코히어런트 라만 산란 이미징을 사용하여 피부 내 제약 화합물 시각화 및 정량화

요약

피부 내의 제약 화합물을 시각화하고 정량화하기 위한 일관된 라만 산란 영상화 방법론이 기재되어 있다. 이 논문은 피부 조직 제제 (인간 및 마우스) 및 국소 제형 적용, 시공간 농도 프로파일을 정량화하기위한 이미지 획득 및 국소 약물 전달을 평가하기위한 예비 약동학 분석에 대해 설명합니다.

초록

국소 제형 적용 후의 피부 약동학 (cPK)은 국소 생체 이용률 (BA)을 기계적으로 이해하기 위해 규제 및 약물 개발 과학자들에게 특히 관심이있는 연구 분야였습니다. 테이프 스트리핑, 진피 미세투석, 또는 진피 개방 유동 미세관류와 같은 반침습적 기술은 모두 매크로스케일 cPK를 정량화한다. 이러한 기술은 방대한 cPK 지식을 제공했지만 커뮤니티는 활성 제약 성분 (API) 침투 및 세포 수준에서의 투과에 대한 기계론적 이해가 부족합니다.

마이크로 스케일 cPK를 다루기 위한 한 가지 비침습적 접근법은 외인성 라벨이나 화학적 변형 없이 내재적 분자 진동을 선택적으로 표적으로 하는 코히어런트 라만 산란 영상(CRI)이다. CRI에는 API 또는 비활성 성분의 민감하고 선택적인 정량화를 가능하게 하는 두 가지 주요 방법인 일관된 안티스토크스 라만 산란(CARS)과 자극된 라만 산란(SRS)이 있습니다. CARS는 일반적으로 구조적 피부 정보를 도출하거나 화학적 대조를 시각화하는 데 사용됩니다. 대조적으로, 분자 농도와 선형인 SRS 신호는 피부 층화 내의 API 또는 비활성 성분을 정량화하는 데 사용된다.

마우스 조직이 CRI를 갖는 cPK에 대해 일반적으로 활용되었지만, 국소 BA 및 생물학적 동등성 (BE)은 궁극적으로 규제 승인 전에 인간 조직에서 평가되어야합니다. 이 논문은 국소 BA 및 BE의 평가에서 정량적 약동학적 CRI 연구에 사용되는 생체외 피부를 제조하고 이미지화하는 방법론을 제시한다. 이 방법론은 시간이 지남에 따라 인간과 마우스 피부 내에서 신뢰할 수 있고 재현 가능한 API 정량화를 가능하게합니다. 지질이 풍부하고 지질이 부족한 구획 내의 농도뿐만 아니라 시간에 따른 총 API 농도가 정량화됩니다. 이들은 마이크로 및 매크로 스케일 BA의 추정에 활용되며, 잠재적으로 BE입니다.

서론

국소 약물 제품 적용 후 cPK를 평가하기위한 방법론은 고전적인 시험관 내 투과 시험 (IVPT) 연구 1,2,3,4,5 및 테이프 스트리핑 6,7,8에서 개방 유동 미세 관류 또는 피부 미세 투석과 같은 추가 방법론으로 확장되었습니다 9,10,11^{, 12,13,14}. 관심있는 질병에 따라 치료 작용의 잠재적으로 다양한 국소 부위가 있습니다. 따라서 API가 의도 된 로컬 작업 사이트에 도달하는 속도와 범위를 평가하기위한 해당 방법론이있을 수 있습니다. 앞서 언급한 각각의 방법론에는 장점이 있지만, 가장 큰 단점은 마이크로스케일 cPK 정보가 부족하다는 것입니다(즉, API가 어디로 가고 어떻게 퍼졌는지 시각화할 수 없음).

국소 BA와 BE를 추정하기 위해 관심있는 비침습적 방법론 중 하나는 CRI이며, 이는 CARS 및 SRS 현미경의 두 가지 이미징 양식으로 나눌 수 있습니다. 이러한 일관된 라만 방법은 비선형 라만 효과를 통해 분자의 화학적으로 특이적인 이미징을 가능하게합니다. CRI에서는 두 개의 레이저 펄스 트레인이 샘플 내에서 집중되고 스캔됩니다. 레이저 주파수 사이의 에너지 차이는 관심있는 화학 구조에 특정한 진동 모드를 목표로 설정됩니다. CRI 과정은 비선형적이기 때문에, 신호는 현미경 초점에서만 생성되어, 조직의 입체 약동학적 단층 촬영 이미징을 허용한다. cPK의 맥락에서, CARS는 지질이 풍부한 피부 구조물⁽¹⁵)의 위치와 같은 조직 구조 정보를 획득하는데 사용되어 왔다. 대조적으로, SRS는 그 신호가 농도에 따라 선형이기 때문에 분자 농도를 정량화하는 데 활용되었습니다. 생체외 피부 표본의 경우, 에피 방향(¹⁶ )에서 CARS를 수행하고 전송 모드(¹⁷)에서 SRS를 수행하는 것이 유리하다. 따라서, 얇은 조직 샘플은 SRS 신호 검출 및 정량화를 허용할 것이다.

모델 조직으로서, 누드 마우스 귀는 사소한 단점과 함께 몇 가지 장점을 제시합니다. 한 가지 장점은 조직이 이미 두께가 ~ 200-300 μm이고 추가 샘플 준비가 필요하지 않다는 것입니다. 또한, 몇몇 피부 층화는 하나의 시야(예를 들어, 각질층, 피지선(SGs), 지방세포, 및 피하 지방)^16,18을 통해 축방향으로 초점을 맞추는 것에 의해 보여진다. 이것은 인간 피부 샘플로 이동하기 전에 피부 투과 경로 및 국소 BA 추정치의 예비 전임상 추정을 허용한다. 그러나, 누드 마우스 모델은 피부 구조(¹⁹)의 차이로 인한 생체내 시나리오로의 외삽의 어려움과 같은 한계를 제시한다. 누드 마우스 귀는 예비 결과를 얻는 훌륭한 모델이지만, 인간 피부 모델은 황금 표준입니다. 생체내 투과 동역학 20,21,22를 정확하게 재분석하기 위한 동결된 인간 피부의 적합성 및 적용성에 대한 다양한 논평이 있었지만, 동결된 인간 피부의 사용은 시험관내 API 투과 동역학의 평가를 위한 수용된 방법이다^23,24,25 . 이 프로토콜은 마우스와 인간의 피부의 다양한 피부층을 시각화하면서 지질이 풍부하고 지질이 부족한 구조 내의 API 농도를 정량화합니다.

