그룹 B 연쇄상구균 (GBS)에 의해 유발된 융모양막염의 전임상 동물 모델의 제왕절개

요약

이 프로토콜의 목표는 그룹 B 연쇄상구균 (GBS)에 의한 융모양염의 전임상 동물 모델을 설명하는 것입니다. 이 연구는 기계론적 과정, 발달 장애와의 잠재적인 인과 관계를 조사하고 최종적으로 중개 항염증 태반 및 신경 보호 치료법을 개발하기 위해 고안되었습니다.

초록

B군 연쇄상구균 (GBS)은 인간의 임신 중에 분리되는 가장 흔한 박테리아 중 하나입니다. 이는 융모막염이라고 하는 태반 감염/염증의 주요 원인입니다. 융모양막염은 발달 중인 태아를 장기 손상, 주산기 이환율 및 사망률의 높은 위험에 노출시킬 뿐만 아니라 평생 신경 행동 장애 및 기타 비신경학적 발달 문제에 노출시킵니다. 모체 및 태아 조직에서 분리되는 GBS의 가장 빈번한 두 가지 하위 유형은 혈청형 Ia(13%-23%)와 III(25%-53%)입니다. 우리 연구실은 발달 중인 태아의 중추 신경계에 대한 후속 영향을 연구하고 근본적인 기계론적 측면을 이해하기 위해 GBS 유발 융모양막염의 쥐 모델을 개발하고 특성화했습니다. 이 논문은 인간에서 GBS 유발 융맥양염의 특징을 밀접하게 재현하는 전임상 쥐 모델의 설계와 용도를 제시합니다. 이 기사는 과학자들이 실험 설계를 재현하는 데 도움을 주고 문제 해결 예제를 통해 지원을 제공하는 것을 목표로 합니다. 현재 모델은 또한 융모막염으로 인해 발생하는 많은 발달 장애에서 해결되지 않은 상태로 남아 있는 원인, 메커니즘 및 새로운 치료 방법을 밝힘으로써 잠재적인 발견에 기여할 수 있습니다. 또한, 이 모델의 사용은 예를 들어 망막, 장, 폐 및 신장에 영향을 미치는 주산기 비신경학적 일반 및 중증 이환율에 대한 연구로 확장될 수 있습니다. 이 연구의 주요 관심사는 뇌성마비(CP), 주의력 결핍 과잉 행동 장애(ADHD) 및 자폐 스펙트럼 장애(ASD)와 같은 GBS 유발 태아 신경 발달 장애 분야입니다. 이 모델을 뒷받침하는 근거가 이 문서에 제시되어 있으며 그 뒤에 절차와 결과가 나와 있습니다.

서론

모계 면역 활성화(MIA)는 자손의 조산, 태아 사망, 평생 인지 및 행동 장애에 대한 가장 중요한 독립적 위험 요인 중 하나로 설명되어 왔습니다 1,2,3,4. 태반 및 발달 결과에 대한 임신성 염증의 역할에 대한 기존 전임상 연구의 대부분은 대장균의 지질다당류(LPS)와 같은 병원체 성분과 바이러스 감염을 모방하는 바이러스 이중 가닥 RNA의 합성 아날로그인 폴리이노신: 폴리시티딜산(Poly[I: C])을 사용합니다. 그러나 B군 연쇄상구균(GBS)이 주산기 감염의 가장 빈번한 원인임에도 불구하고, 염증 기전에서 B군 연쇄상구균의 역할과 그 결과를 규명한 동물 모델은 거의 없다⁵.

GBS는 임산부의 약 15%-30%에서 하부 생식기에 서식하는 캡슐화된 그람 양성 구균입니다⁶. 이는 융모양수염 ^7,8이라고 하는 태반 감염/염증을 유발합니다. 10가지 GBS 혈청형 중 가장 빈번한 두 가지 혈청형 Ia와 III은 모체 태아 조직 손상의 주요 감염 결정 요인입니다 ^9,10. GBS 감염은 태아의 혈액 및 태반 결핍에서 더 높은 염증 반응을 유발하는 것으로 나타났으며, 이는 뇌성마비(CP), 주의력 결핍 과잉 행동 장애(ADHD), 자폐 스펙트럼 장애(ASD)와 같은 여러 신경 발달 장애와 관련이 있는 것으로 의심됩니다^5,11.

