방법 논문

Zebrafish Embryos에서 Single-Somite Explant의 준비

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DOI:

10.3791/63196

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2022년 6월 17일

 , 
1Institute of Bioengineering, École polytechnique fédérale de Lausanne (EPFL)

이 논문에서

요약

우리는 제브라피시 배아에서 단일 소미트를 분리하기 위한 프로토콜을 제시하며, 형광 타임 랩스 현미경으로 몇 시간 동안 배양에서 역학을 추적할 수 있으므로 단일 세포 해상도에서 조직 규모 모양 변화를 정량화하는 방법론을 제공합니다.

초록

척추동물 배아의 몸축은 주기적으로 소미트(somites)라고 하는 3차원 다세포 단위로 세분됩니다. 유전적 진동과 분자 전치패턴이 소미트의 초기 길이 척도를 결정하는 반면, 기계적 과정은 최종 크기와 모양을 설정하는 데 관련되어 있습니다. 소마이트의 고유한 재료 특성을 더 잘 이해하기 위해 제브라피시 배아에서 단일 소마이트 외식물을 배양하는 방법이 개발되었습니다. 단일 소미는 먼저 배아의 피부를 제거한 다음 난황을 제거하고 주변 조직을 순차적으로 절제하여 분리합니다. 형질전환 배아를 사용하여 다양한 세포 내 구조의 분포를 형광 타임랩스 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 이식된 솜씨의 역학을 몇 시간 동안 추적할 수 있으므로 단일 세포 해상도에서 조직 규모 모양 변화를 연구하기 위한 실험적 프레임워크를 제공할 수 있습니다. 이 접근 방식은 체미트의 직접적인 기계적 조작을 가능하게 하여 조직의 재료 특성을 해부할 수 있습니다. 마지막으로, 여기에 설명된 기술은 노토코드(notochord), 신경판(neural plate) 및 측판 중배엽(lateral plate mesoderm)과 같은 다른 조직을 이식하기 위해 쉽게 확장할 수 있습니다.

서론

척추동물의 성인 근골격계의 대부분은 배아의 몸축을 따라 주기적이고 리드미컬한 방식으로 형성되는 배아 소미트(embryonic somites)에서 나온다 1,2. 소미트는 3차원(3D) 다세포 단위로, 일반적으로 중간엽 세포의 내부 코어와 피브로넥틴이 풍부한 세포 외 기질로 둘러싸인 주변 상피층으로 구성됩니다3. somites의 형태, 즉 크기와 모양은 부분적으로 segmentation clock과 downstream molecular prepattern에 의해 결정됩니다. 그러나 지난 10년 동안 기계적 신호와 힘이 somite formation 5,6,7을 촉진하는 것 외에도 segmentation clock4를 조절하는 데 중요한 역할을 하고 초기 somite formation8 이후 somite length의 정밀도 증가를 보장하는 것이 나타났습니다.

조직 역학은 새로운 도구9의 가용성과 함께 생체 내에서 직접 연구할 수 있지만, 물리적 과정의 기초가 되는 완전한 그림을 얻기 위해서는 조직의 고유한 재료 특성을 동시에 연구해야 합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 세포에서 조직 스케일에 이르는 물리적 특성을 배아와 분리하여 연구할 수 있는 단일 소미트를 준비하기 위한 간단한 접근 방식을 제공합니다. 유사한 발달 단계에서 외식(explant)을 준비하기 위한 여러 프로토콜이 존재하지만, 10,11,12,13,14, 우리가 아는 한, 이것은 단일 솜미트의 분리를 설명하는 첫 번째 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 구현하기 간단하며 배아를 다루는 대부분의 제브라피시 실험실에서 사용할 수 있는 기본 장비만 필요합니다.