CRI는 조직 내 화합물을 구체적으로 시각화하기 위해 수많은 분야에서 활용되어 왔지만 국소적으로 적용된 의약품의 cPK를 조사하는 데는 한계가 있었습니다. CRI를 사용하여 국소 제품의 국소 BA / BE를 평가하려면 먼저 정확한 비교를 위해 표준화 된 프로토콜을 마련해야합니다. 피부로의 약물 전달을 위해 CRI를 사용한 이전의 노력은 데이터 내에서 가변성을 입증하였다. 이것은 CRI의 비교적 새로운 응용 프로그램이므로 신뢰할 수있는 결과^18,26,27을 얻으려면 프로토콜을 수립하는 것이 중요합니다. 이 접근법은 라만 스펙트럼의 생물학적 침묵 영역에서 하나의 특정 파형만을 표적으로 삼는다. 그러나 대부분의 API와 비활성 성분은 지문 영역 내에서 라만 이동을 가지고 있습니다. 이것은 이전에 지문 영역의 조직에서 발생하는 고유 한 신호로 인해 문제를 제기했습니다. 최근의 레이저 및 계산 발전은 이러한 장벽을 제거했으며, 이는 또한 여기에 제시된 접근법⁽²⁸)과 함께 활용 될 수 있습니다. 여기에 제시된이 접근법은 침묵 영역 (2,000-2,300 ^cm-1)에서 라만 시프트가있는 API의 정량화를 허용합니다. 이는 약물의 물리화학적 특성에 한정되지 않으며, 이는 앞서 언급한 일부 cPK 모니터링 방법론(²⁹)의 경우일 수 있다.

이 프로토콜은 두꺼운 인간 피부 샘플이 두꺼운 샘플에 의한 광산란으로 인해 약물 제품 적용 후 최소한의 신호를 생성하기 때문에 다양한 제제에 대한 피부 두께의 샘플 대 샘플 변동성을 줄여야합니다. 이 원고의 목표는 재현 가능한 이미징 표준을 보장하는 조직 준비 방법론을 제시하는 것입니다. 또한, CRI 시스템은 잠재적인 오류 소스를 줄이고 신호 대 잡음을 최소화하기 위해 설명된 대로 설정됩니다. 그러나이 논문은 CRI 현미경의 지침 원칙 및 기술적 장점에 대해 논의하지 않을 것입니다 이것은 이전에 다루었 기 때문에³⁰. 마지막으로, 실험의 성공 또는 실패를 결정하기 위해 결과를 해석 할 수 있도록 광범위한 데이터 분석 절차를 탐구합니다.

프로토콜

누드 마우스 귀 조직의 사용은 매사추세츠 종합 병원 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았으며 인간의 피부 조직 사용은 매사추세츠 종합 병원 기관 검토위원회 (IRB)의 승인을 받았습니다. IACUC 프로토콜에 따르면, 갓 안락사된 마우스는 누드 마우스 콜로니를 가진 협력자로부터 수득되었다. 인간 조직은 승인 된 프로토콜을 통해 매사추세츠 종합 병원의 선택 복부 성형술 절차에서 조달되었습니다. 또한, 복부 피부 이외의 특정 조직 유형은 신체 기증 기관을 통해, 또한 IRB 승인 프로토콜을 통해 획득되었다.

1. 조직의 제조

1. 누드 마우스 귀 피부 조직의 제조
   1. 갓 수확한 누드 마우스 시체를 얻은 후 포셉과 미세외과 가위를 사용하여 귀를 제거합니다. 한쪽 귀를 작은 페트리 접시 (즉, 35mm x 10mm)에 넣으십시오. 누드 마우스 몸체를 지역 IACUC 프로토콜에 따라 폐기할 생물학적 위험 백에 넣는다.
   2. 각 마우스 귀를 인산염 완충 식염수(PBS)로 헹구고 작업 와이퍼로 부드럽게 두드려 말립니다. 두 번 반복하여 이미징 품질에 영향을 줄 수 있는 귀에 잔류 먼지나 이물질을 제거합니다( 그림 1 참조).
   3. 귀를 24시간 이내에 사용할 경우, 냉장고(2-8°C)에 신선한 PBS가 있는 작은 페트리 접시(즉, 35mm x 10mm)에 넣습니다. 귀를 수확 24 시간 후에 사용할 경우 PBS가없는 페트리 접시 (35 mm x 10 mm)에 넣고 접시를 파라 필름으로 덮은 다음 -20 °C 냉동고에 보관하십시오.
2. 인간 피부 조직의 제조
   1. 인간 조직을 조달 한 후 생물학적 후드의 큰 페트리 접시 (즉, 60mm x 15mm)에 넣어 샘플 준비를위한 충분한 공간을 확보하십시오.
   2. 각질층 쪽을 아래를 향하게 하여 피하 지방이 접근할 수 있도록 한다.
   3. 포셉과 미세 외과 용 가위를 사용하여 피하 지방을 조심스럽게 제거하기 시작하십시오. 가위로 피하 지방을 더 이상 제거 할 수 없으면 10 블레이드 일회용 메스 (또는 이와 동등한 것)로 전환하여 나머지 피하 지방을 제거하십시오. 메스를 45° 각도로 피부에 대고 포셉으로 피부를 가만히 유지합니다(그림 1 참조).
      참고: 고품질 전송 SRS 이미지를 얻으려면 구멍이 뚫리지 않고 가능한 한 얇아야 합니다.

