Ex Vivo 마우스의 포털 정맥을 통한 간 관류

요약

이 프로토콜은 포털 정맥 관류를 통한 대사 연구를 위해 손상되지 않은 마우스 간을 절제하는 간단한 방법을 설명합니다.

초록

당뇨병, 전당뇨병, 비알콜성 지방간 질환(NAFLD) 및 비알콜성 지방간염(NASH)과 같은 대사성 질환이 점점 더 흔해지고 있습니다. 생체외 간 관류는 엄격하게 조절될 수 있는 영양 조건에서 핵 자기 공명(NMR)을 사용하여 간 대사를 종합적으로 분석할 수 있게 해줍니다. 실리코 시뮬레이션에서와 마찬가지로 호르몬 작용과 제약 개입의 효과를 평가하는 주로 이론적 인 수단으로 남아 있기 때문에 관류 된 간은 간 대사를 이해하기위한 가장 가치있는 테스트 베드 중 하나입니다. 이 연구들이 간 생리학에 대한 기본적인 통찰력을 안내하기 때문에 결과는 정확하고 재현 가능해야합니다. 생체외 간 관류의 재현성의 가장 큰 요인은 수술의 질이다. 따라서, 우리는 현장 NMR 실험의 맥락에서 생체외 마우스 간 관류를 수행하기 위해 조직적이고 간소화 된 방법을 도입했습니다. 우리는 또한 독특한 응용 프로그램을 설명하고 이러한 연구에서 직면 한 일반적인 문제에 대해 논의합니다. 전반적인 목적은 현장 NMR 실험의 맥락에서 간 절제술 및 관류에서 재현 가능한 결과를 얻기위한 황금 표준으로 간주되는 몇 년 동안 정제 한 기술에 대한 복잡하지 않은 가이드를 제공하는 것입니다. 자석에 대한 필드 중심까지의 거리뿐만 아니라 NMR 실험 중에 개입 할 수있는 조직의 접근성이 없기 때문에 우리의 방법은 새로운 방법입니다.

서론

생체 외 관류는 간 대사 연구에서 매우 중요하며, 포털 정맥을 통한 관류는 이러한 연구의 표준입니다. 간 대사를 개별적으로 연구하기 위해서는 다른 장기의 신진 대사 (즉, 전신 대사)로 인한 합병증을 피하고 호르몬 가용성 (인슐린, 글루카곤 등)을 조절하기 위해 간을 신체에서 절제해야합니다. 이 접근법은 당뇨병, NAFLD 및 NASH와 같은 질병이 간 대사에 미치는 영향뿐만 아니라 약물 작용 메커니즘을 이해하는 데 필수적 일 수 있습니다. 이 기사는 간 절제술과 관류에 대한 가이드 역할을합니다. 우리는 충분한 엄격함과 재현성으로 이러한 대사 간 연구를 수행하기위한 간소화 된 절차를 개발했습니다. 수술이 올바르게 수행되지 않으면 얻은 대사 데이터에 뚜렷한 변동성이 있습니다. 우리는 문헌 1,2,3,4,5에 기재된 바와 같이, 핵 자기 공명 (NMR) 분광계에서 계내에서 대사 연구의 맥락에서 문맥 정맥 카테터 삽입 및 간 절제술을 수행하는 조직화 된 방법을 기술한다.

프로토콜

마우스와 관련된 실험은 플로리다 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 번호 #201909320)에 따라 처리되었습니다. 사용된 마우스 균주는 C57BL/6J; 모든 마우스는 수컷이었다. 이 방법은 일반적으로 다른 표준 마우스 균주를 사용한 연구에도 적용 가능하다. 이 수술은 함께 일하는 두 사람이 최적으로 수행합니다.

1. 초기 설정

1. Krebs-Henseleit 전해질 6(25 mM NaHCO3, 112 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 각각 1.2 mM MgSO4, KH2PO4 및 0.5 mM 나트륨-EDTA, _1.25mM CaCl2_), ⁶ mM 젖산나트륨, 0.6 mM 피루베이트 나트륨, 0.2 mM [U-13 C]프로피오네이트_나트륨, ¹⁰%(v/v)_D2O, 및 0.63 mM 혼합 지방산 (팔미트산 (전체의 22.1 %), 팔미톨레산 (5.2 %), 스테아르 산 (2.7 %), 올레산 (27 %), 리놀레산 (37.7 %), γ-리놀렌산 (2.4 %), 데코사헥사노산 (2.8 %)과 소 혈청 알부민 ....

