Drosophila 중앙 두뇌에 있는 성인 신경 발생을 자극하고 분석합니다

요약

이 문서는 성인 Drosophila 에 관통 외상성 뇌 손상을 입히고 결과 신경 발생을 검사하기위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

초록

질병 이나 상해에 응하여 신경 발생의 근본적인 분자 및 세포 기계장치는 잘 이해되지 않습니다. 그러나, 이 기계장치를 이해하는 것은 신경 재생 성 치료를 개발하기 위한 중요합니다. Drosophila 멜라노가스터 는 신경 발달의 연구를 위한 주요한 모형입니다 그러나 역사적으로 성인 두뇌 재생을 조사하기 위하여 이용되지 않았습니다. 이것은 성인 두뇌가 아주 낮은 미토Tic 활동을 전시하기 때문에 주로 입니다. 그럼에도 불구 하 고, 성인 Drosophila 중앙 두뇌에 외상성 뇌 손상 (PTBI)을 관통 새로운 뉴런과 새로운 신경의 생성을 트리거. Drosophila 에서 사용할 수 있는 강력한 유전 도구는 여기에서 기술된 간단하지만 엄격한 상해 프로토콜과 결합하여 지금 성인 Drosophila 두뇌신경 재생 연구를 위한 강력한 모형을 만듭니다. 여기에 제공 (1) 성인 중앙 뇌에 관통 부상과 (2) 해부, 면역 조직 화학, 및 화상 진전에 대한 자세한 지침이 제공됩니다. 이러한 프로토콜은 매우 재현 가능한 결과를 생성하고 신경 재생의 기본 메커니즘을 해부하기 위한 추가 연구를 용이하게 합니다.

서론

뇌와 신경계의 손상은 전 세계적으로 사망과 장애의 주요 원인입니다. 대략 150만 명의 미국인^{은 매년 외상}성 뇌 손상 (TBI)를 겪고, 미국에 있는 추정된 6백만명의 개별은 파킨슨병과 알츠하이머 병2와 같은 신경 퇴행성 질병 때문에 손해를 입는 동안 ¹¹. 뇌의 질병과 부상은 신경 변성을 유발하여 감각, 인지 및 운동 결함으로 이어질 수 있습니다³. 인간의 뇌 수리를 위한 치료 전략을 개발하는 것은 두뇌의 복잡한 생리학 때문에 어려웠습니다. Drosophila melanogaster 와 같은 모형 유기체는 신경 변성 및 잠재적인 치료 표적4의 근본적인 기계장치를 확인하기 위한 간단한 시스템을 제공합니다⁴.

과일 플라이 드로소필라 멜라노가스터는 유전학, 발달 생물학 및 신경 과학의 분야를 발전시키는 100 년 이상 강력한 모델 유기체였습니다^5,6. Drosophila 두뇌는 단지 ~90,000 뉴런⁷, 평균 인간 ^brain8 보다는 백만 배 더 적은, 그러나 많은 유사점이 있습니다. 인간과 비행 두뇌 모두 신경 전달 물질 GABA를 활용, 조미료, 아 세 틸 콜린, 그리고 생물 성 아민 도파민과 세로토닌⁹. Drosophila와 인간 뉴런은 또한 공유 시냅스 아키텍처와 유사한 신경 세포 유형¹⁰과 함께 유사하게 작동합니다. Drosophila의 작은 두뇌 크기와 고급 유전학 기술의 가용성, 분자의 보존과 함께, 세포, 그리고 Drosophila와 포유류 사이 생리적인 기계장치, Drosophila 연구원은 포유류 모형에서 대답하기 어려운 질문을 하는 것을 허용합니다.

Drosophila에 있는 성인 신경 발생의 우리의 현재 이해는, 항상성 도중 그리고 상해를 따르는 둘 다, 제한남아 있습니다. 더 일반적인 발달 도중 신경 발생에 관하여 알려지는. 예를 들면, 신경 세포및 glia는 신경 폭발^10,11에게 불린 전구체 세포에서 발달 하는 동안 생성됩니다. 신경 폭발의 적어도 3 개의 다른 유형중앙 두뇌에서 구별 되었습니다. 타입 I 와 타입 II 계보 신경 폭발 모두 puparium 형성 후 세포 주기 ~20-30 h를 종료합니다¹². 대조적으로, 버섯 체 신경폭발은 세포 분열을 종료하고 puparium ^{형성 후} 사신 의존 식 석멸을 통해 이렇게 하는 마지막입니다 .85-90 h. 백과 사 후, 성인 Drosophila 뇌는 몇 분할 세포 (~1 세포/두뇌), 주로 ^glia14. 성인 광학 엽은 천천히 신경 발생을 할 수있는 신경 폭발을 가지고¹⁵, 성인 중앙 뇌는 알려진 신경 폭발이없는 동안. 신경 전조자와 제한된 세포 증식의 희소성은 성인용 포유류 뇌의 상황과 강하게 유사하며, Drosophila에서 성인 신경 발생 메커니즘의 잠재적 관련성을 인간에게 강조합니다.

상해 후 성인 Drosophila 광학 엽에서 성인 신경 발생의 낮은 수준의 발견¹⁵ 성인 Drosophila 중앙 두뇌또한 성인 신경 발생¹⁶ 할 수 있다는 가설을 주도. 이 프로토콜은 성인 중앙 두뇌에 있는 신경 발생을 조사하는 데 사용할 수 있는 성인 Drosophila 에 있는 중앙 두뇌 상해의 엄격하고 재현가능한 모형을 만드는 것을 기술합니다. 인간과 Drosophila 두뇌 건축 및 기능 사이 유사성을 감안할 때, 이 발견은 다치고 병받은 인간 두뇌에 있는 치료 신경 발생을 위한 중요한 표적의 확인으로 이끌어 낼 수 있었습니다.

프로토콜

이 프로토콜은 UW-매디슨의 동물 관리 지침을 따릅니다.