그림 1: 마우스와 인간의 피부를 이미징하는 데 이상적인 두께의 이미지 . (A) 마우스 귀 피부는 빛을 가시적으로 통과시킬 수 있는 빛을 유지했습니다. (B) 이상적인 인간의 피부는 준비 후 빛까지 유지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 인간의 피부를 1cm x 1cm 조각으로 나눕니다.
   참고: 신선한 피부는 앞서 설명한 바와 같이 아가로스 겔 베드를 사용하지 않고 최대 24시간 동안 사용할 수 있습니다⁽³¹). 그러나, 신선한 피부는 아가로스 겔 베드 상에 유지된다면 더 오래 이용될 수 있다. 피부가 나중에 사용될 경우, 피부는 -20°C 냉동고에 놓인 후 시편 수송 백에 넣는다. 동결된 피부는 최적의 결과를 얻기 위해 아래의 절차를 사용하여 해동해야 합니다(3.1.2단계 참조).

2. 레이저 및 현미경 설정

1. 이미징 약 30분 전에 광범위하게 조정 가능한 초고속 레이저(이하 레이저라고 함)를 켜고 예열할 수 있습니다. 레이저 경고 표지판/잠금 시스템을 활성화하여 진입 시 잠재적인 위험 이외의 직원에게 알릴 수 있습니다.
   참고: 클래스 IV 레이저로 작업할 때는 항상 적절한 안경을 착용해야 합니다. 여기에 사용 된 특정 레이저의 경우, 권장되는 적절한 안경은 레이저 800-1,300 nm의 작동 범위에 대해 OD ≥ 6입니다.
2. 레이저가 예열되는 동안 현미경 제어, CARS 감지 및 SRS 감지를 위해 나머지 하드웨어를 활성화하십시오.
3. 최적의 이미징을 보장하기 위해 현미경을 적절하게 정렬하십시오. 현미경 제어 소프트웨어(이하 MC 소프트웨어)의 이미지 획득 제어 창에서 전송 램프를 클릭하여 빛이 현미경의 트랜스일루미네이션 램프 에서 나오도록 합니다.
4. 현미경을 수직축을 따라 정렬하기 위해 정확한 Köhler 조명을 보장하십시오 : 아이피스⁽³²)를 통해 최소한의 빛이 보이도록 홍채를 아래로 닫으십시오.
5. 아이피스를 들여다보면서 아이리스를 열어 다각형이 모든 면에 동시에 닿는지 확인합니다. 홍채를 열기 전에 다각형 모양을 볼 수 없는 경우 콘덴서 높이를 조정합니다.
6. 다각형 셰이프가 모든 면에 동시에 닿지 않으면 조정 노브를 사용하여 조리개 정렬 위치를 조정합니다.
   참고 : 심층적 인 현미경 설정에 대해서는 Sanderson et ^al.33 을 참조하십시오.
7. 오일 샘플(예를 들어, 오일 내에 많은 -_CH2-결합이 존재하기 때문에 올리브 오일)을 함유하는 커버슬립 및 양면 접착제 스페이서가 있는 현미경 슬라이드를 현미경 스테이지 홀더 상에 놓는다.
8. MC 소프트웨어의 획득 설정 창에서 현미경 드롭다운 메뉴를 찾아 현미경 목표를 20배로 설정합니다.
9. CARS 검출 필터(645nm/50nm)가 현미경 측면 포트 광승수 튜브를 따라 epiCARS 신호를 시각화하고 측정할 수 있는 위치에 있는지 확인합니다.
   참고: 이 특정 필터는 803nm의 펌프 파장 및 1,040nm의 스토크스 파장에 대해 652nm에서 생성된 안티스토크스 CARS 신호로서 지질을 이미징하기 위해 선택됩니다(Eq. (1) 참조).
   (1)
   여기서 λ 변수는 nm의 단위를 가지며; λ_{펌프는 펌프} 빔 파장이고; 그리고 λ 스토크_{스는 스토크} 스 빔 파장이다.
10. 아이피스를 통해 시스템의 정렬을 확인하는 데 사용되는 오일 샘플의 가장자리를 찾습니다.
11. 현미경의 초점 노브를 사용하여 가장자리가 Z 초점에 있는지 확인하고 스테이지 컨트롤러를 조정하여 XY 초점을 얻습니다.
12. 레이저가 예열되면 레이저의 그래픽 사용자 인터페이스에서 모터 미세 조정을 50.0으로 설정하여 펌프 빔을 803nm로 설정하십시오. 사용되는 정확한 모터 미세 조정은 설정마다 다를 수 있습니다.
    참고: 펌프 빔은 스토크스 빔 파장이 1,040nm로 고정되어 있기 때문에 이 레이저에서 조정 가능한 파장을 가진 유일한 빔입니다. 이 구성은 2850 ^cm-1 에서의 CH 진동을 목표로 한다(파장 타겟팅을 위한 펌프 파장을 계산하기 위해 Eq. (2) 참조).
    (2)
    여기서 상대 파수 단위(^cm-1)가 있고 λ 변수는 cm 단위로 단위를 갖습니다.
13. 이미징하기 전에 현미경으로 레이저의 정렬을 확인하십시오. 레이저 경로의 묘사에 대해서는 도 2 를 참조한다. 현미경의 초기 설정 중에 현미경에 올바른 정렬을위한 가이드로 빔 경로에 두 개의 홍채를 설치하십시오. 레이저의 광학 경로가 시간이 지남에 따라 표류 할 수 있으므로 레이저 빔 경로가 홍채의 중심을 통과하여 현미경에 올바르게 들어가도록하십시오.
14. IR 뷰어를 사용하여 모든 홍채를 완전히 닫고 빔이 레이저에 가장 가까운 홍채와 마지막으로 현미경 입구 포트의 중심에 있는지 확인하십시오.
15. 먼저 펌프 빔을 점검하여 빔이 현미경으로 똑바로 들어가고 있는지 확인하십시오. 펌프가 정렬되면 Stokes 빔이 현미경에 올바르게 들어가는지 확인하십시오.
    1. 빔이 홍채를 통해 정렬되지 않은 경우, 펌프 및 스토크스 빔 패스에 대한 두 개의 미러 마운트의 x 및 y 조정 노브를 사용하여 반복적으로 빔을 홍채를 통과시킵니다.
16. 현미경에 들어가기 전에 빔 스폿이 겹치면 현미경을 올바르게 통과하고 있는지 확인하십시오.
    1. MC 소프트웨어의 이미지 획득 제어 창에서 전송을 위한 TD 채널, 일관된 스토크스 라만 채널의 경우 ALG1(아날로그 채널 1), 자극된 라만 산란 채널의 경우 ALG2(아날로그 채널 2)를 클릭합니다. 이 프로토콜에서와 같이 이득 1 및 ALG1의 오프셋 -1, ALG2의 이득 1.25 및 오프셋 -2의 설정을 사용하십시오.
       주: 시스템 구성에 따라 아날로그 채널은 개별 이미징 채널에 대해 다른 번호를 지정할 수 있습니다. SRS 검출기가 제자리에 있는 경우, 빛이 통과할 수 없기 때문에 전송 신호가 없을 것이다(즉, 이 설정에서 TD 및 ALG2를 동시에 사용하여 이미지를 시각화할 수 없음).

