안구 내 치료 부형제 및 의약품의 독성을 평가하기 위한 장기 배양 시스템

요약

이 프로토콜의 목표는 실험적 치료에 대한 반응으로 수정체의 대사 활동과 굴절 기능의 변화를 평가하는 것입니다.

초록

실명의 주요 원인인 백내장은 전 세계적으로 이 질환으로 고통받는 수천만 명의 사람들에게 큰 부담이 되고 있습니다. 다른 환경적 요인 중에서도 화학 물질 노출은 백내장의 확립된 원인입니다. 안구 독성 검사는 의약품 및 그 성분이 백내장을 유발하거나 백내장 치료를 도울 수 있는 렌즈 손상에 기여할 수 있는지 여부를 평가할 수 있습니다.

시험관 내 연구 및 생체 내 동물 실험은 임상 연구 전에 화학 물질의 안전성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 안구 독성 및 자극성 테스트에 대한 현재 생체 내 표준인 Draize 테스트는 안구 독성을 결정하기 위한 민감도와 객관적인 측정이 부족하다는 비판을 받았습니다. in vitro 세포 기반 분석은 세포 배양이 온전한 기능성 수정체를 적절하게 모델링할 수 없기 때문에 제한적입니다.

여기에 설명된 방법은 동물 실험에 대한 민감한 체외 대안으로, 세포 활성 수준과 전반적인 굴절 성능 모두에서 치료에 대한 온전한 소 수정체의 반응을 평가하도록 설계되었습니다. 무독성 시약인 레사주린은 세포 활성 수준에 비례하여 대사됩니다. 렌즈 레이저 스캐너 분석은 렌즈가 입사광을 최소한의 오류로 단일 지점으로 굴절시키는 능력을 측정하며, 이는 렌즈의 자연적인 기능과 직접적인 관련이 있습니다. 이 방법은 렌즈의 급성 및 지연성 변화뿐만 아니라 화학적 또는 환경적 노출로부터 렌즈의 회복을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

2,000만 명 이상의 사람들에게 영향을 미치는 백내장은 전 세계적으로 가장 흔한 실명 원인입니다 ^1,2. 백내장은 노화와 관련된 수정체의 변화로 인해 가장 흔하게 발생하지만 외상, 유전적 상태, 질병 또는 독성 노출로 인해 유발되기도 합니다². 현재 치료에는 수정체를 교체하기 위한 외과적 개입이 포함되며, 이는 주로 선진국 사람들이 이용할 수 있는 비용이 많이 들고 침습적인 절차입니다. 백내장으로 인한 광범위한 부담으로 인해 수십 년에 걸친 연구는 백내장 예방과 비수술적 치료법 개발을 위한 방향으로 이어졌습니다. 두 경우 모두 안과 약물의 독성, 효능 및 약동학에 대한 전임상 검사의 중요성이 가장 중요합니다. 이러한 약물 개발 과정은 동물을 대상으로 수행된 연구에서 제공하는 정보에 크게 의존합니다.

생체 내 안구 독성 검사에 대한 현재 표준은 살아있는 동물의 결막낭에 시험 화합물을 전달하는 것과 관련된 Draize 검사입니다. 이 테스트는 특히 동물 윤리, 주관성, 낮은 반복성 및 가변성과 관련하여 상당한 비판을 받았습....

프로토콜

모든 실험 프로토콜은 동물 조직을 사용한 연구에 대한 워털루 대학교 윤리 정책에 따라 수행되었습니다. 이번 연구를 위한 소의 눈은 도살장에서 제공되었고, 죽은 지 몇 시간 이내에 젖소가 아닌 젖소에서 얻었으며, 눈을 채취하는 데 최대 8시간이 걸리는 과정인 즉시 해부되었습니다. 무균 상태와 해부 품질을 유지하기 위해 눈을 즉시 절개해야 합니다. 배양 배지는 pH 7.4로 제조되고 FBS²¹을 보충하기 전에 멸균 여과됩니다. 모든 절차는 멸균 상태에서 수행되며, 재료 및 장비 소스 는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 소 렌즈 문화

1. 공막에서 안구 외 근육과 조직을 제거하고, 지구의 뒤쪽 절반과 유리체를 제거하고, 수정체와 함께 홍채와 섬모체를 제거한 다음, 수정체가 매체로 채워진 배양실로 떨어지도록 최종 절단을 배치하여 구역 부착물을 잘라냅니다.
2. 37°C 및 5% CO₂에서 21mL의 멸균 여과 매체를 사용하여 레이저 스캐닝 시스템에 맞게 조정된 베이스를 사용하여 절개된 렌즈를 맞춤형 챔버에서 배양합니다. 1% 페니실린-스....