결과

간 기능은 주로 산소 소비와 유속으로 평가됩니다. 4-8 mL/min의 유속과 1 μmol/min.g의 산소 소비가 전형적이다. 이러한 측정은 특정 실험 조건 및 생물학적 차이에 따라 달라질 수 있습니다.

사용되는 이소플루란의 정확한 양은 사용되는 마취 시스템의 유형뿐만 아니라 마우스의 환경 및 연령 / 체중에 따라 다릅니다. 수술 동안, 이소플루란 및 전달 가스는 변하지 않지만, 수술 영역의 특정(예를 들어, 배경 소음)¹⁰에 따라 약간의 변화가 필요할 수 있다. 헤파린을 피하 깊숙이 주사하면 작용의 시작이 최대 20-40 분까지 지연 될 수 있습니다. 헤파린 투여 후 10 분의 대기 기간은 행동¹⁶의 시작을 보장합니다. 리도카인은 2분 동안 행동⁽¹¹)이 시작된다.

카테터를 삽입 할 때 베벨을 위로 .......

토론

이 수술 절차는 도전적이며 재현 가능한 결과를 얻기 위해 광범위한 연습이 필요합니다. 이소플루란과 캐리어 가스는 가능한 한 많은 수술 절차를 통해 동물의 생존력을 유지하기 위해 필요에 따라 조정되어야합니다. 환경, 시간, 나이, 체중 및 기타 여러 요인이 마취에 영향을 미칩니다. 체중,식이 요법, 생쥐의 긴장 및 나이는 지방 축적이 포털 정맥을 시각화하는 것을 방해 할 수 있으므로 수술에 영향을 줄 수 있습니다. 발을 아래로 젖힐 때는 목에 질식을 초래할 수있는 부담을주지 않도록주의해야합니다. 더욱이, 마우스가 더 뚱뚱할수록 봉합사가 더 단단해질수록 지질에 의해 유도되는 카테터와 정맥 사이의 마찰 계수 감소를 상쇄하기 위해 카테터 주위가 될 필요가 있을 것이다. 헤파린에 대한 작용 시간의 시작은 이소플루란에 대한 과도한 노출이 장기¹⁷에서 유물을 생성하기 때문에 필수적입니다. 헤파린 및 리도카인 주사의 투여는 19.05mm 길이의 23G 바늘이 필요하므로 주사 중 내부 장기에 외상이 발.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1 mL Luer-Lock 일회용 멸균 일회용 주사기	N/A	/	A 비특정 브랜드
100 cm 워터 재킷 유리 컬럼	N/A	N/	A 맞춤 제작
2-0 실크 봉합사	Braintree Scientific	N/A
22 게이지 캐서터 1 in. 안전 없이	Terumo	SRFF2225
23G 0.75인치 하이포데메릭 니들	엑셀 인터내셔널	26407
27 G 1.5 인치. 하이포데메릭 니들	엑셀 인터내셔널	26426
4x4 인치. 수술 플랫폼	N/A	/A	맞춤형
70% 알코올 와이프	N/A	N/A	비특정 브랜드
순환 수조	MS Lauda	N/A	모델은 더 이상
코튼 팁 어플리케이터	N/A	/	A 비특정 브랜드
섬세한 작동 가위; 곧장; 날카롭고 날카로운; 30mm 블레이드 길이; 4 3/4 "	Roboz	RS-6702
Dumont #5/45 펜치	파인 사이언티픽 도구	11251-35
Dumont #7 - 파인 펜치	파인 사이언티픽 도구	11274-20
지혈제	파인 사이언티픽 도구	13015-14
헤파린 나트륨 주사 가능 1000 units/mL	RX Generics	71288-0402-02
이소플루란	Patterson 수의학	14043-0704-06
리도카인 HCl 2%	VEDCO Inc.	50989-0417-12
멤브레인 박층 산소 공급기	Radnoti	N / A
Metzenbaum 가위; 곡선; 무딘; 27mm 블레이드 길이; 5 "	Roboz	RS-6013
산소 측정기 시스템	Hanstech Instruments Ltd.	N/A
식염수 0.9% 용액	N/A	N/A	식염수는 실험실에서 제조됩니다
.	N/A	N/A	비특정 브랜드
가변 속도 아날로그 콘솔 펌프 시스템	Cole Palmer	N/A	모델은 응용 프로그램별로 맞춤형입니다
계량 보트	N/A	N/A	비특정 브랜드

N N를 제조하지 않습니다 N 규모