그림 2: 일관된 라만 레이저 이미징 경로를 위한 개략적인 레이아웃. 빔은 스폿 크기에 대해 독립적으로 조절되고 시간 지연 단계를 통해 정합되어 원하는 튜닝 주파수에 대한 샘플에서 일관된 라만 산란을 생성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

17. 파워 미터를 켜고 고출력 화력 센서를 사용하여 펌프와 스토크스 빔의 전력을 개별적으로 측정하여 실험을 수행합니다.
    참고: 이 구체적인 예에서 펌프 빔 전력은 80mW였고, 스토크스 빔 전력은 현미경 입구 이전에 180mW였습니다.
18. 이미지 획득 제어 창에서 포커스 x2 버튼을 클릭하여 MC 소프트웨어의 이미지를 봅니다.
19. 획득 설정 창에서 픽셀 비율과 유지 시간이 실험에 대해 원하는 매개변수로 설정되어 있는지 확인합니다.
    참고: 이 프로토콜에서는 1,024 x 1,024 픽셀 비율과 2μs/픽셀의 유지 시간이 사용되었습니다.
20. 펌프 빔의 차단을 해제하고 TD 채널을 살펴봄으로써 현미경에 대한 레이저 정렬을 확인합니다.
    참고: 빔이 올바른 검출기 설정으로 이미지의 중앙에 있는 경우 레이저가 제대로 정렬됩니다.
21. 그렇지 않으면 잠망경에서 X 및 Y 조정 노브를 사용하여 빔을 이미지의 중앙으로 재배치합니다.
22. CARS 및 SRS 채널 모두에서 동일한 이미지를 보고 레이저 및 현미경 정렬을 확인합니다.
23. 정렬 이미지를 획득하려면 적절한 필터 모드 세트가 있는 이미지 획득 제어 창에서 XY 스캔 버튼을 클릭하십시오(예: Kalman Line 3).
24. 이 이미지 세트를 설명이 포함된 파일 이름으로 저장하여 시간 경과에 따라 비교하고 시스템 성능/정렬을 확인합니다.

3. 지질 이미징

1. 마우스 귀와 인간 조직
   1. 새 조직을 사용하는 경우 3.1.2단계를 건너뜁니다.
   2. 마우스 귀 피부를 -20°C 냉동고에서 제거하고 10분 동안 인큐베이션 챔버(32°C)에 보관한다. 마우스 귀를 인큐베이션 챔버로부터 제거한다.
      참고: 1.1.2단계를 참조하십시오. 마우스 귀 피부 준비를 위해. 조직의 거친 취급 또는 긁힘은 조직, 특히 각질층의 기계적 분해, 파괴 또는 파괴를 초래할 수 있다.
   3. 누드 마우스 귀를 사용하는 경우, 귀의 앞쪽 부분을 35mm, No. 0 접시의 유리 바닥쪽으로 향하게하십시오. 인간의 피부를 사용하는 경우 각질층을 아래로 향하게 하여 놓으면 피상층에서 더 깊은 층으로 약물 정량화가 가능합니다(그림 1).
      참고 : 누드 마우스 귀의 뒷부분은 주택의 불완전 함이 발생하기 쉽습니다. 인간의 피부를 거꾸로 된 현미경에서 아래쪽을 향한 각질층면으로 배치하지 않으면 상당한 양의 빛이 산란되어 있고 각질층에 침투하는 약물을 볼 수 없기 때문에 진피를 지나칠 수 없습니다.
   4. 조직이 유리 바닥에 집중되면 면으로 장식 된 어플리케이터를 사용하여 피부가 평평하고 유리 바닥 접시의 커버 슬립 표면과 완전히 접촉하도록하십시오.
      참고: 이것은 완전히 평평하지 않은 경우 피부를 이미징하는 동안 어려움을 일으킬 수있는 단계입니다.
   5. 이미징하는 동안 움직임이 없도록 피부 위에 세탁기를 놓습니다. SRS 전송 감지를 위해 와셔의 중앙 구멍을 통해 조직이 보이는지 확인하십시오.
   6. 슬라이드 스테이지 삽입물을 제거하고 단일 접시 삽입물이있는 인큐베이션 챔버로 교체하십시오.
   7. 피부 조직이있는 유리 바닥 접시를 인큐베이션 챔버의 단일 접시 부착물에 놓습니다.
      참고: 또는 6웰 플레이트를 사용하여 여러 피부 샘플과 제형을 한 번에 이미지화하십시오.
   8. 더 빠른 갈보 스캐닝 속도를 위해 MC 소프트웨어의 획득 설정 윈도우(예를 들어, 1,024 x 1,024에서 512 x 512로)에서 픽셀 비율을 감소시키면서 Z 깊이는 각질층을 찾기 위해 변경된다(마우스의 경우 도 3A 또는 인간의 경우 도 3E 참조).
   9. 각질층이 발견된 후, 획득 설정 윈도우에서 축방향 위치를 제로 위치로 등록하고 각각의 특정 실험에 대한 픽셀 비율을 변경한다(예를 들어, 1,024 x 1,024).