형태학적 솜 형성에서 역학의 역할을 구분하는 데 도움이 되도록 제브라피시 배아에서 단일 솜 외식물을 배양하는 방법이 개발되었으며, 이는 솜이트의 고유한 재료 특성을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜은 수정 후 1일 미만의 살아있는 척추동물 배아를 사용하는 것을 포함합니다. 모든 실험은 자유롭게 짝짓기를 하는 성체에서 유래한 배아를 사용하여 수행되었으며, 따라서 스위스 보 주의 Service de la Consommation et des Affaires Vétérinaires(승인 번호 VD-H23)에서 부여한 EPFL의 일반 동물 실험 라이센스에 따라 적용됩니다.

1. 해부 전

  1. 관심 있는 이형접합 형질전환 계통의 십자가에서 배아를 얻습니다. 2-3개의 소미트를 이식하기 위해서는 일반적으로 몇 개의 배아만 필요합니다. 이 프로토콜에서는 하나의 배아를 사용하여 하나의 솜마이트를 이식했습니다.
  2. 2개의 50x 스톡에서 1x E3 버퍼를 준비합니다: 스톡 1에는 0.458mM Na2HPO4, 0.042 mM KH2PO4, 4.084 mM NaCl, 0.128 mM KCl이 포함되어 있고 스톡 2에는 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4가 포함되어 있습니다. 증류수 480mL와 50x 스톡(50x stock 2개) 각각 10mL를 혼합하여 1x E3 버퍼 500mL를 준비합니다.
  3. 같은 날에 해부하는 경우, 33°C의 페트리 접시에 담긴 E3 배지 25mL의 배아를 3-솜마이트 단계까지 배아를 배아를 배양합니다. 다음 날 아침에 해부하는 경우, E3 배지에서 28°C에서 실드 단계까지 배아를 배양한 후 19°C로 옮겨 하룻밤 배양을 합니다.
  4. 쉴드 스테이지 또는 다른 쉴드 스테이지를 식별하려면 약 0.67x에서 4.5x까지 배율 범위를 조정할 수 있는 표준 실험실 실체현미경을 사용하십시오.
  5. 해부에 필요한 도구와 시약을 조립합니다.
    1. Aliquot Leibovitz의 L-15 배지를 50mL 튜브에 담아 냉장고에 보관합니다. 냉장고에 있는 것과 동일한 부분 표본을 최대 2회 사용하는 것이 좋습니다.
    2. 자석 교반기를 사용하고 온도를 85°C로 유지하여 L-15 배지에 2% 아가로스 50mL를 준비합니다. 용해되면 용액을 실온에서 보관하십시오.
    3. 자석 교반기를 사용하고 온도를 85°C로 유지하여 L-15 배지에 2% 저융점 아가로스 25mL를 준비합니다. 용해되면 1.5mL 튜브에 용액을 분취하고 4°C에서 보관합니다. 이것은 이미징 챔버를 준비하는 데 사용됩니다.
    4. 용융된 2% 아가로스를 20mm 페트리 접시에 접시 깊이의 1/3이 채워질 때까지 붓고 아가로스 용액이 응고되도록 합니다. 이 페트리 접시에서 해부가 수행됩니다. 아가로스 코팅이 된 페트리 접시를 미리 준비하고 4°C에서 보관하십시오.
    5. 배아 이식을 위한 파스퇴르 피펫, 배아 제거를 위한 한 쌍의 집게, 배아의 피부를 제거하기 위한 한 쌍의 미세한 집게, 배아를 절개하기 위한 마이크로 나이프, 외식물을 이미징 챔버로 옮기기 위한 방화 유리 피펫.
    6. 유리 피펫을 100% 에탄올로 15분 동안 멸균하고 L-15 배지 5mL를 위아래로 피펫팅하여 두 번 헹굽니다.
    7. 속눈썹이나 눈썹의 머리카락을 유리 모세관에 붙여서 속눈썹 도구를 준비합니다.
  6. 약 0.63배에서 6.3배까지 배율 범위를 조정할 수 있는 형광 입체경과 표준 GFP 및 RFP 필터를 사용하여 양성 형질전환 배아를 분류하고 E3 배지가 있는 별도의 페트리 접시로 옮깁니다.