1. PTBI를 위한 성인 Drosophila 생성

1. 표준 십자가의 경우 20 처녀 y[1] w[1]를 놓습니다. UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL417 성인 여성과 10 y[1] w[1]¹⁷ 성인 남성은 음식이 들어있는 바이알 (재료의 표 참조)에서 함께 날아갑니다. 많은 수의 동기자손을 갖기 위해 10-20개의 십자가를 동시에 설정합니다. 표준 십자가는 유전자형의 F1 자손발생을 야기합니다: y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+.
   1. 결합 및 계란 누워에 대한 25 °C에 바이알을 배치합니다. 자손을 최대화하기 위해 부모를 2-4일마다 새로운 바이알로 옮기고 이전 바이알을 25°C로 유지합니다. 부모가 F2 자손이 없는지 확인하기 위해 부모가 처음 배치 된 후 18 일 동안 각 병기를 버리십시오.
      참고: 각 부모 집합에서 3세트의 자손("무리")을 생성할 수 있습니다.
   2. F1 자손이 닫히기 시작하는 경우 ~ 10 일 후에 확인하십시오.
2. 계보 연구에 대 한, 사용 F1 퍼마-쌍둥이 남성¹⁵ 유전자 형의: w; FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-미르/FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-미르; 욕조-^GAL80ts/act-GAL4 UAS-flp. 일관성을 위해 매번 동일한 방향으로 이 십자가를 수행합니다.
   1. 퍼마 쌍둥이 남성을 생성하려면 20 처녀 를 배치하십시오. FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-미르; 욕조-^GAL80ts/TM6B 여성 및 10 w; FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-미르; act-GAL4 UAS-flp/TM6B15 성인 남성은 음식이 들어 있는 바이알에 함께 있습니다.
   2. 결합 및 계란 누워에 대한 17 °C에 바이알을 배치합니다. 부모를 7일마다 새로운 음식의 바이알로 옮기고, 모든 바이알을 17°C에서 유지합니다. 부모가 F2 자손이 없는지 확인하기 위해 부모가 처음 배치 된 후 35 일 각 유리병을 폐기하십시오.
   3. F1 자손이 닫히기 시작하는 경우 ~ 21 일 후에 확인하십시오.

2. 관통 외상성 뇌 손상 (PTBI;  그림 1)

1. 새로 닫힌 F1 파리를 정렬합니다. 6 h 포스트 백과 내에서 젊은 남성을 선택합니다. 이 수컷은 유리병 당 40개 이하의 파리와 함께 음식이 들어 있는 깨끗한 바이알에 놓습니다.
   참고 : 이것은 _CO2 패드에 파리를 마취하고 여전히 meconium (복벽을 통해 어두운 녹색 자리로 볼 수 있음)이있는 성인 남성을 식별하여 아침 중반에 가장 쉽게 달성됩니다.
2. EdU와 셀 분할을 라벨을 부착할 계획이라면 부상 전 6시간 동안 5-에티닐-2'-데옥시리딘(EdU 참조)을 사전 공급한다. 자세한 내용은 3단계를 참조하십시오.
3. 미누티엔 핀( 재료표 참조)을 1.5mL 마이크로센트심분리기 튜브에 70% 에탄올로 채워진 1.5mL 마이크로센트심분리기 튜브에 100개의 핀을 배치하여 최소 5분 동안 소독합니다.
4. CO2 패드와 페인트 브러시를 70% 에탄올을 살포하여 소독하고 깨끗한 보풀이 없는 조직으로 건조를 닦아냅니다. 공구가 깨끗하고 건조하면 40개 이하의 정렬된 F1 수컷을 깨끗한 패드로 다시 옮기십시오.
5. 플라이 패드의 2 그룹으로 F1 남성을 분리합니다. 한 그룹은 통제, 부상없는 파리 역할을합니다. 두 번째 실험 그룹은 PTBI를 받게 됩니다.
6. 집게를 사용하여 4-5개의 새로운 Minutien 핀을 미세원심분리기 튜브밖으로 꺼내 _CO2 패드 가장자리 근처에 놓습니다. 해부 범위에서 날카로운 점을 가진 직선 Minutien 핀을 선택합니다.
   참고: 실험을 위해 미누티엔 핀 을 하나 만 사용하면 가변성이 줄어듭니다. 날카로운 핀을 재사용합니다. 손상되거나 무딘 핀을 별도의 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에 놓고 70% 에탄올이 들어 있어 안전한 폐기를 한다.
7. 표준 크로스에서 파리로 작동하는 경우 녹색 형광 단백질 (GFP)에 적합한 흥분 및 방출 필터가 장착 된 스테레오 현미경 발광 다이오드 (LED) 램프를 켭니다. 이렇게 하면 440-460 nM에서 흥분을 허용하고 500-560 nM의 시각화를 허용합니다.
   참고:이 램프와 필터 세트로, 버섯 몸체의 세포체는 머리 큐티클을 통해 녹색으로 형광합니다 (그림 1C). 다른 유전자형의 퍼마-트윈 파리 또는 파리의 경우, 스테레오 현미경에 대한 표준 백색광 조명기는 버섯 본체에 부상을 목표로 헤드 큐티클의 랜드마크를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다(도 1C).
8. 한 손에 선택된 Minutien 핀을 집어 들고 잡기 위해 집게를 사용하여 (오른손잡이의 경우 일반적으로 오른손입니다)와 다른 (일반적으로 왼쪽)의 페인트 브러시를 잡습니다. 실험 군에서 비행을 선택하고 플라이의 머리가 오른쪽에 있는 헤드 캡슐의 등갈 전망을 가질 수 있도록 플라이를 배치합니다. 등불 흉부의 앞쪽에 브러시를 놓고 부드럽게 아래로 밀어 서 비행을 안정화시하십시오.
9. 머리 오른쪽에 있는 버섯 몸의 세포체에서 미누티엔 핀의 끝을 조준하고 머리 캡슐을 관통합니다. 랜드마크를 사용하는 경우, 오셀리와 눈의 등갈림 사이의 등두부 큐티클을 대상으로 한다(그림 1).
10. 부상을 완료 한 후, 페인트 브러시를 사용하여 미누티엔 핀에서 머리를 부드럽게 밀어 넣습니다.
11. RNA-Seq 또는 qRT-PCR에 대 한 뇌를 사용 하는 경우, 머리의 왼쪽에 두 번째 부상을.
12. 실험군에서 모든 파리를 다치게 하기 위해 2.8-2.10단계를 반복한다.
13. 모든 파리가 다친 후, 통제하고 부상당한 파리를 음식이 들어있는 별도의 바이알에 부착하십시오. 파리가 마취에서 회복되고 이후 노화하는 동안 유리병을 수평으로 놓아 파리가 음식에 걸리지 않도록 하십시오.
14. 표준 크로스 파리를 25°C로 놓고 퍼마 트윈 플라이는 30°C에서 연령까지 비행합니다.
15. 24시간 이상 숙성된 파리의 경우 1-2일마다 깨끗한 음식에 넣습니다.