도 3: SRS를 사용하여 얻어진 피부 깊이의 예. 이미지의 상단 세트는 다음을 묘사하는 누드 마우스 귀 피부로부터의 것이다: (A) 각질층, (B) 피지선, (C) 지방세포, (D) 피하 지방. 이미지의 하단 세트는 다음을 묘사하는 인간 피부로부터 얻어진다: (E) 각질층, (F) 유두진피, 및 (G) 피지선. 스케일 바 = 100 μm. 마우스 및 인간 피부 이미지 둘 다 1024 픽셀 x 1024 픽셀에서 20x 목표를 사용하여 획득되었다; 인간 SG는 512 x 512 픽셀로 촬영되었다. 약어: SRS = 자극된 라만 산란; SG = 피지선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 국소 제형의 적용

1. 소정의 제형을 피펫으로 피부에 투여한다(예를 들어, 10 μL/^cm2).
   참고 : 제형의 점도는 피펫 선택에서 중요한 역할을합니다. 크림이나 젤과 같은 점성 제제에는 포지티브 변위 피펫을 사용하고 용액에는 공기 변위 피펫을 사용하는 것이 좋습니다. 이 실험에서, ruxolitinib는 프로필렌 글리콜 (프로판-1,2-디올)의 간단한 용액 중의 모델 화합물이었다.
2. 주사기 또는 장갑을 낀 손가락의 플런저 팁을 사용하여 30 초 동안 시계 방향으로 제형을 문지릅니다. 제형이 추후 cPK 분석을 위해 적용되는 시간을 주목한다(아래의 단계 6.15-6.17 참조).
   참고 : 적용 기간은 실험에 따라 다릅니다. 각각은 다를 수 있습니다.
3. 제형이 투과하는 데 할당된 시간이 경과한 후, 과량의 제형을 제거하고 제형 측면이 유리-바닥 접시 쪽을 향하도록 피부를 놓는다.
   참고: 제형은 섬세한 작업 와이퍼 또는 단일 방향(예: 북쪽에서 남쪽으로)의 작은(~1인치) 3D 프린팅된 스퀴지를 사용하여 제거됩니다.

5. 약물 정량화를 위한 실험 설정

1. 펌프 빔을 803nm로 설정합니다. 광 다이오드로 펌프와 스토크스 빔 파워를 확인하여 실험에 필요한 전력인지 확인하십시오. 각 빔의 차단을 개별적으로 해제하여 전력을 측정하고 빔을 다시 차단합니다.
   참고: 이 특정 예에서 펌프 빔 전력은 100mW이고 스토크스 빔 전력은 180mW였습니다.
2. 유리 바닥 접시를 하나의 유리 바닥 접시에 삽입 한 인서트가있는 인큐베이션 챔버에 넣으십시오. 이미징 중 움직임을 방지하기 위해 클립으로 접시를 고정하십시오.
3. MC 소프트웨어에서 전송 램프를 켭니다. 아이피스를 통해 보면 조정 노브로 축 방향 초점을 조정하여 조직이 초점 내에 있는지 확인합니다.
4. 펌프와 스토크스 빔의 차단을 모두 해제합니다. ALG1 및 ALG2 채널이 활성화되어 있는지 확인한 다음 MC 소프트웨어에서 초점 x2 를 클릭하여 CARS 및 SRS 채널의 스킨을 시각화합니다. SRS 광 다이오드가 콘덴서 위의 위치에 있는지 확인합니다.
5. 장치 드롭다운 메뉴에서 다중 영역 시간 경과 (MATL)를 클릭합니다. XY 단계 경고 가 나타나는지 확인합니다. 스테이지가 기계적 원점을 찾기 위해 이동하면 [확인]을 클릭합니다.
6. MATL 모듈에서 보기로 이동한 다음 MC 소프트웨어 내에서 등록된 포인트 목록을 클릭합니다. 1) 피부 내의 특정 깊이 (즉, 각질층, SGs, 지방세포, 지질 튜닝 대비를 갖는 라이브 이미징 중에 결정된 피하 지방) 또는 2) 전체 깊이 스택을 취해야 할 경우 XY 위치를 추가하기 시작하십시오. 예를 보려면 그림 3을 참조하십시오.
   1. 각질층이 확인되면 축방향 초점(또는 z-focus)을 스크롤하여 위에서 언급한 특정 조직 계층화를 확인합니다. 인간 및 마우스 피부 내의 예를 위해 도 3 을 참조한다.
   2. 전체 Z 깊이 스택이 아닌 특정 깊이를 이미징하는 경우 각 스킨 계층화에 대해 등록 지점을 클릭하여 MATL 큐에 추가합니다. 전체 깊이 스택의 경우 획득 매개변수 창에서 깊이 선택을 하고 각 XY 위치에 대해 점 등록을 클릭합니다.
   3. 원하는 모든 XY(전체 Z-깊이 스택) 또는 XYZ(특정 스킨 계층화) 위치가 MATL 소프트웨어 내에 등록되면 이미지 및 cPK 분석 실험 전체에서 일관된 방식으로 파일 디렉토리와 이름을 변경합니다(단계 6.15-6.17 참조).
7. MATL 모듈에서 반복 횟수를 1 로 설정하고 준비(Ready)를 클릭합니다. Play 가 회색에서 검은색 화살표로 변경되어 소프트웨어가 준비되었음을 나타낼 때까지 기다립니다. Play 를 눌러 예비 지질 스택(이하 지질 이미지)의 이미징을 시작합니다.
   참고: 이것은 분석 동안 개별 조직 계층화의 지질이 풍부한 영역과 지질이 부족한 영역을 분리하는 데 사용됩니다. 주기와 총 시간은 등록된 점 목록의 오른쪽 하단에 표시됩니다.
8. 사이클이 완료되면 펌프와 스토크스 빔을 모두 차단하십시오. 레이저 그래픽 사용자 인터페이스의 파장을 표적 파장 또는 라만 진동에 기초하여 원하는 파장으로 변경한다.
   참고: 예를 들어, 펌프 빔의 경우 843nm는 Eq. (2)를 사용하여 2,250cm-1을 대상으로 하는 데 사용되며 모터 미세 조정은 50.1로 변경됩니다. 여기에 제시된 예시적인 약물인 ruxolitinib은 2,250 ^cm-1을 표적화할 수 있는 니트릴을 함유한다. 피부 구조를 목표로하는 파수는 항상 동일합니다 (2,850 ^cm-1); 그러나 API의 웨이브 번호는 임의의 웨이브 넘버가 될 수 있지만 선험적으로 알려지거나 계산되어야합니다.
9. 수동 시간 지연 단계(그림 2)를 조정하여 새 파장과 펌프 빔 전력에 대한 시간 중복을 보장합니다. 선험적으로 확립 된 지질 및 API 이미징에 동일한 힘이 사용되는지 확인하십시오.
10. 주기당 지속 시간을 사용하여 실험당 필요한 총 반복 수를 계산합니다. 실험의 총 원하는 시간 과정을 주기 기간의 경과로 나누기만 하면 됩니다.
    참고: 주기 지속 시간은 이미지 크기, 픽셀 유지 시간, Kalman 평균 및 주기당 이미지 수의 함수입니다. 이러한 매개 변수를 최적화하면 주기 시간이 단축되어 시간 분해능이 증가합니다.
11. 총 사이클 반복 횟수를 선택했으면 펌프 빔의 차단을 해제하고 광 다이오드를 사용하여 전력을 확인한 다음 원하는 전력과 일치하는지 확인하십시오. 마지막으로 스토크스 빔의 차단을 해제하여 이미징을 허용합니다.
12. Play를 눌러 세트포인트의 자동 이미징을 시작합니다.
13. MATL 이미징이 완료된 후, 펌프 빔을 다시 803nm로 전환하고 5.1단계에서 사용된 원래의 지질 이미징 파워로 전력을 다시 조정한다.
14. 이전 단계와 마찬가지로 연구 전반에 걸쳐 실험 후 이미지에 대해 일관되게 파일 이름을 변경합니다.
15. 반복 횟수를 1로 설정합니다.
16. 준비 |를 클릭합니다. 재생 버튼은 사후 시간-코스 지질 스택을 획득하고 이미징 동안 조직 이동이 없었는지 확인합니다(그림 4).