지난 10년 동안 우리는 자손의 다양한 발달 장애를 유발하는 GBS 유발 융모막염의 쥐 모델을 개발했다¹². 이 전임상 모델은 GBS 유발 태반 염증과 자손의 다양한 성별 특이적 신경 발달 장애 사이의 인과 관계를 보여줍니다 13,14,15. 이 기사의 목표는 독자들에게 임신 말기 감염과 그로 인한 자손의 신경 행동 장애에 대한 전임상 쥐 모델의 설계에 대한 통찰력을 제공하는 것입니다. 본 프로토콜은 GBS에 의한 융모양염의 임상적 현실을 모방하는 것을 목표로 합니다.

이 전임상 모델의 결과는 GBS의 임신 말기 복강내 IP(IP) 접종(그림 1)이 (i) 태반 감염 및 염증을 유발하여 융모양막염의 진단 기준을 충족한다는 것을 보여줍니다¹⁶; (ii) 태반¹² 내에서 IL-1 경로로부터 IL-1β 및 다운스트림 염증 분자의 대규모 상향 조절; (iii) 자손의 신경 발달 장애¹²; (iv) 면역 반응 및 그에 따른 신경 행동 장애의 성별 차이(예: 여성 자손은 성인 ADHD와 유사한 특성을 나타내는 반면 남성 자손은 조기 발병 및 오래 지속되는 ASD와 유사한 특성을 나타냄); (v) 융모막염을 유발하는 데 사용되는 GBS 혈청형에 따라 자손에서 뚜렷한 신경행동학적 결과^14,15. 이러한 연구 결과에 따라 이 모델을 활용하는 주요 다음 단계는 첫째, GBS 유발 융모양염에서 안드로겐의 역할을 테스트하고, 둘째, 특정 염증 경로를 표적으로 하는 분자의 태반 및 신경 보호 역할을 테스트하여 이러한 분자 중 일부를 치료 임상 시험의 문턱까지 끌어올리는 것입니다.

프로토콜

모든 실험은 McGill University Health Center 연구소(RI-MUHC)의 승인을 받았습니다. 모든 실험은 캐나다 동물 관리 위원회에 따라 수행되었습니다.

1. 임신한 루이스 쥐

1. 재태일(G)14에 상업적 출처에서 루이스 쥐를 얻습니다. 20-23°C의 통제된 환경에서 12시간의 명암/어둡기 주기로 적절한 동물 시설(RI-MUHC 동물 시설)에 수용하고 물과 음식을 자유롭게 이용할 수 있습니다 ¹⁷.
2. G14(즉, 도착 당일)부터 G22(즉, 제왕절개 당일)까지 질병 행동을 감지하기 위해 매일 댐의 무게를 잰다.

2. 세균 성장

1. G18에서 멸균 BHI(Brain Heart Infusion) 육수 5mL가 든 멸균 시험관 2개를 준비합니다. -80°C에서 소량의 냉동 박테리아 스톡(BHI의 β-용혈성 캡슐형 혈청형 Ia 및 15% 글리세롤¹⁴)을 5mL BHI 튜브에 추가합니다(그림 2).
2. 튜브를 셰이커(240rpm)에 37°C에서 18시간 동안 놓습니다.
3. G19에서 1.5mL의 배양된 용액을 48.5mL 멸균 BHI 육수에 모아 멸균 BHI 육수에 3% GBS 용액을 준비합니다.
4. 3% GBS plus BHI 용액 1.5mL를 큐벳에 모읍니다. 분광 광도계를 사용하여 초기 흡수를 T₀ (광학 밀도 (OD) _{600 nm})로 기록합니다.
   알림: 분광 광도계의 균형을 맞추기 위해 매번 멸균 BHI 육수로 만든 블랭크가 사용되었습니다.
5. 3% 용액을 37°C의 인큐베이터에 넣고 약 2시간 동안 240rpm을 흔들며 0.6에서 0.8(OD_600nm) 사이의 흡광도 측정값에 도달할 때까지 2시간 후 20분마다 흡수를 확인합니다.
6. 원하는 흡광도에 도달한 후 3% GBS plus BHI 용액 20mL를 채취하여 50mL 튜브에 추가합니다.
7. 4°C에서 13분 동안 시료를 원심분리기(1792 x g)하고 침전된 GBS를 0.9% 멸균 식염수 20mL로 2회 세척합니다.
8. 침전된 GBS를 0.9% 멸균 식염수 2mL에 현탁시킵니다. 주사 할 때까지 이 부분 표본을 얼음 위에 보관하십시오.
9. 대조군에는 100μL의 멸균 0.9% 식염수를 주입하고 GBS 그룹에는 멸균 0.9% 식염수에 현탁된 100μL β용혈성 혈청형 Ia를 주입합니다.
   참고: 주입된 용량은 GBS 또는 식염수(대조용)의 10⁸ 집락 형성 단위(CFU)였습니다. 10⁸ CFU의 접종은 인간 융막양막염의 모델로 잘 확립되어 있습니다. 더 높은 용량의 GBS를 접종하면 댐 폐사를 유발할 수 있습니다. 언급된 용량보다 적게 주사하면 감염 및 염증을 모방하지 않습니다.
10. ^10-5와 ^10-10 사이의 희석액을 만들고 BHI 한천 플레이트에 희석액을 세 번 도금합니다. 오염을 배제하려면 BHI 한천 플레이트와 CHROMID Strepto B 한천 플레이트에 하나씩 두 개의 음성 대조군(물질 첨가 없음)을 만듭니다. BHI 한천 플레이트와 CHROMID Strepto B 한천 플레이트에 준비된 박테리아를 도금하여 두 가지 양성 대조군을 만듭니다. 모든 플레이트를 37°C에서 밤새 인큐베이터에 놓습니다(그림 3).
    참고: CHROMID Strepto B 한천 플레이트는 GBS 집락이 빨간색으로 나타나는 GBS를 스크리닝하기 위한 선택적 매체입니다.