3. EdU 라벨링

1. 디메틸 설프리산화물(DMSO)에서 10mM 5-에티닐-2'-데옥시리딘(EdU)의 재고를 준비한다. 이는 최대 12개월 동안 -20°C로 저장할 수 있다.
2. 50 μM EdU의 200 μL을 10% 자당에 준비하십시오. 사전 공급은 PTBI 전에 6 시간 동안 EdU와 함께 날아갑니다.
3. 그렇지 않으면 빈 유리병에 23mm 원형 3 필터 용지 ( 재료의 표 참조)에 10 % 자당 50 μM EdU의 200 μL을 배치합니다.
4. 파리를 바이알에 놓습니다. 그런 다음 면 플러그로 유리병을 밀봉합니다.
5. 바이알을 6시간 동안 25°C에서 가습된 인큐베이터에 수평으로 놓습니다.
6. 2.3-2.10 단계에 설명된 PTBI를 수행합니다.
7. 파리를 EdU 함유 유리병에 다시 놓습니다. 면 플러그로 바이알을 밀봉하십시오.
8. 최대 25°C에서 가습된 인큐베이터에 유리병을 수평으로 놓습니다. 아래에 설명된 단계 중 하나를 따르십시오(3.8.1-3.8.3 단계).
   1. 4단계에서 설명된 바와 같이 고착, 세척 버퍼 및 막히지 않고 완충제를 사용하여 뇌를 해부및 수정하고 항체 염색 전에 수행된 EdU 검출 반응으로 정제한다.
   2. 파리를 새 필터 용지와 50 μM EdU의 200 μL을 10% 자당에 포함하는 깨끗한 유리병으로 이송합니다. 25°C 인큐베이터에 유리병을 수평으로 놓습니다. 라벨링 기간 동안 24시간마다 반복합니다. 이어서, 항체 염색 전에 수행된 EdU 검출 반응과 함께 아지드 없이 완충제를 사용하여 4단계에서 설명된 바와 같이 뇌를 해부및 수정한다.
   3. EdU를 사용하여 펄스 추적 라벨을 보려면 펄스 기간 동안 EdU를 공급하려면 24시간마다 새 필터 용지가 들어 있는 깨끗한 바이알과 10% 자당에서 50 μM의 200 μL을 전송합니다. 펄스 기간(예를 들어, 4일) 후, 파리를 표준 드로소필라 식품을 함유한 유리병으로 이송한다. 유리병을 25°C 인큐베이터에 추가로 3일 간 배치합니다. 이어서, 항체 염색 전에 수행된 EdU 검출 반응과 함께 아지드 없이 완충제를 사용하여 4단계에서 설명된 바와 같이 뇌를 해부및 수정한다.

