 및 변형 역학에 대한 연구를 가능하게 했습니다. 잠재적인 전사 영역 주위 영역이 전사가 발생하기 위해 풀려나야 합니다. 이것은 히스톤 수정, DNA에 전사 인자의 결합 및 기타 크로마틴 리모델링 활동의 조정을 요구하는 복잡한 과정입니다. CD 분광학을 사용하여 ATP 의존 성 크로마틴 리모델링기와 같은 규제 단백질에 의한 프로모터 영역의 형성 적 변화를 연구하여 전사를 촉진할 수 있습니다. 단백질에서 발생하는 형성 적 변화는 또한 모니터링 될 수있다. 또한, 표적 DNA를 향한 단백질의 친화성 및 서열 특이성에 관한 질의는 표적 DNA에 돌연변이를 통합하여 해결할 수 있다. 요컨대, 이 민감하고 저렴한 방법의 고유 한 이해는 크로마틴 역학의 변화를 예측하여 전사 조절의 이해를 향상시킬 수 있습니다.

서론

원형 이색성(CD)은 오른손잡이와 왼손잡이 원형 편광광의 차동 흡수로 이어지는 생물학적 거대 분자의 고유치랄성에 의존하는 분광 기술입니다. 이 차동 흡수는 원형 이분해증으로 알려져 있습니다. 따라서 이 기술은 단백질 및 DNA와 같은 생물학적 거대 분자의 형성을 묘사하는 데 사용될 수 있으며, 둘 다 키^{랄 센터를 포함1,2}.

전자파에는 전기 및 자기 구성 요소가 모두 포함되어 있습니다. 전기및 자기장은 모두 파도 전파 방향에 수직으로 진동합니다. 편광되지 않은 빛의 경우, 이 필드는 여러 방향으로 진동합니다. 빛이 원형으로 편광되면 두 개의 전자기장이 서로 90° 위상 차이로 얻어집니다. 키랄 분자는 원형 광학 회전(birefringence)을 보여 주어 오른손잡이 원형 편광광과 왼손잡이 원형 편광광을 다른 범위3로 ^{흡수합니다.} 결과 전기장은 파장의 함수인 타원으로 추적됩니다. 따라서 CD 스펙트럼은 타원형(q)으로 기록되며, 데이터는 파장의 함수로서 평균 잔류물 타원형으로 제시된다.

단백질의 경우, 아미노산의 Cα(글리신 제외)는 치랄이며, 이는....

프로토콜

1. 반응 성분의 작동 농도

1. CD 및 기타 반응 구성 요소에 대한 버퍼의 작업 농도를 신선하게 준비( 표 1 참조)하고 반응을 설정하기 전에 4°C에서 유지합니다.
   참고: 본 논문에 기재된 CD 반응의 경우, 성분의 작동 농도는 다음과 같습니다: 나트륨 인산염 버퍼(pH 7.0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, 단백질 1 μM, _MgCl2 10mMM, EDTA 50mM, ADAADiN 5 μM.

2. ATPase 활동

1. CD 분광법 이전에, CD 분광법에 사용되는 단백질이 활성화되어 있는지 확인하고 ATP 가수 분해를 유도하는 데 최적으로 효과적인 DNA 분자를 식별하기 위해 DNA 분자의 존재에서 단백질의 ATPase 활성을 확립한다.
2. 다음 두 반응으로 구성된 NADH 결합 산화 분석체에 의해 다른 DNA 분자의 존재에서 단백질의 ATPase 활성을 측정한다.
   1. 0.1 μM ADAAD, 2mM ATP, 10nM DNA 및 1x REG 버퍼를 96웰 플레이트에 혼합하여 250 μL의 최종 부피로 혼합합니다.
      참고: 피루바테 키나제 ....

결과

ADAAD는 MYC 프로모터의 구조와 같은 줄기 루프를 안정화시합니다.
이전 실험 증거는 SMARCAL1MYC29의 부정적인 레귤레이터는 것으로 나타났습니다. QGRS 매퍼에 의한 MYC 유전자의 159bp 장기 프로모터 영역을 분석한 결과, 전방 가닥이 G-쿼드러플렉스(표 2)를 형성할 수 있는 잠재력을 가지고 있음을 보여주었다. Mfold는 MYC DNA의 두 가닥이 줄기 루프와 같은 구조를 형성 할 수 있음을 보여 주었다 (표 2). G-쿼드러플렉스(_GECE)를 포함하는 34bp 긴 DNA 서열을 합성하였다. GECE 올리고뉴클레오티드의 전방 및 역시퀀스의 Mfold 구조는

토론

이 문서의 목적은 ATP 의존 염색질 리모델링 단백질의 존재에 DNA에서 발생하는 형성 변화를 연구하고 유전자 발현에 이러한 형태 변화를 연결하는 접근법으로 CD 분광법을 도입하는 것입니다. CD 분광법은 DNA의 형성 변화를 연구하는 빠르고 쉽게 접근 할 수있는 방법을 제공합니다.

이 기술에 대 한 고려 될 중요 한 포인트는 DNA와 단백질의 순도. DNA와 단백질이 모두 >95% 순수하다는 것을 확인하는 것이 좋습니다. 페이지 정제 된 올리고뉴클레오티드는 분석에서 사용되어야하며, 단백질은 바람직하게는 친화성 -정제되어야>95% 순도. 다른 중요한 매개 변수는 기준선 판독값이 1 mdeg를 초과하지 않도록 큐벳을 깨끗하게 해야한다는 것입니다. 버퍼는 오토클레이브 된 물을 사용하여 이루어져야하며 버퍼의 기준선 판독값이 1 mdeg를 초과해서는 안됩니다. 프로모터의 형성을 연구하기 위해서는 단백질이 결합되는 영역을 식별하는 것이 필수적입니다. 따라서, 이 과정이 단백.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2-메르캅토에탄올	Fisher scientific	O3446I-100
아데노신 5&프라임;-트리포스페이트 디소듐 염 수화물	시그마알드리치	A2383
CD 석영 큐벳	STARNA	21-Q-1
Chirascan V100 CD 분광계	응용 광물리학	사용할 수
EDTA 디소듐 염 이수화물	SRL	43272
글루타티온 세파로스 4B	GE 헬스케어	17-0756-01	글루타티온 친화성 크로마토그래
Hellmanex III 세척 용액	Hellma	9-307-011-4-507
L-락틱 탈수소효소	Sigmaaldrich	L2625
마그네슘 아세테이트 테트라하이드레이트	Fisher scientific	BP215-500
마그네슘 클로라이드 헥사하이드레이트	Fisher Scientific	M33-500
NADH 디소듐 염	시그마알드리치	10107735001
포스포에노피루베이트 모노시클로헥실암모늄 염	SRL	40083
칼륨 아세테이	Fisher scientific	P178-3
피루브산 키나아제	시그마알드리치	P1506
인산나트륨 이염기성 무수	Fisher scientific	S374-500
인산나트륨 일염기성 일수화물	Fisher scientific	S369-500
Synergy HT 마이크로플레이트 리더	BioTek	사용할 수
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500

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