결과

그림 2 와 그림 3 (n = 6)은 소 수정체에 대한 화학적 처리(라노스테롤)의 효과를 테스트한 연구 결과를 보여줍니다. 라노스테롤(Lanosterol)은 수정체에서 자연적으로 발생하는 스테롤로, 한때 백내장에 대한 잠재적인 약물 개입으로 유망한 결과를 보였으나²⁵ 아직 입증되지는 않았지만²⁶. 연구 설계에는 화합물에 대한 매체 및 차량 제어가 포함되었습니다. 비히클(2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린)과 중간 대조군(p > 0.05) 사이에는 유의한 차이가 없었으며, 이는 실험군의 잠재적 효과가 비히클에 기인하지 않을 가능성이 있음을 나타냅니다. 치료군과 대조군 간에 BVD 변동성에는 유의한 차이가 없었다(p > 0.05). 이러한 결과는 대사 활성 분석법과 일치했습니다(그림 3

토론

이 프로토콜의 목적은 1차 조직 배양에서 수정체에 대한 화학 물질 또는 환경 노출의 영향을 직접 평가하는 것입니다. 먼저, 렌즈를 해부하고 스캔하여 광학 품질을 확인합니다. 오염을 방지하고 해부 품질을 보장하는 것은 매우 중요합니다. 렌즈는 대조군 또는 노출 전 상태와 관련된 굴절 기능의 변화를 지속적으로 모니터링하기 위해 주기적으로 스캔됩니다. 대사 활성 분석은 노출이 세포 대사에 영향을 미쳤는지 여부를 결정하기 위한 종점을 나타냅니다. 이는 생체이물 물질이나 환경 조건이 심각한 독성을 유발하여 잠재적으로 백내장을 유발할 수 있는지, 그리고 수정체가 이 치료로 회복될 수 있는지 여부를 결정하기 위한 중요한 단계입니다.

렌즈는 각각의 배양실 내에서 광학 품질을 위해 스캔됩니다. 렌즈는 챔버 내의 테스트 물질에 노출될 수도 있지만, 이 프로토콜의 한계 중 하나는 렌즈가 삼투압의 변화에 민감하기 때문에 지속적으로 혈청으로 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
(2-하이드록시프로필)-&베타;-사이클로덱스트린	시그마-알드리치	H107	파우더
1 L 병 상단 여과 시스템	VWR	97066-204	전체 조립, 병 상단, 0.2 μ m
100mm 페트리 접시	VWR	89022-320	미끄러질 수 있는, 미디어 세이버 스타일, 멸균
12 웰 플레이트	Corning	353043	멸균, 투명
바닥 35mm 페트리 접시	VWR	25373-041	Falcon 일회용 페트리 접시, 멸균, Corning
96 웰 플레이트	VWR	29442-072	멸균, 투명 바닥
알라마르 블루(레사주린)	Fischer Scientific	DAL1100	Molecular Probes 세포 생존도 시약
벤잘코늄 클로라이드 용액	Sigma-Aldrich	63249	50% in H20
Biosafety cabinet
Cytation 5 plate reader	BioTek	CYT5MPV	Cell imaging multi-mode reader
소 태아 혈청	ThermoFischer Scientific	12484028	적격, 열 비활성화, 캐나다
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	세포 배양용, 분말
인큐베이터
Lanosterol	Sigma-Aldrich	L5768	≥ 93%, 분말
L-글루타민	시그마-알드리치		세포 배양을 위해, 분말
매체 (M-199)	시그마-알드리치	M3769	수정, Earle&prime 포함; s 염, L-글루타민, 중탄산나트륨 및 페놀 레드가 없는 분말, 세포 배양에 적합한
파스퇴르 피펫			5 3/4'', 면 페
니실린-스트렙토마이신	ThermoFischer Scientific	15140122	액체(10,000 U/mL)
인산염 완충액(PBS)			액체, 멸균, 세포 배양
에 적합피펫 팁(100 µ L, 1,000 &마이크로; L, 5,000 &마이크로; L)	VWR		멸균
ScanTox (렌즈 레이저 스캐너)	특별히 개발	사내 N / A	렌즈 광학 품질을 결정하기 위해 레이저로 렌즈를 스캔
ScanTox 배양 챔버	특별히 개발	된 자체 N / A
테스트 및 배양 중에 소 렌즈를 제자리에 유지수산화나트륨	Sigma-Aldrich	S2770	1.0 N, BioReagent, 세포 배양에 적합

된 중탄산 나트륨 Sigma-Aldrich S5761 세포 배양 용, 분말