4. 해부, 면역 화학 및 장착

1. 고정100 μL로 1.5mL 마이크로센트심분리기 튜브 준비: PEM의 포름알데히드(100mM piperazine-N, N'-bis(2-에탄에탈포닉산) [PIPES], 1mM EGTA, 1mM _MgSO4, pH 7.0)( 재료 표 참조)
   참고: 단일 유전자형 및 상태의 20개의 뇌는 단일 튜브에서 처리될 수 있습니다.
2. 70% 에탄올의 작은 풀(~100 μL)과 인산완충식식염수(PBS; _K2HPO4 100mM, NaCl _140mM, pH 7.0)의 작은 풀 1개(~100 μL)의 해부 플레이트를 준비한다.
3. 70%에탄올로 살균된 _CO2 패드에서 ~ 10개의 제어 또는 실험용 파리를 마취합니다.
4. 메스를 사용하여 각 플라이의 트렁크에서 머리를 분리합니다.
5. 70% 에탄올에 적재된 페인트브러시로 머리를 모으고 해부 판에 있는 에탄올 풀에 2-5분 동안 머리를 놓습니다.
   참고: 이것은 약간 두뇌를 탈수하고 그(것)들을 쉽게 머리 표고에서 해부합니다.
6. 머리를 PBS의 ~100 μL 풀로 옮기고 뇌를 해부하여 각 뇌를 PBS의 깨끗한 ~100 μL 풀로 이동시다. 두 쌍의 워치메이커 스폰을 사용하여 머리 표기의 뒷면을 열고 두 번째 집게의 닫힌 끝을 사용하여 큐티클에서 뇌를 부드럽게 캐고 있는 동안 한 쌍의 집게로 큐티클을 들고 이 작업을 수행하십시오.
7. 해부된 뇌를 뇌의 진입을 허용하기 위해 절단및 경작된 플라스틱 팁을 갖춘 P200 파이펫터를 사용하여 고정 용액의 100 μL을 포함하는 미세 원심 분리기 튜브로 옮겨냅니다.
8. 실온에서 20-25 분 동안 수정하십시오. 조심스럽게 P200 또는 유리 파이펫으로 수정을 제거합니다.
9. 고정 된 두뇌를 'PT'(PBS + 0.1% Triton X-100)로 4번 세척하여 각 세척 사이에 몇 분 동안 뇌가 정착할 수 있도록 합니다.
   참고: 뇌가 세차 사이에 급속히 정착하지 않으면 여전히 뚱뚱한 몸및/또는 기관체가 부착되어 있을 수 있습니다.
10. PBS 의 1 mL에 블록 샘플 플러스 0.1% 트리톤 X-100 및 2% 소 혈청 알부민 (PBT) 용 ~ 1 실온에서 h.
11. 차단 용액을 제거하고 PBT에서 4°C에서 하룻밤 사이에 1차 항체 용액의 100 μL로 시료를 배양한다. 이 연구에서 사용되는 1차 항체는 토끼 항 PH3 (1:500) 및 마우스 항 파시린 II (1:20) ( 재료의 표 참조)이다.
12. 1mL의 PT로 샘플을 5번 세척하여 뇌가 각 세척 사이에 몇 분 동안 정착할 수 있도록 합니다.
13. 최종 세척을 제거하고 4 °C에서 하룻밤 동안 이차 항체 용액의 100 μL에서 배양하십시오. 여기서 사용되는 이차 항체는 항토끼 568 (1:400) 및 항 마우스 Cy5 (1:100) ( 재료의 표 참조)이다.
14. 1mL의 PT로 샘플을 5번 세척하여 뇌가 각 세척 사이에 몇 분 동안 정착할 수 있도록 합니다. 마지막 세척 중에 핵을 염색하기 위해 4'6-Diamidino-2-Phenylindole, 디하이드로클로라이드 (DAPI; 10 μM 용액의 1:100)를 10 분 동안 추가하십시오. 각 튜브에 50-100 μL을 남기고 세척을 제거합니다.
15. 각 슬라이드의 중앙에 단일 자체 접착제 보강 라벨과 각 레이블의 중앙에 페이드 방지 장착 매체의 50 μL 액적을 배치하여 현미경 슬라이드 를 준비합니다(재료 표 참조). 보강 라벨은 슬라이드 위에 덮개 슬립을 약간 고정하고 장착 된 뇌가 지나치게 평평해지는 것을 방지합니다.
16. 각 미세 원심 분리기 튜브에서 절단 및 경유 플라스틱 팁을 갖춘 P200을 사용하여 가능한 한 적은 세척 버퍼로 준비 된 슬라이드로 두뇌를 조심스럽게 전달합니다. 한 슬라이드에 10개의 두뇌를 장착할 수 있습니다.
17. 각 슬라이드에 커버슬립을 배치하고 매니큐어로 슬라이드를 밀봉하기 전에 집게를 사용하여 뇌를 부드럽게 재배치하십시오. 후방 측 또는 전방으로 뇌를 오르향하지만 서로 만져서는 안됩니다.
    참고: 전체 뇌를 통해 고품질의 공초점 이미지를 얻기가 어렵기 때문에 일부 뇌는 각 방향에 장착되어야 합니다.
18. 준비된 슬라이드를 4°C에서 4°C에서 이미징까지 보관하십시오. 장기 저장(최대 1년)의 경우 슬라이드를 -20°C로 저장할 수 있습니다.

5. 공초점 이미징

참고: DAPI 및 형광 보조 항체(즉, 405 nm, 488nm 및 568 nm, 633 nm)에 적합한 발광 레이저 및 방출 필터 큐브가 있는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하는 이미지 뇌.

1. 현미경, 레이저, 컨트롤러 및 컴퓨터의 전원을 켭니다.
2. 인수 소프트웨어를 엽니다.
3. 획득 모드에서는 최대 4개의 채널을 선택하고 원하는 채널의 순차적 스캐닝을 위한 매개 변수를 설정합니다. 각 채널의 레이저 전력을 5-10%로 늘립니다.
4. 현미경에 슬라이드를 놓습니다.
5. 에피소드 부착을 사용하여 이미지할 뇌를 선택 합니다(재료 표 참조).
6. 획득 모드에서는 1024 x 1024 픽셀을 프레임 차원으로 선택합니다.
7. 획득 모드에서 는 Z 스택 옵션을 선택하고 Z 스택을 2 μm 섹션에서 가져와야 함을 나타내고, 시료를 통해 초점을 맞추고, 이미지할 위쪽 및 아래쪽 초점 평면을 선택합니다.
8. 60배 목표를 사용하여 버섯 몸과 같은 20배 의 목표및 특정 뇌 영역을 사용하여 전체 뇌의 Z 스택 이미지를 수집합니다.

6. 데이터 분석

1. 확산되는 셀과 퍼마 트윈 클론의 수를 수동으로 정량화하거나 이미지 분석 소프트웨어를 사용합니다( 재료 표 참조). 소프트웨어를 사용하는 경우 최소 10μm 영역의 관심 영역(ROI)을 선택합니다.

결과

PTBI는 세포 증식을 자극합니다.
중앙 뇌 PTBI 후 신경 발생의 정도를 결정하기 위해, 증식 반응은 백과의 6 시간 이내에 수집 및 부상 젊은 성인 남성에서 측정되었다. 증식의 현저한 증가는 24h후 상해 후 항인포이스톤 3(PH3)를 사용하여 관찰되었으며, 이는 적극적으로 미토시스를 앓고 있는 세포를 위한 마커이다. 중앙 뇌를 제어하는 약 3 개의 PH3+ 세포와 부상당한 중앙 뇌의 11 PH3+ 세포가 PTBI 이후 24 h (도 2A-D)를 관찰합니다. 분할 세포의 대부분은 부상 사이트 근처에 위치하고 있습니다. 세포 분열에 대한 두 번째 분석은 단일 부상에서 누적 세포 증식을 정량화하고 새로 생성된 세포가 살아남은 정도를 평가하는 데 사용되었습니다. 5-에틴닐-2'-데옥시리딘(EdU)은 DNA 합성을 거친 신합성 DNA 및 영구 라벨 세포에 통합될 수 있는 티미딘 아날로그이다. 파리는 EdU의 4 일 펄스를 받았고 3 일 간의 추격전이 뒤따랐습니다. 이것은 표지된 세포가 실행 가능하고 증식 후에 적어도 3 일 살아남았다는 것을 밝혔습니다. 7 일까지, 중앙 두뇌를 통제하는 2 EdU+ 세포의 평균및 부상당한 중앙 두뇌에 있는 11EdU+ 세포의 평균이 각각 있었습니다 (그림 2E). 이는 PH3 항체를 이용한 24시간 후 부상 후 얻은 결과와 유사하다. 세포 증식을 14일에서 측정할 때, 부상당한 두뇌는 평균 29EdU+ 세포 (그림 2E)인 동안, 손상되지 않은 통제는 PTBI 다음 두 번째 주에 적어도 계속한다는 것을 보여주는 동안, 중앙 두뇌 당 1 EdU+ 세포를 평균했습니다.