그림 4: 누드 마우스 귀 피부에서의 조직 움직임은 피지선을 시각화하여 입증되었습니다. 제한된 조직 이동의 예는 A 및 B에 묘사되어 있는 반면, 실질적인 조직 이동은 C 및 D에 묘사되어 있다. (A)는 제제 적용시의 피지선을 나타내고 (B)는 도포 후 120분에서 동일한 깊이를 나타낸다. (c) 제형 적용시의 마우스 피지선 및 (D) 제형 적용 후 120분; 피지선은 거의 보이지 않으며,이 실험은 전체 실험 기간 동안 피지선으로의 흡수를 측정하지 않았다는 표시입니다. 스케일 바 = 100 μm. 이미지는 1024 픽셀 x 1024 픽셀입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 데이터 분석

1. 이미지를 . OIB (또는 . OIR 은 현미경 및 MC 소프트웨어) 파일 형식에 따라 각 XYZ 위치에 별도의 하위 폴더를 갖는다.
2. 지질 이미지의 이름을 다음 끝 _lipid.oib로 변경하여 API 채널 이미지로 지질 이미지를 컴파일합니다.
3. 각 피부 층화와 함께 다음 단계를 수행하십시오 (여기서는 단순성을 위해 SG 계층화 만 사용하여 입증되었습니다. 그림 3B 참조).
   1. SG 지질 이미지를 ImageJ(또는 피지)³⁴ 로 가져오고 채널 분할이라는 레이블이 지정된 상자를 선택하여 파일을 CARS 및 SRS 채널로 분할 합니다.
      참고: 피지는 파일을 채널 수에 걸쳐 실험 중에 획득한 이미지 수로 분할합니다.
   2. | 분석을 클릭하여 관심 지역(ROI) 관리자를 엽 도구 | ROI 관리자.
   3. SRS 채널(예를 들어, C=1)을 사용하여, 이미지에서 SG를 구분한다.
      참고: SG는 목표 -CH₂- 진동으로 인해 밝은 위치입니다.
   4. ROI 관리자에서 Add [t] 를 클릭하거나 키보드에서 t를 눌러 ROI 관리자에 추가하십시오. 이미지 내의 각 SG에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
   5. 지질이 풍부한 영역을 마스킹하려면 각 ROI를 선택하고 자세히 탭을 클릭 합| 또는 (결합) | ROI 관리자에 추가합니다.
   6. 지질이 부족한 영역을 마스크하려면 FIJI 메뉴의 사각형 도구를 사용하여 전체 이미지 주위에 사각형을 그립니다. 이를 ROI 관리자에 추가하십시오.
   7. ROI 관리자에서 지질이 풍부한 모든 영역을 선택하는 ROI 외에 새로 추가된 정사각형 ROI를 클릭합니다. 자세히에서 XOR 을 선택하여 지질 불량 영역의 마스크를 생성하고 ROI 관리자에 추가합니다.
4. API 이미지를 피지에로드하십시오.
5. 다음 메뉴 시퀀스를 사용하여 이미지를 숫자 순서(예: Image0001, Image0002, Image0003 등)로 연결합니다: 이미지 | 스택 | 도구 | 연결.
   1. 또는 이미지 중 하나를 피지로 로드한 다음 설정 페이지에서 비슷한 이름의 파일 그룹화라는 옵션을 선택하여 이러한 이미지를 가져옵니다.
      참고: 이렇게 하면 파일 이름이 비슷한 모든 이미지를 가져와 자동으로 연결할 수 있습니다.
6. 연결된 이미지를 활성화한 상태에서 ROI 관리자로 이동하여 지질이 풍부한 영역(예 : SG)을 선택하고 자세히를 클릭한 다음 다중 측정을 선택합니다. 결과 창이 나타날 때까지 기다립니다.
7. 기본 측정 설정에서 영역, 평균, 최소, 최대 및 중앙값을 찾습니다. 분석을 위해 다른 메트릭이 필요한 경우 측정값 설정 창에서 관련 확인란을 선택하여 이러한 옵션을 활성화합니다(분석 | 측정 설정 ...).
8. 결과 창에서 스프레드시트로 데이터를 내보내고 지역이라는 제목의 열을 추가합니다.
9. 지질이 풍부한 영역에 대한 데이터의 각 행에 지질이 풍부한 것을 추가하십시오. 지질 밖에 있던 부위에 지질이 부족한 부위를 첨가한다.
10. 제목이 붙은 컬럼 레이어 를 추가하고 분석된 각각의 층을 추가한다(보충 표 S1).
11. 적절한 ROI가 선택되는 동안 지질 불량 영역에 대해 6.5 - 6.7 단계를 반복하십시오.
12. 데이터를 시각화하려면 스프레드시트를 저장하고 JupyterLab(패키지 matplotlib)³⁵ 또는 R(패키지 ggplot2)³⁶으로 가져옵니다. 데이터를 이미지 수 대 평균 강도의 함수로 플롯하여 농도 시간 데이터를 추정합니다. (그림 5).