2. 단일 솜 외식 준비

  1. 2개 또는 3개의 배아를 10mL의 L-15 배지로 채워진 아가로스 코팅된 접시(1.5.4단계에서 제작)로 옮깁니다. 배아를 이식하기 전에 L-15 배지와 함께 접시가 인큐베이터에서 28분 동안 30°C로 예열되었는지 확인하십시오.
  2. 한 쌍의 집게로 배아를 조심스럽게 분리하십시오(그림 1 A, B). 집게 중 하나로 융모막을 잡고 두 번째 집게를 사용하여 첫 번째 집게가 위치한 위치 근처에서 합창단을 꼬집고 당깁니다.
  3. 이 단계를 한 번 더 반복하여 융모막을 넓게 연 후 배아를 부드럽게 밀어낼 수 있습니다. 결핵 형성 중에 배아가 손상되거나 압착되지 않았는지 확인하십시오.
  4. 배아를 옆으로 향하게 하고 가는 집게 중 하나로 배아의 머리와 꼬리 사이의 피부를 잡습니다. 두 번째 가는 집게를 사용하여 첫 번째 집게가 아직 위치한 위치에 가까운 피부를 꼬집습니다.
  5. 피부를 잡고 두 개의 집게를 서로 멀리 움직여 큰 구멍을 만듭니다. 피부에서 집게 중 하나를 풀고 두 번째 집게가 잡히는 곳 가까이로 이동하고 피부가 소마이트 형성 영역에서 제거될 때까지 피부 제거 과정을 반복합니다.
    참고: 이식할 솜털 주변의 피부를 완전히 제거하는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 프로토콜의 후반 단계에서 더 미세한 해부를 수행하기가 어려워집니다.
  6. 마이크로 나이프를 사용하여 노른자를 긁어내고(그림 1C - 피부를 제거하고 노른자를 긁어낸 채로 심음) 다음과 같이 일련의 절개를 만듭니다.
    1. 첫 번째 절단은 배아의 첫 번째 형태학적 소마이트의 앞쪽에 있고 두 번째 절단은 가장 최근에 형성된 소마이트의 뒤쪽에 있는 배아를 절단합니다(그림 1D). 관심 있는 솜씨의 뒤쪽과 앞쪽을 한 번 더 자릅니다(그림 1E).
    2. 마이크로 나이프를 사용하여 배아의 이식된 부위에 남아 있는 노른자를 긁어냅니다. 외식이 마이크로 나이프에 끼일 가능성을 줄이기 위해 가능한 한 많은 노른자를 제거하십시오. 이런 일이 발생하면 속눈썹 도구를 사용하여 마이크로 나이프를 배지에 담근 상태에서 외식식물을 용액으로 다시 이동합니다.
    3. 외식물을 등쪽에 배치하고 노토코드를 통해 전후 축을 따라 한쪽 면의 소미에 가깝게 슬라이스를 만듭니다(그림 1F, G).
    4. 노토코드(notochord)가 없는 외식동물을 취하고 소마이트(somites)에 가까운 측판 중배엽(LPM)을 자릅니다.
      참고: 이 단계는 이전 단계와 교환할 수 있습니다. 즉, LPM을 먼저 슬라이스한 다음 노토코드를 슬라이스하는 것과 동일하게 잘 작동합니다.
  7. 이식할 소마이트를 선택하고 각각 소마이트의 후방과 전방에 두 개의 슬라이스를 만듭니다(그림 1H).
  8. 마지막으로 속눈썹 도구를 사용하여 소마이트를 90° 회전하여 소마이트에 여전히 부착된 신경판을 시각화합니다. 소마이트(somite)와 신경판(neural plate) 사이에 슬라이스를 만들어 단일 소마이트를 방출합니다(그림 1I).
    참고: 신경판은 2.6.4단계 직후, 즉 노토코드(notochord)와 LPM을 제거한 후 그리고 이웃 소미트(somites)에서 소마이트를 해부하기 전에 제거할 수도 있습니다.