세포 증식은 연령에 따라 다릅니다.
중앙 뇌에서 가장 큰 증식 반응은 백과 후 처음 24 시간 이내에 관찰되었다 (도 3). 7 일 후 백과에 의해, 관통 부상은 여전히 중앙 뇌 당 6 PH3 +세포의 평균과 함께 증식의 상당한 증가를 야기한다. 여전히, 에 의해 14 일 후 백과, PTBI 다음 분할 하는 세포에 대 한 능력에 크게 감소 1 분할 세포, 제어 두뇌의 유사 하 게 (그림 3). 따라서, PTBI 이후 세포 증식의 잠재력은 연령에 따라 다릅니다.

새로 생성된 뉴런은 대상 영역을 수정하기 위해 투영할 수 있습니다.
PTBI 후 신경 재생을 평가하기 위해 퍼마 트윈 라벨링 시스템¹⁵가 사용되었습니다. 퍼마 쌍둥이 혈통 추적은 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 적색 형광 단백질 (RFP)¹⁵와 세포와 그들의 자손을 분할 영구적으로 라벨. 더 많은 퍼마 쌍둥이 클론은 대조군보다 2 일 및 2 주에 부상당한 샘플에서 검출되었습니다 (그림 4A-E). 특히, PTBI 뇌의 ~50%에서 새로운 버섯 바디 뉴런이 있었다 2 주 부상 후 주 (그림 4N). 이 새로운 뉴런은 버섯 바디 칼릭스와 그들의 축축에 적절하게 그들의 훈장을 버섯 바디 엽에 적절하게 투영했습니다 (그림 4D, F, G). 이것은 새로 생성된 세포가 손상된 버섯 바디의 복구에 관련시키는 기능적인 뉴런일 지도 모르다는 것을 표시합니다. 재생되는 것으로 나타난 뇌의 다른 영역은 타원체(EB)(도 4H,I), 안테나 로브(AL) (도 4J, K), 및 측면 혼(LH)(도 4L, M)을 포함하며, 큰 클론을 약 26%, 26%, 20%, 20%로 각각 포함한다(도 4N). 이 결과는 성인 신경 발생의 조사를 위한 이 시스템의 유용성을 강조합니다. PTBI 에 이어 새로운 뉴런의 생성으로 이어지는 이벤트 시퀀스에 대한 제안된 모델이 도 5에 도시된다.

