본 연구는 시험관 내에서 파라크린 비표준 Wnt 신호 전달 사건을 연구하기 위한 매우 재현성 있고 다루기 쉬운 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 쥐 신경 볏 세포 및 근모세포에서 파라크린 Wnt5a 신호 전달의 영향을 평가하기 위해 적용되었습니다.
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이 논문에서
요약
초록
비표준 Wnt 신호 전달은 배아 발생 동안 세포 내 액틴 필라멘트 조직 및 전구 세포의 분극 이동을 조절합니다. 이 프로세스에는 신호 전송 셀과 신호 수신 셀 간의 복잡하고 조정된 파라크린 상호 작용이 필요합니다. 이러한 상호 작용이 서로 다른 계통의 다양한 유형의 세포 간에 발생할 수 있다는 점을 감안할 때 세포 특이적 결함의 생체 내 평가는 어려울 수 있습니다. 본 연구는 시험관 내에서 파라크린 비표준 Wnt 신호전달을 평가하기 위한 고도로 재현성 있는 방법을 기술한다. 이 프로토콜은 (1) 관심있는 두 세포 유형 사이에서 비표준 Wnt 신호 전달의 기능적 및 분자 평가를 수행하는 능력으로 설계되었습니다. (2) 비표준 Wnt 신호 전달 경로에서 신호 전송 대 신호 수신 분자의 역할을 해부합니다. (3) 표준 분자 또는 약리학적 접근으로 표현형 구조 실험을 수행합니다.
이 프로토콜은 근모세포에서 신경 볏 세포(NCC) 매개 비표준 Wnt 신호 전달을 평가하는 데 사용되었습니다. NCC의 존재는 근아세포에서 팔로이딘 양성 세포질 필로포디아 및 라멜리포디아의 증가와 상처 치유 분석에서 개선된 근세포 이동과 관련이 있습니다. Wnt5a-ROR2 축은 NCC와 제 2 심장 필드 (SHF) 심근 세포 전구 세포 사이의 중요한 비표준 Wnt 신호 전달 경로로 확인되었습니다. 결론적으로, 이것은 시험관 내에서 파라크린 비표준 Wnt 신호 전달 메커니즘을 연구하기 위한 매우 다루기 쉬운 프로토콜입니다.
서론
비표준 Wnt 신호 전달은 세포 필라멘트 조직과 방향 이동을 조절하는 진화적으로 보존된 경로입니다. 이 경로는 배아 조직 형태 형성 1,2,3, 림프 및 혈관 신생 4,5,6,7, 암 성장 및 전이 8,9,10을 포함한 여러 생물학적 과정과 관련이 있습니다. . 세포 수준에서 비표준 Wnt 신호 전달은 신호 송신 세포와 신호 수신 세포 간의 조정된 파라크린 상호 작용을 통해 수행됩니다. 이러한 상호작용은 상이한 계통 또는 유형의 세포 사이에서 빈번하게 발생하며, 최대 19개의 리간드 및 다중 수용체, 공동-수용체 및 다운스트림 신호 전달 이펙터(11)를 포함하는 다양한 분자 네트워크를 포함한다....
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프로토콜
1. 세포의 사전 실험 확장 및 계대 숙성
- C2C12 세포 배양:
- Dulbecco의 변형 된 Eagle 's 배지 (DMEM)와 10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 결합하여 500mL의 C2C12 배양 배지를 준비합니다.
- C2C12 세포의 바이알을 37°C 수조에서 해동시킨다. C2C12 세포가 해동되는 동안 5mL의 C2C12 배지를 15mL 원뿔형 튜브에 추가합니다. 즉시 해동된 세포를 P1000 피펫을 사용하여 15mL 튜브로 옮깁니다.
참고: C2C12 세포는 이전에 심근세포 전구세포를 모델링하기 위한 1차 세포주로 사용 및 검증된 쥐 근원세포 세포입니다. - 혈청 피펫을 사용하여 원추형 튜브에서 C2C12 세포를 부드럽게 혼합합니다. 이어서, 해동된 세포의 전체 부피를 C2C12 배지(6 mL)에 75cm2 플라스크에 첨가한다.
- 총 부피 12mL에 대해 6mL의 신선한 C2C12 배지를 플라스크에 추가합니다. 세포 및 배지 용액이 플라스크의 전체 바닥을 덮도록 플라스크를 부드럽게 회전시킵니다. 플라스크를 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에 넣고 세포가 부착되도록 한다.