3. 단일 솜 외식(single-somite explants) 이미징

참고: 여기에서는 단일 뷰 광시트 현미경을 사용하여 단일 소마이트 외식근을 이미징하는 절차에 대해 설명합니다. 대안으로, 외식된 단일 소미트는 컨포칼 현미경에서 이미지화할 수도 있으며, 이는 더 널리 사용 가능하며 외식의 전반적인 형태를 따르는 데만 관심이 있는 경우 광시야 현미경에서도 이미징할 수 있습니다.

  1. 다음과 같이 이미징 챔버를 준비합니다.
    1. 1mL 주사기에 실리콘 고무 제형을 채웁니다. 입에서 약 1cm 떨어진 곳에 200μL 피펫 팁을 자르고 주사기를 피펫 팁에 삽입합니다.
    2. 미리 절단된 플루오르화 에틸렌 프로필렌(FEP) 멤브레인 스트립(그림 2A-C)으로 멤브레인 홀더를 수동으로 감싸고 이미징 챔버를 서로 꼭 맞는 멤브레인 홀더에 고정합니다(그림 2D).
    3. 챔버와 멤브레인의 교차점을 따라 실리콘 고무 제형을 추가하고 밤새 건조시켜 멤브레인이 챔버에 달라붙을 수 있도록 합니다. 외식 실험 1시간 전에 멤브레인 홀더를 제거합니다.
    4. L-15 배지로 만든 0.5mL의 2% 저융점 아가로스를 함유한 부분 표본을 75°C에서 10분 동안 가열합니다. 가열된 저융점 아가로스 160μL를 챔버 중앙에 추가하고 아가로스에 이미징 몰드를 배치하고(그림 2E, F) 아가로스가 응고될 때까지 똑바로 세웁니다.
    5. 가열된 저융점 아가로스 160μL를 금형의 양쪽 끝에 추가로 첨가하고 전체 장치를 30분 동안 4°C로 옮깁니다.
    6. 600μL의 L-15 배지를 챔버에 추가하고 집게로 챔버에서 금형을 제거합니다. L-15 매체가 있는 챔버가 실온으로 돌아올 때까지 기다립니다.
  2. 광택이 나는 유리 피펫으로 이식된 소마이트를 이미징 챔버로 옮기고 속눈썹 도구를 사용하여 엑스플란트를 챔버 중앙에 배치합니다.
  3. 제조업체의 지침에 따라 이미징 레이저를 정렬하고 이미징 챔버를 배양 챔버가 장착된 현미경으로 조심스럽게 옮겨 외식을 28°C로 유지합니다.
  4. 형질전환 라인의 관심 영역과 두 번째 레이저 정렬을 수행한 다음 타임 랩스 이미징을 위해 원하는 z-스택, 시간 간격 및 기간을 설정합니다. 이 실험에서는 간격이 2μm이고 프레임 간격이 2분인 70개의 z 슬라이스를 획득합니다.
  5. 561nm(10% 레이저 출력, 100ms 노출) 및 488nm 레이저(10% 레이저 출력, 100ms 노출)로 외식의 이중 색상 광시트 이미징(그림 1J)을 수행합니다. 이 프로토콜에서 신호는 25x/1.1 NA 대물렌즈와 561/25nm 및 525/50-25 대역 통과 필터를 통해 각각 sCMOS 카메라에 수집되었습니다.

결과

외식을 통해 3D에서 대규모 형상 변화를 정량화할 수 있습니다. 이를 설명하기 위해, 우리는 Utr::mCherry (Tg(actb2:mCherry-Hsa.UTRN); e119Tg)와 H2B::GFP (Tg(h2az2a:h2az2a-GFP); kca6Tg) 이형접합 계통 사이의 교배에서 얻은 초기 제브라피시 배아에서 솜메테 4(N = 3)를 이식했습니다. Utrophin은 액틴 결합 단백질이며, Utr::mCherry 라인은 필라멘트 액틴 구조의 분포를 보여줍니다. 이 전이유전자는 여기에서 세포 윤곽에 대한 마커로 사용되었습니다. H2B::GFP는 형광 태그가 지정된 히스톤이며 결과적으로 염색질의 분포를 표시하여 핵 위치 및 모양에 대한 효과적인 설명과 세포 분열을 강조하는 유사분열 수치를 제공합니다.

