여기에서는 아세트산 납 노출이 제브라 피쉬 유충의 뼈 질량 변화를 유발한다는 것을 보여주기 위해 알리자린 레드 염색을 사용했습니다. 이 염색 방법은 다른 위험한 독성 물질에 의해 유도 된 제브라 피쉬 유충 손실의 뼈 손실 조사에 적용될 수 있습니다.
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방법 논문
알리자린 레드 염색을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 화학적으로 유발된 뼈 손실 검출
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
납(Pb) 노출로 인한 화학적으로 유발된 뼈 손실은 인간과 동물의 골격계 모두에 일련의 부정적인 영향을 유발할 수 있습니다. 그러나 제브라 피쉬의 구체적인 효과와 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. Alizarin red는 칼슘 이온에 대한 친화력이 높으며 뼈를 시각화하고 골격 미네랄 덩어리를 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 연구에서는 알리자린 레드 염색을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 아세트산납(PbAc)으로 인한 뼈 손실을 감지하는 것을 목표로 했습니다. 제브라피쉬 배아는 수정 후 2시간에서 120시간 사이에 일련의 PbAc 농도(0, 5, 10, 20mg/L)로 처리되었습니다. 수정 후 9일에 유충에 대해 전체 마운트 골격 염색을 수행하고, 전체 염색 면적을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화했습니다. 결과는 광물화된 조직이 빨간색으로 염색되었고, PbAc 노출 그룹에서 염색된 영역이 유의하게 감소했으며, 뼈 광물화의 용량 의존적 변화가 있음을 나타냈다. 이 논문은 PbAc 유발 뼈 결함의 골격 변화를 조사하기 위한 염색 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 다른 화학 물질에 의해 유도 된 뼈 손실을 감지하기 위해 제브라 피쉬 유충에서도 사용할 수 있습니다.
서론
최근 연구에 따르면 글루코 코르티코이드, 아로마 타제 억제제 및 과도한 알코올 섭취로 인한 골다공증이 흔하다는 것이 확인되었습니다 1,2. 납 (Pb)은 식물, 토양 및 수생 환경에서 발견되는 독성 금속입니다3. 인체에 대한 Pb의 악영향이 많은 관심을 끌었지만 뼈에 대한 돌이킬 수없는 영향은 더 조사해야합니다. 납 중독은 발달 중과 성인 골격 모두에서 다양한 병리학 적 변화를 일으켜 정상적인 생활 활동에 영향을 미칩니다. 연구에 따르면 만성 Pb 노출과 뼈 손상4 사이의 연관성이 발견되었으며, 여기에는 뼈 구조 손상5,6, 골밀도 감소, 골다공증 위험 증가7가 포함됩니다.
광물화된 조직은 뼈 강도8에 매우 중요하며, 골 광물화 매트릭스 침착은골 형성의 중요한 지표입니다9. 알리자린 레드는 칼슘 이온에 대한 친화력이 높으며 ....
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프로토콜
여기에 설명 된 모든 동물 절차는 Soochow 대학의 윤리위원회 동물 관리 연구소에서 검토하고 승인했습니다.
1. 어류 사육 및 배아 수집 14
- 매일 세 번 물고기를 먹이십시오. 제브라 피쉬가 28.5 ± 0.5 ° C에서 14:10 시간의 명암 주기로 유지되도록하십시오.
- 저녁에 수컷과 암컷 성체 물고기를 산란 탱크의 격리 보드로 2 : 1 수컷 대 암컷 비율로 분리하십시오.
- 다음날 아침 9:00 AM에 격리 보드를 제거하고 2 시간 후에 배아를 수집합니다.
- 실험 전에 28.5°C로 유지되는 생화학적 인큐베이터에 배아를 넣었다.
2. 화학 물질 노출
- 모국을 준비하십시오 : 아세트산 납 삼수화물 (5g)을 계량하고 교반하면서 초순수 (50mL)에 녹입니다.
주의 : PbAc는 독성이 있습니다. 적절한 방진 마스크, 보호 복 및 장갑을 착용하십시오. 흄 후드 아래에서 실험을 수행하십시오. - 제브라 피쉬 배아를 선택하여 깨끗한 6 웰 플레이트 (제브라 피쉬 사육수 3mL에 웰....