그림 1: 성인 Drosophila 중앙 두뇌에 관통 외상성 뇌 손상 (PTBI). (A) 어른 플라이 헤드의 외관의 회로도. 이것은 정면보기입니다. 따라서 동물의 오른쪽은 뷰어의 왼쪽에 있습니다. (B) 회색으로 표시된 부상 궤적을 가진 성인 드로소필라 머리의 내부의 회로도. 이것은 후방 보기입니다. 따라서,이 이미지와 후속 그림에서, 뇌의 오른쪽은 오른쪽에 있습니다. 중앙 뇌 PTBI는 여러 뇌 구조에 영향을 미치는, 버섯 몸을 포함 하 여 (녹색) 그리고 뇌 외부 조직, 지방 체를 포함 하 여 (파란색) 그리고 혈 안 세포 (빨간색). CB = 중앙 뇌 영역. OL = 광학 로브 영역. (C) 버섯 체(화살촉)가 녹색 형광 단백질(GFP)으로 표지되는 살아있는 성인 머리의 등쪽 보기. 이것은 '표준 유전자형'입니다(자세한 내용은 텍스트 참조). PTBI 프로토콜은 버섯 신체에 부상을 초래합니다. 이 그림은 참조¹⁶에서 적용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: PTBI는 세포 증식을 자극합니다. 부상없는 제어 (A) 및 PTBI (B) 회로도. 오른쪽 상단 모서리에 있는 파란색 상자는 패널(C) 및 (D)에서 더 높은 배율로 표시된 뇌 영역을 나타냅니다. (C,D) PH3 항체(red)는 부상 후 세포 증식 24h를 분석하는 데 사용하였다. 제어 뇌 (C)에서, MB 근처에 몇 PH3 + 세포와 아무도 없다. 그러나 PTBI 뇌(D)에는 MB 근처에 PH3+ 세포가 있습니다. (E) 증식 세포의 정량화. 숫자는 전체 뇌에 걸쳐 확산 세포를 반영, 뿐만 아니라 버섯 몸의 부근에서. 24 h에서, 손상되지 않은 제어 두뇌는 3 PH3+ 세포/두뇌 (n = 11 두뇌, 28 세포의) 평균을 가지고 있었고, 24 h PTBI, 뇌는 평균11 PH3+ 세포 / 뇌 (n = 17 두뇌, 181 세포)를 가졌다. 7 일에서, 손상되지 않은 통제는 2 EdU+ 세포/두뇌 (n = 15 두뇌, 24 세포의 평균)와 몇몇 EdU+ 세포가, 7 일 후 PTBI 두뇌는 11 EdU+ 세포/두뇌의 평균을 가진 동안 (n = 22 두뇌, 238 세포). 14일, 부상되지 않은 대조군은 평균 1EdU+ 세포/뇌(n= 8개의 뇌,11세포)를 가지며, 14일 후 PTBI 뇌는 평균 29개의 EdU+ 세포/뇌(n= 14개의 뇌, 400세포)를 가지고 있습니다. 실험의이 세트를 위해, 백과의 6 시간 내의 젊은 성인 남성이 사용되었다. 3시간 포인트에서 대조군 및 PTBI 샘플의 쌍이 없는 t-tests는 각각 p<0.0001, p<0.0001 및 p<0.0002의 수익률 값입니다. 오류 막대는 표준 편차(SD)를 반영합니다. 이 그림은 참조¹⁶에서 적용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: PTBI에 대한 증식 반응은 나이가 들면서 감소합니다. 나이가 부상 후 발생하는 세포 증식의 양에 영향을 미치는지 여부를 탐구하기 위해 새로 폐쇄 된 성인 남성은 PTBI 7 일, 14 일 및 28 일 전에 숙성 된 동물과 비교하여 항 PH3를 사용하여 항 PH3를 사용하여 부상 후 24 h를 분석했습니다. 대동6h 이내에 부상을 입은 파리는 평균 11PH3+ 세포/뇌(n= 17개의 뇌, 182세포)의 평균 3PH3+ 세포/뇌에 비해 연령일치 컨트롤(n= 11개의 뇌, 28세포)을 가졌다. 7 일 동안 숙성 된 파리는 PTBI를 대상으로 한 평균 6 PH3 + 세포 / 뇌 (n = 11 뇌, 65 세포)의 평균 2 PH3 + 세포 / 뇌 (n = 5 두뇌, 12 세포)의 연령 일치 제어에 비해 있었다. 파리가 PTBI 전에 14일 동안 노화되고 24시간 후에 분석했을 때, 연령일치 대조군과 유사한 PH3+ 세포/뇌(n= 8개의 뇌, 11세포)의 평균이 있었는데, 이는 또한 평균 1PH3+ 세포/뇌(n= 4개의 두뇌, 2세포)를 평균화하였다. 28일 간의 부상 방지(n = 4, 1셀) 및 PTBI(n= 3, 1세포)는 평균 0 PH3+세포/뇌를 모두 비행합니다. PTBI가 4시간 지점에서 비교를 제어하는 T-테스트는 각각 p<0.0001, p<0.04, p<0.07 및 p<0.84입니다. 이 그림은 참조¹⁶에서 적용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 퍼마-쌍둥이 혈통 추적은 PTBI 다음 축축의 두뇌 재생 및 적당한 표적을 보여줍니다. 퍼마-쌍둥이 혈통 추적 시스템¹⁵는 PTBI 후 신경 발생을 분석하는 데 활용되었다. 이 시스템은 영구적으로 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 적색 형광 단백질 (RFP)와 세포와 자손분할 라벨. 파리는 개발 중에 시스템을 유지하기 위해 17 °C에서 사육되었다. 퍼마 쌍둥이 전진을 운반하는 F1 수컷은 백과기 시 수집한 다음, 부상을 입고 30°C에 배치하여 2일 또는 14일 동안 회복하였다. (A) 2 일 간의 부상 되지 않은 컨트롤에서, 일부 GFP+ 세포는 뇌 를 통해 흩어져 있다. (B) 14일 동안, 대조군 중앙 뇌에 존재하는 GFP+ 세포가 상대적으로 적다. (C) 비교에서, 2 일 부상 두뇌는 부상 (화살촉) 근처에 클러스터하는 경향이 더 많은 GFP + 세포를 가지고있다. (D) 부상 후 14일 동안 부상 부위 근처에 큰 클론이 있습니다. 이러한 클론 중 일부는 버섯 신체 기관을 따라 프로젝트 축 하 (화 살). GFP 채널만 여기에 표시됩니다. PTBI 샘플에는 유사한 RFP+ 클론이 있었습니다. (E) 칼론의 수는 시간이 지남에 따라 증가 PTBI.Control 미부상 뇌 (n = 13) 2 일에 10 클론의 평균을 가지고, 2 일 PTBI 뇌 (n = 20)의 평균23 클론 (p<0.00002). 7일 에서, 제어 두뇌는 두뇌 당 평균 9 클론 (n = 18)을 가지고 있었고, 7 일 PTBI 뇌는 뇌 당 평균 39 클론 (n = 16) (p-값<0.00000002)를 가졌다. 이는 부상 후 2일(p-값<0.0009)에서 볼 수 있는 클론의 수보다 훨씬 더 많은 수치입니다. 14 일 제어 두뇌에서, 두뇌 당 10 클론의 평균이 있다, 2 일 및 7 일 컨트롤에서 크게 다르지 않다. 그러나 PTBI 이후 14일 동안 평균 66GFP+ 클론이 있는데, 이는 연령 일치 제어(p<0.000003) 또는 2일 후 PTBI 뇌(p-value<0.0001)보다 훨씬 더 많습니다. 오류 막대는 SD. (F-M) PTBI가 뇌의 여러 영역에서 클론 형성을 자극합니다. 왼쪽에 있는 패널은 큰 클론이 PTBI (A, H, J, L) 14 일 후에 발견된 두뇌 지구의 회로도입니다. 오른쪽에 있는 패널은 대표적인 두뇌의 높은 배율을 보여줍니다 (G, I, K, M). 많은 14 일 두뇌는 특정 표적 지역에 투영된 클론이 있었습니다. 여기에는 버섯 체체(MB)(F,G), 타원체(EB) (H,I), 안테나 로브(AL) (J, K), 및 측면 혼(LH) (L,M)이 포함되었다. (N) 클론 번호와 클론 크기 모두 PTBI 이후 시간 증가.큰 클론을 가진 뇌 영역의 비율은 제어 및 부상 뇌에서 2, 7, 14 일에 계산되었다. 2 일에서, ~8% 제어 두뇌의 (n = 13) AL 클론을 보였다, 2 일 부상 뇌에 AL 클론이 없는 동안 (n = 20). 7일 간의 제어 뇌(n = 18)에서는 6%가 AL을 가지고 있었고 6%는 EB 클론을 가지고 있었습니다. 7일 후 PTBI(n=16)에서 뇌의 6%는 AL 클론을 가지고 있었고, 6%는 EB 클론이 있었고, 19%는 MB 클론이 컸다. 14일 동안, 제어 뇌(n=9)는 클론을 가진 특정 영역을 전시하지 않았고, PTBI 뇌의 47%는 MB 클론을 가지고 있었고, PTBI 뇌의 20%는 AL 클론을 가지고 있었고, PTBI 뇌의 27%는 EB 클론을 가지고 있었고, 27%는 LH 클론을 가졌다. 이 그림은 참조¹⁶에서 적용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 외상성 뇌 손상(PTBI)을 관통한 후 재생을 위한 요약 모델. 젊은 성인 Drosophila에서, 정경 신경 아 세포 유전자의 표현이 결여된 중앙 두뇌 안에 정지신경아세포 같이 세포가 있습니다. PTBI 이후 24시간까지, 정지신경아세포와 같은 세포가 활성화되고, 신경아세포 유전자를 발현하며, 증식하기 시작했습니다. PTBI 이후 4시간 및 24시간 모두에서 세포 사멸의 물결이 있다¹⁶. 7 일에서, 증식 비율은 아직도 높고, 새로운 세포의 많은 것은 성숙한 세포 정체성을 채택했습니다, 신경 세포 또는 glia되기. 14 일 후 PTBI, 축축절과 점막과 새로운 뉴런의 큰 클론은 제대로 각각의 대상 영역에 투영. 로코모터 결함도 14일까지 복원되어 성인 드로소필라 가 기능적으로 나아변할 수 있음을 시사합니다. 이 그림은 참조¹⁶에서 적용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