3. 주입 기술

1. G19에서 케이지에서 쥐를 부드럽게 꺼내 평평한 표면에 놓습니다. 수건을 사용하여 머리와 상체를 덮어 쥐를 움직이지 못하게 합니다. 주사 부위에 쉽게 접근할 수 있도록 뒷다리를 들어 올립니다.
   알림: 주사를 위한 적절한 해부학적 영역이 복부의 오른쪽 하단 사분면에 있는지 확인하여 요로 방광 및 맹장과 같은 장기의 천공을 방지하십시오(그림 1).
2. 29G 1/2인치 바늘이 있는 U-100 인슐린 주사기를 사용하십시오. 그림 40과 같이 45-1 각도로 머리를 향해 위를 향하도록 바늘 베벨을 삽입합니다. 각 댐에 대해 GBS 주입을 한 번씩 수행합니다. 접종된 댐 사이의 시간 효과를 피하기 위해 1시간마다 주입을 수행해야 합니다.
   참고: 주사는 하루에 한 번 이상 주사를 수행하는 날에 왼쪽과 오른쪽을 번갈아 주사해야 합니다.

4. 용량 측정

1. G20에서 4개의 대조군을 확인하고(10.2단계) 각 BHI 한천 플레이트의 박테리아 콜로니를 계산합니다.
2. GBS의 정확한 주입 용량을 결정하기 위해 각 희석 계수(^10-5 - ^10-10)에 대한 평균 GBS 집락을 계산합니다.

5. 제왕절개 및 조직 채취

1. G22(주입 후 72시간)에서 제왕절개를 시행하고 각 댐의 접종 시간에 따라 댐 사이에 1시간 간격으로 후속 수술을 수행합니다.
2. 전신 마취_{를 위해 2}% 이소플루란과 1.5% O₂로 안락사 챔버에서 댐을 마취합니다.
3. 적절한 수술용 드레싱으로 덮인 가열 패드에 댐을 놓고 안과 연고를 눈에 바르면 건조를 피할 수 있습니다.
4. 칼날이나 메스를 사용하여 하복부의 털을 제거하여 수술 부위를 준비합니다.
5. 소독제를 적신 멸균 거즈로 수술 부위를 청소하십시오.
6. 멸균 메스와 끝이 가는 가위를 사용하여 쥐의 하복부를 수평으로 절개합니다. 복부 양쪽을 수직으로 절개하여 밑에 있는 장기를 드러냅니다.
7. 태아에서 태반 샘플을 분리합니다. 태아의 체중, 태반, 태아/태반 비율을 기록합니다.
8. 멸균 메스를 사용하여 태반을 두 부분으로 자릅니다.
   1. 2-메틸부탄을 사용하여 태반의 절반을 빠르게 동결하고 ELISA를 사용하여 단백질 수준을 결정하는 데 필요할 때까지 -80°C로 유지합니다.
   2. 채취한 태반에서 GBS 및 다형성 핵 세포(PMN)의 발현을 연구하기 위해 면역조직화학(IHC)에 의한 현장 분석을 위해 태반의 나머지 절반을 4% 완충된 포름알데히드로 고정합니다.
9. 살아있는 태아에서 혈액을 채취하고 혈액을 리튬 헤파린 젤 분리기 튜브로 옮기기 위해 참수합니다.
10. 4°C에서 원심분리기(18,928 x g) 혈액 샘플을 사용하여 혈장을 분리하고 추가 분석이 있을 때까지 -80°C에서 혈장 샘플을 보관합니다.
    참고: 수집된 태아 혈장 샘플은 ELISA가 태아 혈액에서 다양한 사이토카인의 단백질 수치를 확인하는 데 사용됩니다.
11. 앞서 설명한 바와 같이 다음 프라이머(전방 프라이머: 5' - TAC AGC CTG AGG ACA TAT TA3'; 역방향 프라이머: 5' - GCA CTT TAA CCC TTC GAT GA -3')를 사용하여 SRY 유전자 내 서열의 증폭에 의한 태아의 성별을 결정하기 위해 태아 꼬리를 수집한다¹⁸.
12. 5mL 23G 바늘을 사용하여 심장 천자를 통해 댐에서 혈액을 채취하여 댐 혈액 내 다른 사이토카인의 단백질 수치를 확인하고 태아 혈액의 단백질 수치와 비교합니다. 댐을 다이어프램 천공과 참수 방법으로 안락사시킵니다.
    알림: 동물 사이에서 사용한 모든 기구를 멸균 조직과 멸균 식염수로 세척하십시오. 자손에서 신경 병리학 및 행동 연구를 수행하기 위해 댐은 G23에서 자연적으로 출산했습니다. 산후일(PN) 80에 자손을 안락사시킨 후, 분자 및 조직학적 연구를 위해 뇌를 채취했습니다.

