방법 논문

Acinetobacter baumannii O 결합 글리코 펩타이드의 확인을위한 개방형 검색 기반 접근법의 적용

DOI:

10.3791/63242

⸱

2021년 11월 2일

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, The University of Melbourne

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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오픈 서닝은 이전에 알려지지 않은 글리칸 조성물로 장식된 글리코펩티드의 동정을 가능하게 한다. 이 기사에서는 Acinetobacter baumannii 를 모델로 사용하여 박테리아 샘플에 대해 공개 검색 및 후속 글리칸 중심의 글리코 펩티드 검색을 수행하기위한 간소화 된 접근 방식을 제시합니다.

초록

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단백질 글리코실화는 박테리아 유기체 내에서 일반적인 변형으로 점점 더 인식되어 원핵 생리학 및 병원성 종의 최적 감염성에 기여합니다. 이로 인해 박테리아 글리코실화를 특성화하는 데 대한 관심이 증가하고 있으며 이러한 사건을 식별하기위한 고처리량 분석 도구에 대한 필요성이 커지고 있습니다. 상향식 프로테오믹스는 풍부한 글리코펩티드 데이터의 생성을 쉽게 가능하게 하지만, 원핵 종에서 관찰되는 글리칸의 폭과 다양성은 박테리아 글리코실화 사건의 식별을 매우 어렵게 만든다.

전통적으로, 박테리아 프로테오믹 데이터 세트 내에서 글리칸 조성물의 수동 결정은 이것을 현장 특정 전문가로 제한된 맞춤형 분석으로 만들었습니다. 최근에, 개방형 검색 기반 접근법은 알려지지 않은 수정의 식별을 위한 강력한 대안으로 등장하고 있다. 펩티드 서열에서 관찰되는 독특한 변형의 빈도를 분석함으로써, 개방 검색 기술은 복잡한 샘플 내의 펩티드에 부착된 일반적인 글리칸의 동정을 허용한다. 이 기사에서는 글리코프로테오믹 데이터의 해석 및 분석을 위한 간소화된 워크플로우를 제시하며, 글리칸 조성물에 대한 사전 지식 없이 박테리아 글리코펩타이드를 식별하기 위해 공개 검색 기술을 어떻게 사용할 수 있는지 보여줍니다.

이 접근법을 사용하여, 샘플 내의 글리코펩티드는 글리코실화 차이를 이해하기 위해 신속하게 확인될 수 있다. 아시네토박터 바우마니 를 모델로 사용하여, 이러한 접근법은 균주 간의 글리칸 조성물의 비교와 신규한 당단백질의 동정을 가능하게 한다. 종합하면,이 연구는 박테리아 글리코실화의 확인을위한 개방형 데이터베이스 검색 기술의 다양성을 보여 주므로 이러한 매우 다양한 글리코 프로테옴의 특성화가 그 어느 때보 다 쉬워졌습니다.

서론

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단백질 분자에 탄수화물을 부착하는 과정인 단백질 글리코실화는 자연 1,2에서 가장 흔한 번역 후 변형(PTM) 중 하나입니다. 삶의 모든 영역에서 다양한 복잡한 기계가 무수한 세포 기능에 영향을 미치는 당단백질의 생성에 전념하여 진화했습니다 1,3,4,5. 단백질 글리코실화는 아미노산6,7의 범위에서 발생하는 반면, N-결합 및 O-연결된 글리코실화 이벤트는 자연에서 관찰되는 두 가지 우세한 형태이다. N-연결된 글리코실화는 아스파라긴(Asn) 잔기의 질소 원자에 글리칸의 부착을 수반하는 반면, O-연결된 글리코실화에서, 글리칸은 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 또는 티로신(Tyr) 잔기7의 산소 원자에 부착된다. 글리코실화 시스템에 의해 표적화된 ....

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프로토콜

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참고: 박테리아 글리코펩타이드 샘플의 준비 및 분석은 네 개의 섹션으로 나눌 수 있습니다(그림 1). 본 연구를 위해, 세 개의 서열화된 A. baumannii 균주의 글리코실화를 평가하였다(표 1). 이들 균주 각각의 프로테옴 FASTA 데이터베이스는 Uniprot를 통해 액세스할 수 있다. 이 프로토콜에 사용되는 완충제의 조성에 대해서는 표 2 를 참조한다.