비록 성인 Drosophila 두뇌에 관통 부상 이전에 설명 되었습니다 15,17,18, 이러한 부상 시안경 엽에 초점을 맞춘 하지 중앙 두뇌. 또한, 부상을 수행하는 방법에 대한 자세한 지침은 지금까지 부족하다. 이 프로토콜은 PTBI 후에 성인 신경 발생에 대한 통계적으로 유의한 증거를 재현성인 Drosophila 중앙 두뇌에 관통 상해를 위한 모형을 기술합니다.

이 PTBI 프로토콜의 재현성은 부분적으로, 부상 표적 영역으로 버섯 본문에 기인한다. 버섯 본체는 크고, ~2200뉴런으로 구성되어 있으며, 크고 고정관된 배열¹⁸에서 복잡한 원더라이트와 축슨 아버를 가진 뉴런이 있다. 버섯 체뉴런의 세포체는 뇌 표면 근처에 놓여 있으며 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현을 사용하여 머리 표피를 통해 시각화될 수 있다(도 1C). 버섯 체전구체는 발달 중에 세포멸을 겪는 마지막 신경 줄기 세포^입니다13,12,19. 따라서, 많은 버섯 몸 뉴런은 백과의 시간에 꽤 젊은. 이 버섯 시체 다른 뇌 영역 보다 더 많은 미토 성 잠재력을 가질 수 있습니다 가설주도¹⁶. 또한, 버섯 몸은 학습 및 메모리¹⁸에 대 한 중요 한. 이것은 PTBI 트리거신경 발생이 기능적인 회복으로 이끌어 내는지 물어볼 수 있습니다.

결과의 재현성에 기여하는 그밖 요인은 일관된 유전자형의 교차된 파리를 사용하여, 매번 같은 방향으로 십자가를 수행하고, 정확하게 양육 및 노화 온도를 통제하고, 남성과 여성을 개별적으로 분석하는 것을 포함합니다. 아웃 크로스에서 F1 파리를 사용하면 자발적인 돌연변이에 대한 뇌균질 분석 확률이 줄어듭니다. y[1] w[1]의 표준 십자가; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL4 성인 여성 y[1] w[1] 성인 남성 파리 는 유전자형 y[1] w[1]의 F1 자손귀에서 발생; UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+. OK107-GAL4 는 버섯 체의 모든 본질적인 뉴런으로 표현되며, 버섯 체의 시각화를 허용하는 막 바인딩 기자 UAS-mCD8-GFP 의 발현을 구동한다. 퍼마 트윈 크로스의 경우, 계보 추적 시스템을 끄려면 항상 17°C에 남아 있어야 합니다. 이것은 어떤 분할 세포가 발달 도중 표지되지 않으며 성인 출생 신경및 glia만 표지된다는 것을 보장합니다. 이를 위해 플라이룸은 17°C에서 유지될 수도 있다. 퍼마 트윈 ^system15 권장 사육 파리의 초기 설명은 18°C에서 권장되지만, 이는 상당한 배경 라벨링으로 이어질 수 있다.

일관성을 위해, 또한 하나의 PTBI를 수행으로 _CO2 패드에 부상없는 파리 제어를 유지하는 것이 좋습니다. 이렇게 하면 두 파리 세트모두 동일한 마취 노출을 보장합니다. 또한, 재현성이 머리를 완전히 관통하는 것이 바람직하다. 그러나, 패드에 대한 핀의 끝을 구부리지 않도록주의해야하므로 향후 부상에 사용할 수 없습니다. 숙련 된 실무자의 경우 PTBI 파리에 의도하지 않은 피해가 거의 없습니다. 그럼에도 불구 하 고, 흉부에 너무 열심히 누르면 부상 하는 동안 비행을 안정화 하는 치명적인 수 있습니다. 의도하지 않은 부상의 정도를 평가하는 한 가지 방법은 PTBI의 사망률을 24시간 후 의 비행으로 정량화하는 것입니다. 일방적으로 다친 파리의 경우 초보자에게는 50% 이상일 수 있습니다. 따라서 관찰된 결과가 PTBI에 의한 것이지 의도하지 않은 부상이 아니라는 것을 보장하기 위해, 초보자는 몇 주 동안 매일 ~20 파리에 PTBI를 투여하는 연습을 하고 24h 사망률이 일관되게 <10%가 될 때까지 결과된 뇌를 분석하지 않는 것이 좋습니다.