결과

GBS의 IP 접종은 태반 감염을 초래했습니다.
면역조직화학(IHC)(GBS 혈청형 Ia를 표적으로 하는 다클론 항체 사용) 염색은 GBS 감염이 태반의 탈피 구획에 도달하는 것을 보여주었습니다. 감염은 또한 십이지에서 미로, 융모막판, 그리고 경우에 따라 태아로 퍼져 태아를 사망에 이르게 합니다(GBS 노출 5.8 ± 0.8 대 대조군(CTL) 새끼 9.3 ±)¹⁸. 따라서, GBS에 노출된 태아의 출생 시 깔짚 크기는 노출되지 않은 태아에 비해 감소했다¹⁸. 태반 감염 측면에서 깔짚 내 불일치가 관찰되었습니다. GBS 감염은 신생아뿐만 아니라 모든 댐에서 저절로 발생했지만, 일부 댐에서는 GBS 균혈증/패혈증¹⁵가 나타났다. 이러한 GBS 감염의 확산이 발생한 사람들은 또한 더 높은 전염증성 사이토카인 반응을 보였다¹³....

토론

프로토콜의 중요한 단계
프로토콜의 여러 단계가 중요하며 몇 가지 품질 관리가 필요합니다. 예를 들어, GBS 스톡이 다른 병원체에 의해 오염될 위험이 있습니다. 이는 BHI 한천의 집락 측면(예: 크기, 모양, 색상)과 같은 GBS 미생물 식별의 적절한 기술을 사용하여 신속하게 식별할 수 있으며, 5% 양 혈액 배지가 있는 Columbia 혈액 한천 및 GBS 스크리닝을 위한 선택적 발색 배지인 CHROMID Strepto B 한천에 β용혈 GBS 용량을 복제합니다.

또 다른 문제는 일부 댐이 GBS의 무증상 보균자라는 것입니다. 따라서 일부 우발적 감염은 이론적으로 GBS가 접종되지 않은 대조군 댐에서 발생할 수 있습니다. 그러나 대조 동물의 태반에서 GBS 염색이 이루어졌을 때 GBS에 의한 융모막염은 발견되지 않았습니다. 만약 이 드문 일이 일어난다 하더라도, 우리가 제안하는 실...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5mL 멸균 튜브	BD Biosciences
50ml 팔콘 튜브	Thermo Fisher	339652
블레이드 또는 메스	BD Medical	371716
Brain Heart Infusion Broth	Criterion (Hardy diagnostics)	C5141
CHROMID Strepto B 한천 플레이트	BioMerieux, Saint-Laurent	43461
컬럼비아 혈액 한천 5 % 양 혈액 매체	Thermo Scientific	R01215
Forward primer	5' - TAC AGC CTG AGG ACA TAT TA3'Sigma
인슐린 주사기	Becton, Dickinson and Co(BD)	324702
Lewis rats	Charles River Laboratories
Methylbutan	Sigma Aldrich	M32631
Microtainer 혈액 수집 튜브	Becton, Dickinson and Co(BD)	365965
리버스 프라이머	5' - GCA CTT TAA CCC TTC GAT GA -3'Sigma
혈청학 피펫 1 ML	Thermo Fisher	170353N
혈청학 피펫 10 ML	Thermo Fisher	170356N
혈청학 피펫 25 ML	Thermo Fisher	170357N
혈청학 피펫 5 ML	Thermo Fisher	170355N
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