1. 프로테오믹 분석을 위한 단백질 시료의 제조

  1. 관심있는 프로테옴 샘플의 분리
    1. 전체 세포를 사용하는 경우, 세포가 배지에 존재하는 잠재적인 단백질 오염물을 제거하기 위해 인산완충식염수(PBS)로 세척되었는지 확인하십시오. 세척 후 전체 세포를 스냅-동결시키고 필요할 때까지 -80°C에서 보관한다.
    2. 분획된 샘플(예: 막 제제)이 사용되는 경우, 사용된 시약이 하류 액체 크로마토그래피 MS(LC-MS) 분석(50)을 방해하지 않도록 보장한다.
    3. 소듐 도데실 설페이트 (SDS), 트리톤 X-100, NP-40 또는 라우로....

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결과

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박테리아 글리코펩티드 분석을 위한 개방 검색의 유용성을 예시하기 위해, A. baumannii-AB307-0294, ACICU 및 D1279779의 세 균주 내에서 O-연결된 글리칸의 화학적 다양성을 평가하였다. O-연결된 글리코프로테옴은 A. baumannii 균주 사이에서 매우 가변적이며, 글리코실화에 사용되는 글리칸은 고도로 가변적인 캡슐 유전자좌 44,45,46으로부터 유래된다. 이러한 화학적 다양성은 A. baumannii를 오픈 검색 연구를위한 이상적인 모델 시스템으로 만듭니다. 세 균주의 글리코프로테옴은 이전에 평가되지 않았지만, 이들 균주 중 두 균주인 AB307-029464 및 ACICU65

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토론

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공개 검색은 알려지지 않은 수정 사항을 식별하기위한 효과적이고 체계적인 방법입니다. 박테리아 프로테옴 샘플 내에서 알려지지 않은 글리칸의 확인은 전통적으로 시간이 많이 걸리고 기술적으로 전문화 된 사업이었지만, MSfragger21,41 및 Byonic31,38과 같은 도구의 최근 개발은 이제 펩티드에 부착 된 잠재적 인 글리 칸으로서의 추가 특성화를 위해 델타 질량을 빠르고 효과적으로 식별 할 수있게되었습니다. 표준 및 글리코펩티드-풍부 프로테옴 샘플 둘 다의 공개 검색은 잠재적인 글리코펩티드를 동정할 수 있다(도 1). 많은 박테리아 시스템의 프로테옴 내에서 글리코펩티드의 공통성과 풍부함은 글리코펩티드 농축 없이 이러한 변형의 직접적인 검출을 가능하게 한다

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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N.E.S는 Australian Research Council Future Fellowship (FT200100270) 및 ARC Discovery Project Grant (DP210100362)의 지원을 받습니다. MS 계측에 대한 액세스를 위해 Bio21 분자 과학 및 생명 공학 연구소의 멜버른 질량 분광법 및 프로테오믹스 시설에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
14 G Kel-F 허브 포인트 스타일 3Hamilton companyhanc90514
2-클로로아세트아미드시그마 Aldrich Pty LtdC0267-100G
아세토니트릴시그마 Aldrich Pty Ltd34851-4L
수산화암모늄(28%)Sigma Aldrich Pty Ltd338818-100ML
BCA 단백질 분석 시약A 피어스23228
BCA 단백질 분석 시약 BPierce23224
C8 Empore SPESigma Aldrich Pty Ltd66882-UC8 재료의 대체 공급 업체는 Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Formic acidSigma Aldrich Pty Ltd5.33002
IsopropanolSigma Aldrich Pty Ltd650447-2.5L
MethanolFisher ChemicalM/4058/17
SDB-RPS Empore SPE (역상 설포네이트)Sigma Aldrich Pty Ltd66886-USDB-RPS의 대체 공급업체는 Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Sodium Deoxycholate, Sigma Aldrich Pty LtdD6750-100G
ThermoMixer CEppendorf2232000083
trifluoroacetic acidSigma Aldrich Pty Ltd302031-10X1ML
Tris 2-카르복시에틸 포스핀 염산염Sigma Aldrich Pty LtdC4706-2G
Tris(하이드록시메틸)아미노메탄Sigma Aldrich Pty Ltd252859-500G
트립신/Lys-C 프로테아제 혼합물PromegaV5073
진공 농축기Labconco7810040
ZIC-HILIC 재료일회용 SPE 컬럼에 사용되는 Merck 1504580001 Resin은 더 큰 형태의 컬럼을 비우고 free resin을 사용하여 얻을 수 있습니다.
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참고문헌

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  1. Essentials of glycobiology. Varki, A., et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2015).
  2. Schaffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Reviews. 41 (1), 49-91 (2017).
  3. Abu-Qarn, M., Eichler, J., Sharon, N.

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