중앙 뇌 PTBI에 의해 자극된 증식의 양을 정량화하기 위해, 항인지질성 H3(PH3) 면역염색 및 5-에티닐-2'-데옥시리딘(EdU) 혼재를 모두 사용할 수 있다. 반대로 PH3는 메타Phase 전후에 걸쳐 세포를 라벨, 적극적으로 분할 세포의 일부에 검출을 제한. 따라서, 안티 PH3 염색은 확산의 부분적인 엿볼만 제공합니다. EdU는 새로 합성된 DNA에 통합될 수 있는 티미딘 아날로그입니다. 부상 전후에 EdU를 먹이면 부상 전후에 분할되거나 분열된 세포의 보다 완전한 그림을 얻을 수 있습니다. 분할하는 모든 세포가 영구적으로 표시된다는 사실은 천천히 사이클링 세포의 식별과 초기 증식 후 세포의 생존을 분석하는 데 모두 도움이됩니다. 불분명 한 이유로, 하지만 어쩌면 혈액-뇌 장벽의 제한 된 투과성 으로 인해, EdU 라벨은 비효율적이 고 성인 두뇌에 있는 세포 증식을 보고. 이것은 24 h PTBI에서 제어 및 실험 두뇌 둘 다에 있는 PH3+ 및 EdU+ 세포의 유사한 수에 의해 증명되고 perma-twin 클론에 있는 새로운 세포의 단지 하위 집합이 ^EdU16를 통합한다는 것을 관찰해서. 최대 라벨링의 경우, 부상당한 파리가 PTBI 이후 몇 시간 동안 먹이를 재개하지 않기 때문에 EdU로 파리를 미리 공급하는 것이 필수적입니다. 수유는 EdU 용액에 식품 착색을 추가하고 복부 ^cuticle16을 통해 창자에 있는 염료의 양을 모니터링하여 평가되었습니다.

우리가 4 단계에서 뇌 해부 프로토콜을 제공했지만 대체 기술이 사용될 수 있다는 점에 유의해야합니다. 이들 중 일부는 이전에 게시된 프로토콜^20,21,22에서 사용할 수 있습니다. Drosophila melanogaster는 신경계의 창자 및 분대를 포함하여 다중 조직의 근본적인 재생기장치를 연구하기 위하여 이용될 수 있는 강력한 유전 및 분자 공구를 가진 저비용 모형을 제공합니다. 뇌 손상에 대한 반응을 연구하는 데 사용할 수있는 새로운 재현 가능한 부상 모델이 여기에 설명되어 있습니다. 이러한 프로토콜을 사용하여 얻은 데이터는 성인 Drosophila 중앙 두뇌가 증식 능력을 유지한다는 아이디어를 지원, 부상에 대한 응답으로 새로운 뉴런을 생성. 이러한 관측은 성인 신경 발생의 정도와 그것의 근본적인 분자 기계장치의 추가 조사를 보증합니다. 일단 신경 재생에 관련된 분대는 이 시스템에서 확인되면, 우리는 인간에게 성인 Drosophila 신경 발생의 우리의 지식을 변환할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
# 11 일회용 메스	산타 크루즈 생명 공학	sc-395923	뇌 해부 전에 트렁크에서 초파리 머리를 분리하는 데 사용
150mm 직경 검은 색 실가드 요리	다우	1696157	Dow의 시약으로 실험실에서 만들어졌으며 뇌 해부에 사용
18mm 커버 슬립은		현미경 슬라이드
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)	조직화학을 위한	ThermoFisher	D1306
다양한 공급을			70% 에탄올
생쥐 항생쥐 Cy5	Jackson ImmunoResearch	715-175-151	면역조직화학
항토끼 568	ThermoFisher	A11036	면역조직화학용
혈청 알부민 (BSA)	SIgma Aldrich	A7030	조직 화학,
투명 매니큐어	커버 슬립 밀봉 용	모든
Click-It EdU 라벨링 키트	InVitrogen	C10640	새로 합성
된 DNA CO2< / sub> 버블러	Genesee Scientific	59-181	마취
CO2 < / sub> 패드		마취용	59-114
CO2 조절자 및	마취용	공급
컨포칼 현미경	고정, 염색 및 장착된 뇌 이미징용	면
플러그	EdU용 Genesee Scientific	51-101	EdU 라벨링용
파리 바이알	EdU용 Genesee Scientific	32-109	라벨링
고정 버퍼 (파이프, EGTA, 마그네슘; PEM)	다양한 회사에서 공급받은 구성 요소	; 100 mM piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7.0
			반응 고정 및 염색 및 보관용 Minutien 핀
뇌 장착용	현미경 슬라이드	뇌
Minutien 핀	Fine Science Tools	26002-10	; 12.5 μ m 직경 팁 및 100 μ m 직경 막대
마우스 안티 Fasiclin II	면역 조직 화학을위한	Hybridoma Bank	1D4-s
NIGHTSEA 스테레오 현미경 형광 어댑터	전자 현미경 과학
P20, P200 및 P1000 피펫 및 팁	용액 인
	뇌를 해부하고 면역조직화학 차단 및 세척 용액을 만들기 위해 여러 회사에서 공급한 구성 요소; 100mM의 K2HPO4, 140mM의 NaCl, pH 7.0
	면역	조직 화학 및 항체 희석을위한 용액을 차단하는
요소 토끼 안티 PH3	Santa Cruz Biotechnology, Inc	sc-8656-R	면역 조직 화학을위한
보강 라벨	Avery	5721	현미경 슬라이드와 커버 슬립
크기 0 페인트 브러시	사이의		공간을 유지하기 위해부상 중 성인 초파리를 조작하고 안정화하기 위해
Triton X-100	Sigma Aldrich	93443
두 쌍의 #5 시계 제작자 겸자	Fine Science Tools	11255-20	Minutien 핀을 잡고 뇌 해부에 사용
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	현미경 슬라이드용 장착 매체