13. 스프레드시트를 RStudio로 가져와서 CRI 데이터의 약동학 분석을 위한 비구획 분석(NCA)을 수행합니다.
14. 시간이라는 제목의 열을 추가합니다.
15. Image0001의 경우 포뮬레이션 적용과 첫 번째 이미지 사이의 지속 시간을 계산합니다.
    참고: 이것은 첫 번째 시점입니다. 주기 지속 시간은 시간이 지남에 따라 증가하는 나머지 이미지(따라서 시간 지점)를 계산하는 데 사용됩니다. 예를 들어 응용 프로그램 이후 시간이 30분이면 Image0001의 시점은 30분이고 주기 지속 시간은 8분이고, Image0002의 시점은 38분, Image0003의 시점은 46분 등입니다.
16. 스프레드시트에서 가져온 강도 시간 데이터에 대해 RStudio(NonCompart 패키지 사용)³⁷ 에서 NCA를 실행하고, 하나의 레이어/영역을 다음과 같이 호출합니다.
    sNCA(x = 시간, y = 평균, 용량 = 1, timeUnit = "s", doseUnit ="mg")
    여기서 x는 시점을 의미하고, y는 강도를 의미하고, 투여량은 제형 또는 생성물 투여량에서 약물의 mM 투여량으로서 계산된 하나로서 남아있을 수 있다.
    참고: NCA 출력은 C_max 및 AUC_all과 같은 매개 변수를 제공합니다. 그러나, 이것이 생체외 피부이기 때문에, 이들 파라미터는, 실제로,_Jmax 및 AUC_{플럭스-올이다}.
17. _Jmax와 AUC_{플럭스-모든} 메트릭을 실험 조건 전반의 통계적 비교 외에도 플로팅하여 시각적으로 비교합니다(그림 6). 생체외 CRI 연구의 분석의 예는 도 6을 참조한다.
    참고: 적절한 통계 테스트는 각 특정 데이터 세트에 따라 결정됩니다. 또한 모든 약동학 파라미터는 로그-정상적으로 분포되어 있으며, 모든 비교는 로그-변환된(자연 로그 또는 log10) 데이터를 사용해야 한다는 점에 유의해야 합니다.

그림 5: 강도 대 시간 프로필 (A) 포화에 도달하여 강도의 감소만 보이는 플럭스 프로파일의 예가 보인다. 각 ROI에는 획득 할 수있는 데이터의 이질성을 입증하기 위해 다른 플럭스 프로파일이 있습니다. (B) 영상화가 시작된 후 증가하는 농도의 예. 각 ROI는 동일한 실험의 동일한 조직 내에서 다른 시야 (다른 색상 흔적으로 표시됨)입니다. 글로벌 농도 외에도 지질이 풍부하고 지질이 부족한 지역으로 표시된 API / 제형이 선호하는 지역 환경을 해명하는 능력이 있습니다. A 에 제시된 프로파일은 API가 이미 침투하여 이미징이 시작되면 조직을 떠나기 시작했기 때문에 조직에 약물이 흡수되지 않았 음을 나타냅니다. 그러나, B에서, 조직은 포화에 도달하지 않았고, API의 흡수 후 제거가 여전히 존재한다. 이미지를 지질이 풍부하고 지질이 부족한 것으로 세분화하는 것은 API (또는 비활성)의 국소화 및 피부 (즉, 각질층)로의 투과 경로의 해명에 도움이 될 것입니다. 지질이 풍부한 영역 내에서 더 높은 농도는 API가 조사중인 층의 지질 구조 내에 국소화되어 표적 약물 전달 정보를 돕는다는 것을 나타냅니다. 약어: ROI = 관심 지역; API = 활성 약제학적 성분. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

이미징은 실험 완료 시 조직이 축방향(<10μm) 또는 횡방향으로 유의하게 이동하지 않은 경우 성공적인 것으로 간주됩니다(그림 4). 이는 관심 있는 API에 대한 SRS 측정이 정량화가 계층별 초기 깊이를 나타내지 않는 경우 즉각적인 표시입니다. 이는 관심 있는 각 XY 위치에 대해 z-스택을 이미징하여 완화되며, 트레이드오프는 시간 해상도입니다. 냉동 피부가 이러한 연구에 사용되는 경우, API의 침투 및 투과는 신선한 피부에 비해 빠르며, 제형 적용과 이미징 시작 사이의 최소 시간이 필수적입니다. 또 다른 고려 사항은 실험에 사용 된 목표입니다. 60x 목표를 사용하는 경우 단일 시야각(FOV) 내에서 평평한 표면을 선택하는 것이 비교적 쉽습니다. 그러나, 20x 목표의 경우, 전망 필드가 훨씬 더 크고, 따라서, 조직 준비의 핵심 단계는 유리바닥 이미징 접시와 피부의 균일한 접촉을 보장하는 것이다. FOV 내의 원래 깊이와 비교하여 평평한 FOV와 유사한 깊이는 긍정적...