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결과
Alizarin 적색 염색은 제브라 피쉬 유충의 뼈 광물 화 변화를 측정하는 민감하고 구체적인 방법입니다. 이 연구에서 우리는 PbAc가 사망, 기형, 심박수 감소 및 신체 길이 단축을 포함하여 제브라피쉬 유충에 악영향을 미친다는 것을 관찰했습니다. 또한, 제브라피쉬 유충의 미네랄 골격 영역을 평가하여 PbAc로 인한 뼈 손실을 조사했습니다. 9dpf(그림 1A)에서 머리 골격의 많은 뼈가 광물화되어 파라스페노이드(PS), 수술(OP), 세라토브랜치(CB) 및 노토코드(NC)와 같이 빨간색으로 염색됩니다. 대조적으로, 이석(OT)(비뼈 구조)은 빨간색이 아닌 갈색-검은색으로 보입니다. 각 이미지에서 전체 염색 영역을 정량화하기 위해 디지털 분석을 수행했습니다. 대조군과 비교하여 10 및 20 mg / L PbAc로 처리 된 납 아세테이트 그룹은 염색 된 영역에서 상당한 감소 (p < 0.001)를 보였습니다 (그림 1.......
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토론
제브라 피쉬는 뼈 대사 질환을 연구하기에 적합한 모델입니다. 설치류 모델에 비해 제브라 피쉬 모델은 비교적 빠르게 확립 할 수 있으며 질병의 중증도 측정이 더 쉽습니다. 야생형 제브라 피쉬 유충에서 머리 골격의 광물 화는 5dpf에서 발생하고 축 골격은 7dpf15에서 발생합니다. 따라서 PS, OP, CB 및 NC와 같은 두개골 뼈는 9dpf에서 잘 발달되어 있습니다. 유충이 완전히 염색되고 표백 된 후 연조직이 제거되어 물고기 몸체가 투명하게 보입니다. 알리자린 레드 염색 시약을 첨가하여 제브라피쉬의 미네랄 뼈를 빨간색으로 염색하고 시각화했습니다.
이미지 분석은 이 실험에서 신뢰할 수 있는 실험 결론을 얻는 데 중요합니다. 좋은 자세와 깨끗한 배경을 가진 제브라 피쉬의 사진이 정량 분석을 위해 선택되었습니다. 단일 이미지에 대해 염색 된 영역을 정량화하면 한 물고기의 빨간색으로 염색 된 모든 광물 화 된 뼈가 계산됩니다. 따라서 납.......
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (81872646; 81811540034; 81573173)과 강소 고등 교육 기관의 우선 학업 프로그램 개발 (PAPD)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH = 7.5) | Solarbio, 베이징, 중국 | 21 | |
| % 파라 포름 알데히드 고정 용액 | BBI, 상하이, 중국 | 14 | 고정 조직 |
| 10x PBS 버퍼 | BBI, 상하이, 중국 | 15 | |
| 35 % H2< / sub>O2 < / sub> | Yonghua, Jiangsu, China | 8 | 안료 제거 |
| 50 mL 원심 분리기 튜브 | AKX, 장쑤 성, 중국 | 4 | |
| 95 % 무수 에탄올 | 에녹스, 장쑤 성, 중국 | 2 | 염색 |
| 알리자린 레드 (순도 99.5 %) | Solarbio, 베이징, 중국 | 1 | 염색 |
| 생화학 인큐베이터 | Yiheng, 상하이, 중국 | 3 | 제브라 피쉬 배아 키우 |
| 전자 저울 | Sartorius, 독일 | 5 | 고형 원료 계량 |
| 글리세린 (순도 99.5 %) | , BBI, 상하이, 중국 | 7 | 염색 물고기 저장 |
| ImageJ (소프트웨어) | 미국 | 9 | 디지털 분석 |
| KOH (순도 99.9 %) | 시그마, 미국 | 10 | 용액 |
| 아세테이트 납 (순도 99.5 %) | , 알라딘, 상하이, 중국 | 11 | |
| MgCl2 (순도 99.9%) | 알라딘, 상하이, 중국 | 12 | 세척 |
| NIS-Elements F (소프트웨어) | 니콘, 일본 | 13 | 관찰 및 사진 촬영 |
| 파이프 | AKX, 장쑤성, 중국 | 18 | 배아 및 용액 |
| 플레이트 제거(24-well) | 코닝, 미국 | 17 | 배아 플레이트 염색용 용기 |
| (6-well)코 | 닝, 미국 | 16 | 배아 번식을 위한 용기 |
| 흔들리는 테이블 | 중국 Beyotime | 19 | 용액 혼합 |
| 실체 현미경 | 일본 니콘 | 20 | 관찰 및 사진 촬영 |
| 쑤저우 대학교 수저우 대학교 제브라피시 실험 센터 | 22 | 실험 동물 |
참고문헌
- Compston, J., et al. Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science. Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).
- Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbau....
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재인쇄 및 허가
