재조합 팔다리는 배아 신호의 영향으로 세포 분화 과정과 패턴 생성을 연구 할 수있는 강력한 실험 모델입니다. 이 프로토콜은 상이한 유기체로부터 수득된 다른 세포 유형에 적응할 수 있는 닭 사지-중배엽 세포로 재조합 사지를 생성하는 상세한 방법을 제시한다.
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이 논문에서
요약
초록
세포 분화는 조직 및 장기 발달 동안 다양한 특수 세포 유형의 형성으로 이어지는 세포 투입의 미세 조정 과정입니다. 이 과정은 성인기에 적극적으로 유지됩니다. 세포 분화는 장기의 발달 및 항상성 동안 진행중인 과정입니다. 세포 분화의 초기 단계를 이해하는 것은 형태 형성과 같은 다른 복잡한 과정을 아는 데 필수적입니다. 따라서, 재조합 닭 팔다리는 배아 패터닝 신호 하에서 세포 분화 및 패턴 생성의 연구를 허용하는 실험 모델이다. 이 실험 모델은 생체내 환경을 모방하고; 그것은 초기 사지 새싹에서 얻은 외배엽 덮개로 재결합 된 세포를 조립합니다. 나중에, 외배엽은 병아리 배아 수용체에 옮겨지고 이식되어 발달을 허용합니다. 이 분석은 주로 중배엽 사지 새싹 세포를 평가하기 위해 사용되었다; 그러나, 다른 줄기 또는 다른 유기체로부터의 전구 세포에 적용될 수 있다.
서론
척추동물 사지는 세포 분화, 세포 증식, 세포 사멸, 패턴 형성 및 형태형성 1,2를 연구하기 위한 강력한 모델이다. 발달 동안, 팔다리는 측방 플레이트 중배엽1에서 유래 된 세포로부터 팽창으로 나타난다. 사지 새싹은 외배엽으로 덮인 중배엽 세포의 중심 코어로 구성됩니다. 이 초기 구조에서 전체적으로 잘 형성된 팔다리가 나타납니다. 사지 새싹이 발생한 후, (1) 근위 원위 축 ([PD] 어깨에서 손가락까지), (2) 등 - 복부 축 ([DV]손등에서 손바닥까지), (3) 전방 - 후부 ([AP] 엄지 손가락에서 손가락까지)의 세 축이 인식됩니다. 근위 - 원위 축은 사지 새싹의 원위 끝에 위치한 정점 외배엽 능선 (AER)에 달려 있습니다. AER은 신호2,3을 수신하는 세포의 성장, 생존 유지, 증식 및 미분화 상태에 요구된다. 한편, 편광 활동 영역(ZPA)은 전후 패터닝(4)을 제어하고, 등쪽 및 외배엽은 등쪽 패터닝(7,8
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프로토콜
이 연구는 Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexico City, Mexico)의 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 기관 검토위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다. 이 프로토콜의 일반적인 단계에 대한 개략적인 순서도가 그림 1A에 나와 있습니다.
1. 배아 배양 및 생존력 결정
- 수정 된 닭 알을 22 HH 단계에 도달 할 때까지 약 38 ° C 및 60 % 상대 습도에서 약 3 일 반 동안 배양하십시오 (Hamilton and Hamburger, 1951에 따르면)16.
참고 : 갓 수정 된 닭고기 달걀은 최대 일주일 동안 15 ° C에서 보관할 수 있습니다.- 수정 된 난자를 배양하려면 뾰족한면을 가습 인큐베이터에 수직으로 놓습니다. 발달하는 배아가 껍질 막에 달라 붙는 것을 막을 필요가 있으므로 배양 중에 알을 회전시킵니다.
참고 : 수정 된 암탉 알은 지역 농장에서 얻을 수 있습니다. 수정 된 화이트 레그혼 닭 알은 일반적으로 후기 배아에서 깃털의 ....