토론

국소 BA / BE의 평가는 단일 방법이 생체 내 cPK를 완전히 특성화 할 수 없기 때문에 다각적 인 접근이 필요한 연구 영역입니다. 이 프로토콜은 일관된 라만 이미징을 기반으로 국소 의약품의 BA / BE를 평가하기위한 방법론을 제시합니다. 간과 될 수있는 첫 번째 포인트 중 하나는 특히 정량적 전송 SRS 이미징의 경우 피부 샘플이 얼마나 얇아야하는지입니다. 피부가 너무 두꺼우면(즉, 빛이 쉽게 통과할 수 없는 경우), SRS 검출기에 의해 측정된 신호가 거의 또는 전혀 존재하지 않으며, 따라서 불량한 농도 데이터를 제공할 것이다. 이러한 조직 샘플을 적절하게 준비하려면 실험을 만들거나 중단 할 수 있으므로주의를 기울여야합니다. 누드 마우스 귀의 관점에서, PBS로 헹구고 귀에 남아있는 먼지를 제거하기 위해 건조시키는 것 외에, 거의 준비가 필요하지 않습니다.

마우스 귀는 전형적으로 수백 μm의 두께이며, 이는 SRS 전송에 최적이다. 인간 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Tissue Preparation
Autoclavable Biohazard Bags	FisherBrand	22-044562	텍스트에서 언급 한대로: biohazard bags https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562& 검색 유형 = RAPID & matchedCatNo=22044562
세포 배양 완충액: Dulbecco의 인산염 완충 염 용액 1x	Corning	MT21030CV	텍스트에서 참조: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv& 검색 유형= RAPID& matchedCatNo=21-030-cv
일회용 메스	Exel International	14-840-00	텍스트에서 참조된 대로: scalpel https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true
고정밀 45° 앵글 브로드 포인트 핀셋 / 집게	Fisherbrand	12-000-132	텍스트에서 언급 한대로 : forceps https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword=
Kimwipes 섬세한 작업 와이퍼, 1-Ply	Kimberly-Clark Professional Kimtech Science	06-666	본문에 언급된 바와 같이: task wiper https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666
Parafilm M Laboratory Wrapping Film	Bemis	13-374-12	본문에 언급된 바와 같이: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412
Petri Dish (35 mm x 10 mm)	Fisherbrand	FB0875711YZ	본문에 언급된 바와 같이: 작은 페트리 접시 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true
페트리 접시 (60 mm x 15 mm)	Fisherbrand	FB0875713A	본문에 언급된 바와 같이: 큰 페트리 접시 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true
외과용 가위	Roboz	NC9411473	텍스트에서 언급 한대로: scissors https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC& 검색 유형 = RAPID & matchedCatNo=RS-5915SC
Laser/microscope
650/60 nm BrightLine single-band bandpass filter	Semrock		텍스트에서 언급 : CARS 필터 - CH2 진동 (645nm / 60nm 필터)
컨트롤 박스 IX2-UCB	올림푸스		텍스트에서 언급 : 컨트롤 박스
D700 / 30m	Chroma		텍스트에서 언급 : CARS 필터 - 중수소 대역 < > https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m
DeepSee Insight	Spectra-Physics		텍스트에서 언급 : Laser https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser
Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console	ThorLabs	PM100D	본문에서 언급 : power meter https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
Fluoview 소프트웨어	올림푸스		본문에서 언급 : 현미경 제어 소프트웨어
서리 낀 현미경 슬라이드	FisherBrand		본문에서 언급 : microscope slides https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446
FV1000	올림푸스		텍스트에서 언급 : 현미경
배양 챔버	Tokai Hit	GM-800	텍스트에서 언급 : 인큐베이션 챔버
통합 구 광 다이오드 전력 센서	ThorLabs	S142C	텍스트에서 언급 : photodiode https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
전원 공급 장치 FV31-PSU	올림푸스		본문에서 언급 된 바와 같이: Power Supply
Precision 4063, 80MHz 이중 채널 함수 발생기	BK 정밀도		본문에서 언급 된대로 : 함수 발생기
ProScan – 정밀 현미경 자동화	이전 과학 기기		텍스트에서 참조: stage controller https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation
SecureSeal Imaging Spacers	Grace Biolabs	654004	텍스트에서 참조: spacer https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/
SRS 탐지 키트	APE		텍스트에서 언급된 대로: SRS 검출기
UPLSAPO 20X NA:0.75	Olympus		텍스트에서 언급된 대로: 20X Objective https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/
Lipid/Drug Imaging
35mm 접시, No. 0 코팅되지 않은 커버 슬립, 14mm 유리 직경	MatTek Corporation	NC9711297	텍스트에 언급 된 바와 같이 : 유리 바닥 접시 https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297
코튼 팁 애플리케이터	FisherBrand		텍스트에 언급 된 바와 같이: 코튼 팁 애플리케이터
Distriman 포지티브 변위 피펫	Gilson		본문에서 언급 한 바와 같이 : Postive Displacement Pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword=
Distriman Postive Displacement Pipette Tips	Gilson		본문에서 언급 된 바와 같이: Tips for pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true
Data Analysis
FIJI	오픈 소스		텍스트에서 참조: FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/
Jupyter-Lab	오픈 소스		텍스트에서 참조: JupyterLab https://jupyter.org/
Rstudio	오픈 소스		텍스트에서 참조: Rstudio https://www.rstudio.com/