이미징 중 이식 프로토콜의 성공을 평가했습니다. 우리는 해부 중 손상된 솜밭에서 솜뮈 조직의 무결성이 손상되어 많은 세포가 이식된 솜멩이에서 해리 및 돌출되거나 많은 세포가 죽는 것을 관찰했는데, 이는 핵 채널에 단편화된 핵의 존재로 알 수 있습니다. 성공적인 외식은 4-6시간 동안 건강하게 유지된 후 세포가 외식에서 분리되어 사멸하면서 소마이트 무결성의 변화가 관찰되었습니다.

유트로핀 채널에서는 10μm마다 간격을 둔 z-슬라이스에 대해 MATLAB(R2018b)에서 외식의 수동 분할을 수행했습니다. 우리는 MATLAB에서 세분화를 위한 사용자 지정 알고리즘을 개발했으며, 이 알고리즘은 무료로 다운로드(https://github.com/sundar07/SomSeg)할 수 있습니다. 알고리즘에서 세그먼트화할 파일, 프레임 및 z-슬라이스를 설정할 수 있으며, 이어서 사용자 프롬프트를 사용하여 관심 영역 주위의 윤곽선을 수동으로 그릴 수 있습니다. 이것은 여러 z-슬라이스에 대해 반복되고 플롯되었으며, 이는 3D에서 시간 경과에 따른 외식의 반올림을 보여주었습니다(그림 3A). 또한, 핵 채널을 이용한 조직 형태에 대한 보완적인 정보도 얻었다. 이를 위해 FIJI15 플러그인인 Mastodon(버전 1.0.0-beta-19, https://github.com/mastodon-sc/mastodon)을 사용하여 스폿 검출을 통해 핵 중심 위치를 얻었습니다. 먼저 FIJI에서 현미경의 tif 파일을 xml/hdf5 형식으로 변환한 다음 Mastodon 플러그인을 사용하여 새 프로젝트를 열었습니다. 플러그인에서 우리는 반점 감지 옵션을 선택했으며, 여기서 외식을 포함하는 관심 영역을 정의하고 반점 감지를 위해 직경 5μm와 품질 계수 25의 가우스 검출기의 차이를 사용했습니다. 그런 다음 핵 중심 위치를 MATLAB으로 전송하고 내장 함수(convhull)를 사용하여 외식의 기하학을 특징짓는 볼록 껍질(그림 3B)을 얻었습니다. 이것은 유사하게 시간이 지남에 따라 외식의 반올림을 보여주었습니다(그림 3B). 핵 데이터는 또한 3D로 추적하여 세포 움직임을 정량화하고 시간 경과에 따른 세포 수 변화를 가능하게 합니다. 다른 한편으로, 유트로핀 채널(utrophin channel)은 외식이 둥글어짐에 따라 세포 모양의 변화를 정량화할 수 있습니다. 이러한 매개변수는 함께 소마이트의 고유한 재료 특성을 특성화하는 데 유용하며, 이는 조직 규모 모양 변화에 대한 효과적인 물리적 설명을 개발하는 데 도움이 됩니다.

외식은 또한 정량적 방식으로 주변 조직과의 접촉 응력을 특성화할 수 있습니다. 이를 설명하기 위해 두 개의 솜씨를 수동으로 분리하여 가까이 배치하고 역학(N = 2)을 관찰했습니다. 이 실험에서는 in vivo body 축에 대한 somites의 방향을 추적하지 않았습니다. 흥미롭게도, 시간이 지남에 따라 외식된 솜암은 한 표면을 따라 서로 부착되는 반면, 자유 표면, 즉 접촉 부위에서 멀리 떨어진 영역은 반올림되었습니다(그림 4). 이는 접착력이 외식의 접촉 부위에서 표면 장력에 의해 생성된 응력을 극복한다는 것을 시사합니다. 이는 위에서 설명한 바와 같이 다음과 같은 형상 변화를 따르고 3D에서 시간 경과에 따른 두 조직 간의 접촉각을 정량화하여 추가로 특성화할 수 있습니다. 따라서 외식은 특정 조직 모양으로 이어지는 작용 중인 경쟁력을 정량화할 수 있는 매력적인 시스템을 제공하며, 그 의미는 생체 내에서 탐구될 수 있습니다.

