Soaked-Bead Assay를 사용한 닭 배아 발생 동안의 세포 분화, Morphogenesis, 및 패터닝 분석

Summary

침지된 비드 분석은 세포 분화 및 형태형성의 조절을 연구하기 위해 임의의 발달 시점에서 시험 시약의 표적화된 전달을 포함한다. 세 가지 다른 유형의 침지 된 구슬을 준비하고 닭 배아의 교차 숫자에 이식하기위한 모든 실험 동물 모델에 적용 가능한 상세한 프로토콜이 제시됩니다.

Abstract

배아 발달 중에 다수의 유전 프로그램이 활성화되어 세포 분화를 조율하여 체세포, 조직 및 장기의 놀라운 다양성을 생성합니다. 이러한 유전 프로그램의 정확한 활성화는 다른 역치에서 세포 운명을 지시하는 모르포겐, 확산성 분자에 의해 조절됩니다. 유전자 활성화가 형태 형성을 어떻게 조정하는지 이해하려면 개발 중에 모르포겐에 의해 유발 된 지역 상호 작용에 대한 연구가 필요합니다. 배아의 뚜렷한 영역에 이식 된 단백질 또는 약물에 담근 구슬을 사용하면 숫자 및 기타 발달 과정의 확립에서 특정 분자의 역할을 연구 할 수 있습니다. 이 실험 기술은 세포 유도, 세포 운명 및 패턴 형성의 제어에 대한 정보를 제공합니다. 따라서,이 흠뻑 젖은 비드 분석은 다른 배아 모델에 적용 할 수있는 매우 강력하고 가치있는 실험 도구입니다.

Introduction

배아 발달 동안 유전자 발현을 조절하는 분자 메커니즘의 돌파구는 우리가 세포 운명이 어떻게 결정되는지 이해할 수있게 해주었습니다. 상이한 세포 계보에 대한 헌신은 일단 세포가 전사 인자¹의 분자 발현을 시작하면, 발생한다. 이러한 발현 패턴은 공간과 시간에서 고도로 조정되고, 따라서 세포, 조직 및 기관 1,2,3,4,5의 형성, 포지셔닝 및 패터닝을 지시한다. 배아 유도는 세포의 잠재력을 제한하는 계층 구조를 확립함으로써 세포가 특정 혈통에 전념하는 과정이며, 이는 심지어 Spemann 주최자 ^6,7에서 발생하는 기본 신체 계획의 생성을 포함합니다. 배반포어 등쪽 입술은 숙주 배아 ^8,9에서 두 번째 배아 축을 유도한다. 오늘날, 그래프팅 및 분자 ....

Protocol

이 연구는 Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexico City, Mexico)의 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 기관 검토위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 계란 배양 및 배아 준비

참고 : 수정 된 암탉 알은 지역 농장에서 얻을 수 있습니다. 수정 된 화이트 레그혼 닭고기 알이 가장 일반적으로 사용됩니다. 갓 수정한 닭고기 알을 배양하기 전에 최대 1주 동안 15°C에서 보관하십시오.

1. 수정한 닭 알을 28 HH 단계에 도달할 때까지 38°C 및 70% 상대 습도의 가습 인큐베이터에서 뾰족한 면을 아래로 아래로 수직으로 인큐베이션한다(해밀턴 및 햄버거에 따르면 약 5.5일, 1951)²². 배양 중에 난자를 회전시켜 배아가 껍질 막에 부착되는 것을 방지하십시오.
   참고 : 발달 단계의 선택은 실험 목표에 의해 통보됩니다. 이 경우, 28 HH 단계는 자궁외 숫자를 유도하거나 세포 사멸을 촉진하기 위해 인터디지트 비드 이식에 최적이다.
2. 인큐베이터에서....

Results

젖은 구슬을 사용하여 배아 병아리 사지의 세포 거동 평가
이 분석의 효능을 보장하기 위해, 비드는 일관되고 정확하게 정확한 위치에 배치되어야 한다; 이 경우, 원위-정점 외배엽 능선 AER 아래의 세 번째 자릿수의 대부분이다(그림 1A). 이 포지셔닝은 문제의 분자가 인터디지털 조직 전체에 동등하게 확산 될 수있게합니다. 또한, AER 아래의 구역에는 치료에 쉽게 반응하는 미분화 세포가 포함되어 있습니다. 세포 분화에 대한 효과를 평가하기 위해, 배아는 골격 요소의 형성을 증거하기 위해 알시안 블루 및 알리자린 레드로 염색될 수 있다(도 1B). 침지된 비드 분석은 또한 중성 적색(도 1C)을 사용한 세포 사멸 및 계내 혼성화에 의한 유전자 조절(도 1D)을 평가하는.......

Discussion

이 프로토콜에 자세히 설명된 실험 도구의 주요 장점은 주어진 실험 분자에 담근 비드에 대한 노출의 시간 및 위치를 제어할 수 있다는 것입니다. 정확한 포지셔닝과 정확한 발달 타이밍을 결합하면 세포 분화 과정을 연구 할 수있는 엄청난 가능성을 제공합니다. 미분화 조직에서 이러한 실험을 수행하면 세포 계보에서 첫 번째 중요한 사건을 조사 할 수 있습니다. 예를 들어, TGFß-담근 비드를 배아 사지 28 HH의 인터디지털 조직에 배치하면 마스터 Gen Sox9²⁵의 유전적 발현을 유도하는 분자 캐스케이드가 촉발되는 자궁외 디지트의 형성이 초래된다. 놀랍게도, 유도 된 연골 조직은 또한 지골 형성과 함께 숫자로 조직됩니다.

흥미롭게도, RA는 미분화된 세포의 세포 운명을 세포 사멸⁽¹⁰)로 향하게 하는 골형성 단백질의 유전자 발현을 조절함으로써 동일한 인터디지털 영역에서 세포 사멸을.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affi-Gel Blue Gel beads	Bio-Rad	153-7302
AG1-X2 beads	Bio-Rad	1400123
Egg incubator	Incumatic de Mexico Incumatic	1000
Fine surgical typs	Fine Science Tools	9115-10
Heparine Sepharose beads	Abcam	ab193268
Petri dish	Nest
실체 현미경	Zeiss	Stemi DV4
테이프	NA	NA
텅스텐 바늘	GoodFellow	E74-15096/01