이 프로토콜은 모기에서 타액선 포자석을 검출하기 위한 샌드위치 효소 결합 면역 흡착 분석을 설명합니다. 쉽게 구할 수 있는 단클론 항체를 사용하는 이 방법은 Plasmodium falciparum 또는 Plasmodium vivax를 운반하는 모기를 비용 효율적으로 고처리량으로 검출할 수 있습니다. 이 방법은 매개체 조사를 포함한 말라리아 전염 연구에 적합합니다.
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방법 논문
효소 결합 면역 흡착 분석을 사용한 Anopheles 모기의 Plasmodium sporozoites 검출
이 논문에서
요약
초록
Plasmodium sporozoites는 인간을 감염시키는 말라리아 기생충의 감염 단계입니다. 암컷 Anopheles 모기의 타액선에 서식하는 sporozoites는 피를 먹는 동안 모기에 물려 인간에게 전염됩니다. 따라서 모기 타액선에 sporozoites가 존재하면 모기 전염성이 정의됩니다. 아노펠레스 모기가 Plasmodium sporozoites를 가지고 있는지 여부를 결정하기 위해 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)은 포자동물의 주요 표면 단백질인 Plasmodium circumsporozoite 단백질(CSP)을 검출하는 표준 도구였습니다. 이 방법에서는 각 모기의 흉부와 함께 머리를 복부에서 분리하고 균질화한 다음 샌드위치 ELISA를 투여하여 Plasmodium falciparum 에 특이적인 CSP와 Plasmodium vivax의 두 가지 아형인 VK210 및 VK247 각각의 존재를 감지합니다. 이 방법은 모기 감염의 계절적 역학과 연구 현장의 주요 말라리아 매개체 종을 포함하여 말라리아 전염을 연구하는 데 사용되었습니다.
서론
Plasmodium sporozoites는 모기에 있는 말라리아 기생충의 전염 단계입니다. sporozoites는 모기에 물린 것을 통해 인간에게 전달됩니다. 모기에서 sporozoites는 먼저 midgut 벽의 난포 낭종 내부에 형성됩니다. 준비가 되면 모기로 방출되어 모기 침샘으로 이동합니다. 그곳에서 그들은 성숙하고 혈액 수유 중에 인간에게 전염될 준비가 됩니다. 인간에서는, sporozoites는 진피에서 침착됩니다. 그런 다음 혈관으로 들어가 혈액 순환을 따라 이동하여 간에 도달하여 간세포 1,2에 감염을 일으킵니다.
모기 침샘의 sporozoite 감염을 결정하기 위해 세 가지 다른 방법이 사용되었습니다. 첫 번째 방법은 타액선을 절개한 후 광학 현미경으로 sporozoites를 직접 검사하는 것입니다. 이 방법은 Anopheles 모기 침샘에서 sporozoites를 검출하고 정량화하는 황금 표준입니다3. 그러나 해부와 현미경 검사 모두에 대해 잘 훈련된 기술자가 필요합니다. 또한 Plasmodium 종 및 CSP 서브 타이핑 (
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프로토콜
1. 시약의 준비
알림: 이 프로토콜에 사용된 장비, 시약 및 기타 소모품 목록은 Table of Materials 를 참조하고 용액 목록 및 그 구성은 Table 1 을 참조하십시오.
- 포획 및 과산화효소 접합 mAb
- mAb를 재구성하려면 동결건조된 mAb를 0.5mg/mL의 증류수:글리세롤의 1:1 혼합물에 재현탁시킵니다. 반복적인 동결-해동을 피하기 위해 필요에 따라 부분 표본을 만들고 -20 °C에서 보관하십시오.
- 차단 버퍼(BB)
- 0.1N NaOH 100mL에 ELISA 등급 카제인 5g을 용해시켜 차단 완충액을 준비합니다. 900mL의 인산염 완충 식염수(PBS)( 표 1 참조)를 추가하여 최종 부피를 1.0L로 만듭니다.
- 지시약으로 페놀 레드 0.02g을 추가하고 HCl을 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다. BB를 4°C에서 최대 1주일 동안 보관하거나 -20°C에서 장기 보관하기 위해 50mL에 분주하여 보관합니다.
- 포지티브 컨트롤
- 양성 대조군을 재구성하려면....
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결과
대표적인 ELISA 결과는 그림 2에 나와 있습니다. 이 실험에서 P. falciparum ELISA는 우물 A7에서 sporozoite 감염을 감지했습니다. 포지티브 웰은 희미한 녹색으로 시각적으로 감지할 수 있습니다(그림 2A). 이 웰의 흡광도 값은 차단 임계값(4개의 음성 대조군 웰 평균값의 2배)보다 높았습니다(그림 2B). 알려지지 않은 80개의 모든 웰의 흡광도 값의 분포는 그림 2C에 표시되어 있습니다. 배경(음성 대조군) 빼기 후 플레이트 내 표준 곡선에 의한 웰 A7의 CSP 정량화는 0.35pg/μL의 CSP 농도를 제안합니다(그림 2D). VK210 및 VK247에 대한 P. vivax 분석은 모두 이 샘플 세트.......