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그림 1: single-somite explants의 준비. 제브라피시 배아(A)를 먼저 제거하고(B) 피부와 노른자(C)를 제거합니다. 그런 다음 배아의 소진트 함유 부위를 나머지 조직(D, E)을 제거하여 선택합니다. 그런 다음 관심 솜 주위의 영역을 연속적으로 제거(F-H)하여 궁극적으로 단일 솜마이트(I)를 분리한 다음, 광시트 현미경(여기에 표시된 솜마이트의 중간 z-섹션)을 사용하여 타임 랩스 이미징을 수행합니다(J). 약어: S = somite; N = 노토코드; LPM = 측판 중배엽; A = 전방; P = 후방. 파선은 절단 위치를 나타냅니다. 스케일 바 = 모든 패널에서 50μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 광시트 이미징 챔버의 조립. (A-D) FEP 멤브레인 스트립((B)의 치수)이 멤브레인 홀더를 감싸고 이미징 챔버에 장착되고 멤브레인은 이미징 챔버에 접착됩니다. (E-F) 다음 날, 멤브레인 홀더를 제거하고 이미징 몰드((E)의 치수)를 저융점 아가로스의 이미징 챔버 중앙에 배치합니다. 전체 장치를 4°C에서 30분 동안 유지한 후 금형을 제거하고 트로프가 있는 챔버를 이미징 외식에 사용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 조직 모양의 3D 분석. (A) 세포 윤곽은 형광 표지된 유트로핀(Utr::mCherry)으로 시각화하고 핵은 형광 표지된 히스톤(H2B::GFP)으로 시각화했습니다. 외식의 윤곽선은 MATLAB을 사용하여 여러 깊이에서 수동으로 분할하여 여기에 표시했습니다. (B) FIJI 플러그인인 Mastodon을 사용하여 동일한 외식에서 핵(빨간색)을 검출하고 외식의 기하학을 알려주는 볼록한 선체(청록색)를 적용했습니다. 참고: 외식의 반올림은 두 분석 모두에서 분명합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 외식된 솜털은 서로 부착됩니다. 배아에서 분리되어 수동으로 가까운 곳에 배치된 두 개의 솜털은 시간이 지남에 따라 달라붙는 경향이 있습니다(N = 2). 프레임 간격이 2분인 여러 z-슬라이스를 광시트 현미경을 사용하여 획득했으며 선택한 시점의 솜미트의 중간 부분이 여기에 표시됩니다. 세포 윤곽은 형광 태그가 지정된 Utrophin (Utr::mCherry)으로 시각화되었습니다. 스케일 바 = 25μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

체형성(somitogenesis) 분야는 배아 발달 중 분절 길이를 설정하는 데 있어 분할 시계(segmentation clock)의 역할에 대한 연구에 의해 지배되어 왔습니다. 그러나 최종 소마이트 형태학을 결정하는 데 있어 조직 역학의 역할을 고려하는 것도 마찬가지로 중요합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 고유한 물리적 특성을 배아와 분리하여 연구할 수 있는 단일 소미트를 이식할 수 있습니다. 그러나 수동 준비는 일반적으로 준비되는 솜의 수를 이미징 세션당 4-6개로 제한합니다. 이 프로토콜은 조직 제거를 용이하게 하기 위해 효소를 사용하지 않고 배아의 여러 조직을 주의 깊게 미세 해부하는 것을 포함하기 때문에 해부 과정을 마스터하는 데 몇 주간의 연습이 필요할 수 있습니다. 우리 손에서 프로토콜의 중요한 단계는 외식에서 피부와 노른자를 조심스럽게 제거하는 것인데, 이는 프로토콜의 여러 단계에서 외식이 사용된 도구에 달라붙는 것을 방지하고, 다시 더 쉽게 해부하여 솜씨를 둘러싼 조직을 연속적으로 제거할 수 있도록 합니다.