- 수정 된 난자를 배양하려면 뾰족한면을 가습 인큐베이터에 수직으로 놓습니다. 발달하는 배아가 껍질 막에 달라 붙는 것을 막을 필요가 있으므로 배양 중에 알을 회전시킵니다.
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결과
잘 수행 된 재조합 사지를 인식
이식 후, 조작된 배아를 인큐베이터로 복귀시켜 RL이 발달할 수 있도록 하였다. 배양 시간은 실험의 요구 사항과 상관 관계가 있습니다. 그럼에도 불구하고, RL은 이식 12시간 후에 쉽게 구별될 수 있다. 이식이 적절한지 여부를 결정하기 위해, RL을 공여체 배아의 중배엽 벽에 단단히 부착시킨 돌출부로서 관찰하였다(도 2A). 반대로, 세포 생존성 및/또는 이식편이 실패하였든, RL은 중배엽 벽으로부터 분리되거나 거친 형태를 나타내었다(도 2B).
재조합 팔다리의 형태 학적 및 패턴 검사
형태학적 검사를 위해, RL을 Alcian blue17 로 염색하여 골격 요소의 형성과 이들의 패터닝을 관찰하였다. 절차 중에 RL이 누락되지 .......
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토론
일반적으로, RL 프로토콜은 다섯 단계로 나눌 수 있다: (1) 배아 배양, (2) 외배엽을 채우기 위한 사지 중배엽 세포 획득, (3) 외배엽을 얻는 것, (4) 외배엽 덮개 내부에 중배엽 세포를 조립하는 것, 및 (5) 채워진 외배엽을 숙주 배아로 이식하는 것. RL 기술의 주요 한계는 길고 상세한 프로토콜이며, 이는 적절하게 수행하기 위해 인내심이 필요한 많은 중요한 포인트를 가지고 있습니다. 프로토콜을 성공적으로 완료하려면 중요한 순간을 식별해야 합니다. 중배엽 세포 조달 동안, 세포의 완전성과 생존 가능성은 필수적입니다. 세포 사멸은 적절한 RL 발달을 방해할 것이다. 비슷한 맥락에서 중배엽과 외배엽 세포 간의 상호 작용을 보장하기 위해 올바른 외배엽 조작이 필요합니다. 외배엽이 채워질 때, 중배엽 세포는 AER 아래의 원위 외배엽에 가능한 한 가까이 있어야 한다. 중배엽 및 외배엽 조달을 위해서는 기증자 배아의 발달 단계도 중요합니다. 중배엽 세포는 발달 단계에 따라 차별적으로 반응 할 것이라고 생각해야합니다. 그러나.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
그림 2의 이미지를 주신 Estefania Garay-Pacheco와 작품에 대한 Maria Valeria Chimal-Montes de Oca에게 감사드립니다. 이 작품은 Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [보조금 번호 IN211117 및 IN213314] 및 Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [보조금 번호 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia]가 JC-M에 수여했습니다. JC M-L은 Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887)로부터 박사후 펠로우십을 받았다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| 각진 슬릿 나이프 | Alcon | 2.75mm DB | |
| 무딘 집게 | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| 콜라겐 분해 효소 IV 유형 | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| 계란 부화기 | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| 태아 소 혈청 | Gibco | 16000069 | |
| Fine 수술용 집게 | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| 행크스 균형 잡힌 소금 용액 | Sigma | H6648 | |
| 마이크로 원심분리기 | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| 팔라듐 와이어 | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| 페트리 접시 | 둥지 | 705001 | |
| 피펫 | crmglobe | PF1016 | |
| 실체 현미경 | Zeiss | Stemi DV4 | |
| 테이프 | NA | NA | |
| 트립신 돼지 | Merck | 9002 07-7 | |
| 텅스텐 바늘 | GoodFellow | E74-15096/01 |
참고문헌
- Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm. Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).
- Mahmood, R., et al.
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