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토론
CSP-ELISA는 Plasmodium CSP를 검출하는 매우 구체적이고 비용 효율적인 방법을 제공합니다. P. falciparum 및 P. vivax sporozoites 간의 구별뿐만 아니라 P vivax 11,13,14,15의 두 가지 아형 VK210 및 VK247 간의 구별을 허용합니다. 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 얻기 위해 특정 임계점을 고려해야 합니다. 모든 용액은 미생물 성장을 방지하기 위해 냉장고에 1주일 미만으로 보관해야 합니다. mAb는 50% 글리세롤을 함유한 희석제에 보관해야 하며 다중 동결-해동을 방지하기 위해 필요에 따라 분주해야 합니다. 포지티브 컨트롤은 일회용으로 분주해야 합니다. ELISA 플레이트는.......
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공개 사항
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
교육과 지도를 해주신 Mr. Kirakorn Kiatibutr, MVRU에게 감사드립니다. 또한 그림 2를 준비하는 데 기술적인 도움을 준 MVRU의 Mrs. Pinyapat Kongngen에게도 감사를 표합니다. 이 연구는 미국 국립알레르기·전염병연구소(National Institute for Allergy and Infectious Diseases)와 국립보건원(National Institute of Health, U19 AI089672)의 보조금으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| ELISA 플레이트 리더 | BioTek Instrument, Inc. | Synergy H1 | 흡광도는 UV-VIS 흡광도 검출 모드를 사용하여 측정합니다 |
| . 그라인더 유봉 | Axygen | PES-15-B-SI | 모기 머리/흉부 |
| <강>시약 | |||
| ABTS 기판 균 | KPL | 50-62-00 | 과산화효소 구동 검출용 |
| 차단 버퍼(BB) | 참고: 용액 | ||
| 포획 및 과산화효소 접합 단클론 항체(mAb | )참고: mAb는 BEI Resources(https://www.beiresources.org)의 Sporozoite ELISA 시약 키트(P. falciparum의 경우 MRA-890 및 P. vivax의 경우 MRA-1028K)의 일부로 동결건조된 형태로 얻을 수 있습니다. | ||
| 카제인 | 시그마 알드리치 | 9000-71-9 | 차단 완충액 준비용 |
| 분쇄 버퍼(GB) | 참고: | ||
| 용액 Igepal CA-630 | Sigma aldrich | 9002-93-1 | 분쇄 완충액 준비용 |
| KCl | 시그마 알드리치 | 7447-40-7 | 인산염 완충액 식염수 준비용 |
| KH2PO4 | Sigma aldrich | 7778-77-0 | 인산염 완충액 식염수 제제 |
| Na2HPO4 | Sigma aldrich | 7558-79-4 | 인산염 완충액 식염수 제제 |
| 용 NaCl | aldrich | 7647-14-5 | 인산염 완충액 식염수 제제 |
| NaOH | Sigma aldrich | 1310-73-2 | 차단 완충액 제제용 |
| PBS-Tween | |||
| Pf capture mAb, | CDC | Pf-CAP | Pf circumsporozoite 단백질 |
| Pf peroxidase mAb | CDC | Pf-HRP | Pf circumsporozoite 단백질 검출 |
| Pf 양성 대조군 | CDC | Pf-PC | Pf 양성 대조군 |
| Phenol red | Sigma aldrich | 143-74-8 | 완충액 제제 차단용 |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | 참고: 용액 | ||
| 양성 대조군 | 참고: 용액 | ||
| Pv210 capture mAb | CDC | Pv210-CAP | Pv210 circumsporozoite 단백질 |
| Pv210 peroxidase mAb | CDC | Pv210-HRP | Pv210 circumsporozoite 단백질 |
| Pv210 양성 대조군 | CDC | Pv210-PC 검출용 | Pv210 양성 대조군 |
| Pv247 capture mAb | CDC | Pv247-CAP | Pv247 circumsporozoite 단백질 |
| Pv247 peroxidase mAb | CDC | Pv247-HRP | Pv247 circumsporozoite 단백질 |
| Pv247 양성 대조군 | CDC | Pv247-PC | Pv247 양성 대조군 |
| Tween20 | Sigma aldrich | 9005-64-5 | PBS-Tween 제제용 |
| Consumables | |||
| Disposable 피펫팅 reservoirs | 일반 | 작업 시약용 | |
| ELISA 플레이트: 96 웰 클리어 라운드 바닥 PVS | Corning Life Science | 2797 | ELISA |
| 장갑: 일회용 장갑 및 냉동고 장갑 | 일반 | 개인 보호용 | |
| 실험실 가운 | 일반 | 개인 보호용 | |
| 멀티채널 피펫 P30-300 | 일반 | 용액 이송용 | |
| 피펫 세트, P2, P20, P200 및 P1000 | 일반 | 용액 이송용 | |
| 피펫 팁 10 µ L, 200 &마이크로; L 및 1000 µ L | Generic | 용액 전달용 | |
| 혈청학적 피펫 5 mL, 10 mL | 일반 | 용액 이동용 | |
| Transfer pipettes | 일반 | 용액 전달용 |
참고문헌
- Bray, R. S., Garnham, P. C. The life-cycle of primate malaria parasites. British Medical Bulletin. 38 (2), 117-122 (1982).
- Held, J. R. Primate malaria. Annals of the New York Academy of Sciences. 162 (1), 587-593 (1969).
- World Health Organization.
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재인쇄 및 허가