박리 프로토콜은 주변 조직 중 하나에만 부착된 소체를 얻거나 소마이트 그룹의 외피를 얻기 위해 중간 단계에서 중단할 수 있습니다. 이는 조직을 연속적으로 제거하고 소마이트 또는 주변 조직의 모양 변화를 촉진하는 데 있어 주변 조직의 영향을 연구할 수 있는 강력한 방법을 제공합니다. 다른 한편으로는, 이 프로토콜을 사용하면 두 개의 이식된 솜씨를 가까이 배치함으로써 입증된 바와 같이 개별 이식된 조직이 부착되고 기계적으로 자체 조직화될 수 있습니다.

이 방법으로 준비된 외식은 최대 몇 시간의 기간 동안 생존을 보장하기 위해 완충액 또는 제약 조건에 추가 성분이 필요하지 않습니다. 그러나 하이드로겔에서 이를 배양하고 외부 제약이 있는 상태에서 역학을 따르는 것을 상상할 수 있으며, 이는 생체 내에서 소미트가 직면하는 접촉 응력에 대한 모델이 될 수 있습니다. 또한, 외식은 원자력 현미경, 피펫 흡인 또는 마이크로 로봇 도구16을 사용하여 재료 특성을 직접 조사할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 이 방법이 노토코드(notochord), 신경판(neural plate) 및 측판(lateral plate mesoderm)과 같은 유사한 단계에서 다른 발달 조직을 배양하고 연구하는 데 쉽게 적용될 수 있을 것으로 기대합니다.

공개 사항

저자는 경쟁 이익이 없음을 선언합니다.

감사의 글

École polytechnique fédérale de Lausanne(EPFL)의 프로토콜과 어류 시설에 대한 의견을 제시해 주신 Oates 연구소 구성원들에게 감사드립니다. 특히, 해부 프로토콜에서 피부 및 난황 제거에 대한 귀중한 팁을 제공한 Laurel Ann Rohde에게 감사드립니다. Arianne Bercowsky Rama는 Mastodon을 통해 광시트 데이터 세트를 처리하기 위한 효율적인 파이프라인을 구축했습니다. Jean-Yves Tinevez는 오픈 소스 Mastodon 소프트웨어를 구축했습니다. Marko Popović는 데이터 분석에 대한 팁을 제공합니다. Chloé Jollivet, Guillaume Valentin 및 Florian Lang은 어류 시설에서 광범위한 지원을 제공했습니다. Petr Strnad와 Andrea Boni는 광시트 현미경을 제작하고 광시트 이미징에 대한 팁을 제공합니다. 이 연구는 EPFL의 지원을 받았으며 S.R.N.은 Long-Term Human Frontier Science Program 박사후 연구원(LT000078/2016)의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AgaroseSigma9012-36-6페트리 접시 바닥 코팅용
Agarose, 저겔화 온도Sigma39346-81-1Viventis 이미징 챔버 준비용
카메라AndorAndor Zyla 4.2 Plus광시트 현미경
감지 대물렌즈 NikonNikon CFI75 Apo LWD 25x/1.1 NA이미징 외식용
FEP 멤브레인 스트립Lohmann Technologies UK LtdDupont FEP 플루오로카본 필름, 200AViventis 이미징 챔버 준비용
미세 집게Dumont Dumont5SF 11252-00배아 피부 제거용
DumontDumont 55아 제거용
Leibovitz의 L-15 배지Gibco21083-027외식 배양 배지
광시트 현미경ViventisLS1 live이미징 외식용
마이크로 나이프Fine Science Tools10318-14배아 절개용
실리콘 고무 제형Wacker Chemie AGSilpuran 4200Viventis 이미징 챔버 준비용
배

참고문헌

  1. Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock. Development. 139 (4), Cambridge, England. 625-639 (2012).
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