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결과
쥐 근원 세포의 이동 능력에 대한 NCC의 영향
이 분석은 NCC가 근모세포의 이동 능력에 미치는 영향을 평가하기 위해 처음 적용되었습니다. 그림 1 은 분석의 개략적 모델을 간략하게 설명합니다. 이 영향을 테스트하기 위해 스크래치 분석은 삽입물이있는 상태에서 성장한 것과 비교하여 단독으로 성장한 근세포 (NCC 삽입물없이)로 수행되었습니다. 양성 대조군으로, 500ng/mL의 재조합 Wnt5a(rWnt5a)를 NCC 인서트가 있는 챔버 웰에 첨가하였다. 이 rWnt5a 농도는 C2C12 세포에서 수행된 용량-반응 분석에 의해 결정되었습니다(보충 그림 S1). NCC 인서트의 대표적인 이미지는 보충 그림 S2에 표시되어 있으며, 이는 NCC가 이 시점에서 정상임을 보여줍니다. 면역형광법은 50nM의 Wnt5a siRNA와 함께 배양한 후 단백질 수준에서 Wnt5a .......
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토론
비표준 Wnt/평면 세포 극성(PCP) 신호 전달 경로는 다중 발달 24,25 및 질병 과정24,26과 관련된 매우 중요한 세포 신호 전달 경로입니다. 배아 발달 동안, 비표준 Wnt 신호전달은 신호-수신 세포(11)에서 형태, 비대칭 조직 및 방향 이동의 변화를 궁극적으로 유도하는 신호-송신 세포로부터의 분자 신호의 광대한 네트워크를 포함한다. 이전 연구에 따르면 이 신호 전달을 유도하는 특정 리간드-수용체 경로는 다양하고 상황에 따라 다르며 종종 세포 유형12,13,14,15.......
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공개 사항
저자는 잠재적 인 이해 상충으로 해석 될 수있는 상업적 또는 재정적 관계가없는 상태에서 연구가 수행되었다고 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 NIH 상 F30HL154324를 O.T.에, K08HL121191 및 R03HL154301을 S.R.K.에 부분적으로 지원했습니다. 저자는 이 원고의 그림 1 에 있는 도식이 biorender.com 로 작성되었음을 인정하고자 합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Vector Laboratories | H-1200-10 | 이 있는 페이드 방지 장착 매체 | 4°°C에 보관; C |
| 둔감한 혈청 알부민 | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | 4 °에 저장; C |
| C2C12 쥐 근아세포 세포주 | ATCC | CRL-1772 | |
| 세포 배양 플라스크, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| 챔버 슬라이드 시스템, 4웰 | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco' 의 변형된 독수리' s 매체 (DMEM), 고 포도당 (4.5 g / L), L- 글루타민 (2 mM) | 코닝 | 10-017-CV | 4 °C에 보관됩니다. C |
| Falcon 원추형 원심분리기 튜브, 15mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 0.4 µ의 24웰 플레이트용 Falcon 투과성 지지대; M 투명 PET 멤브레인 | Corning | 353095 | |
| 소 태아 혈청 | Fisher Scientific | W3381E | -20°C에서 50mL 분취액에 보관; C |
| 젤라틴 용액, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | 4°C에 저장; C |
| 눈금이 매겨진 멸균 피펫 팁, 10 & 마이크로; L | USA Scientific | 1111-3810 | |
| 백혈병 억제 인자(LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM 비필수 아미노산(MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| 최소 필수 매체(MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| 미토마이신 C | Roche | 10107409001 | |
| 붙지 않는 자동 유리 커버슬립, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 신경능능선 세포주 | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| 파라포름알데히드 PBS의 솔루션, 4 % | 산타 크루즈 생명 공학 | sc-281692 | 4 °에 저장; C |
| 페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL 페니실린 및 10,000 μ g/mL 스트렙토마이신) | Fisher Scientific | W3470H | -20°C에서 10mL 분취량에 보관; C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | -20 °에 저장; C, 가벼운 |
| 인산염 완충 식염수 (PBS), 1x, 칼슘 및 마그네슘 없음, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | 4 °C에 보관되지 않습니다. C |
| 재조합 인간 섬유아세포 성장인자-염기성 (rhFGF-basic) | R& D Systems | 233-FB-025 | |
| 재조합 인간/마우스 Wnt5a 단백질 | R& D Systems | 645-WN-010 | |
| 피루브산 나트륨, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| 그리드가 있는 사각 페트리 접시 | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO 쥐 섬유아세포 공급 | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 용액 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| 트립신-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | 는 4°C에 보관됩니다. C |
| Zeiss Apotome.2 형광 현미경 | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss 반전 Axio Vert.A1 광학 현미경 | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 현미경 소프트웨어 | Carl Zeiss AG | 이미징 소프트웨어 |
참고문헌
- Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
- Čapek, D., et al.
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