피부 내의 제약 화합물을 시각화하고 정량화하기 위한 일관된 라만 산란 영상화 방법론이 기재되어 있다. 이 논문은 피부 조직 제제 (인간 및 마우스) 및 국소 제형 적용, 시공간 농도 프로파일을 정량화하기위한 이미지 획득 및 국소 약물 전달을 평가하기위한 예비 약동학 분석에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
국소 제형 적용 후의 피부 약동학 (cPK)은 국소 생체 이용률 (BA)을 기계적으로 이해하기 위해 규제 및 약물 개발 과학자들에게 특히 관심이있는 연구 분야였습니다. 테이프 스트리핑, 진피 미세투석, 또는 진피 개방 유동 미세관류와 같은 반침습적 기술은 모두 매크로스케일 cPK를 정량화한다. 이러한 기술은 방대한 cPK 지식을 제공했지만 커뮤니티는 활성 제약 성분 (API) 침투 및 세포 수준에서의 투과에 대한 기계론적 이해가 부족합니다.
마이크로 스케일 cPK를 다루기 위한 한 가지 비침습적 접근법은 외인성 라벨이나 화학적 변형 없이 내재적 분자 진동을 선택적으로 표적으로 하는 코히어런트 라만 산란 영상(CRI)이다. CRI에는 API 또는 비활성 성분의 민감하고 선택적인 정량화를 가능하게 하는 두 가지 주요 방법인 일관된 안티스토크스 라만 산란(CARS)과 자극된 라만 산란(SRS)이 있습니다. CARS는 일반적으로 구조적 피부 정보를 도출하거나 화학적 대조를 시각화하는 데 사용됩니다. 대조적으로, 분자 농도와 선형인 SRS 신호는 피부 층화 내의 API 또는 비활성 성분을 정량화하는 데 사용된다.
마우스 조직이 CRI를 갖는 cPK에 대해 일반적으로 활용되었지만, 국소 BA 및 생물학적 동등성 (BE)은 궁극적으로 규제 승인 전에 인간 조직에서 평가되어야합니다. 이 논문은 국소 BA 및 BE의 평가에서 정량적 약동학적 CRI 연구에 사용되는 생체외 피부를 제조하고 이미지화하는 방법론을 제시한다. 이 방법론은 시간이 지남에 따라 인간과 마우스 피부 내에서 신뢰할 수 있고 재현 가능한 API 정량화를 가능하게합니다. 지질이 풍부하고 지질이 부족한 구획 내의 농도뿐만 아니라 시간에 따른 총 API 농도가 정량화됩니다. 이들은 마이크로 및 매크로 스케일 BA의 추정에 활용되며, 잠재적으로 BE입니다.
서론
국소 약물 제품 적용 후 cPK를 평가하기위한 방법론은 고전적인 시험관 내 투과 시험 (IVPT) 연구 1,2,3,4,5 및 테이프 스트리핑 6,7,8에서 개방 유동 미세 관류 또는 피부 미세 투석과 같은 추가 방법론으로 확장되었습니다 9,10,11, 12,13,14. 관심있는 질병에 따라 치료 작용의 잠재적으로 다양한 국소 부위가 있습니다. 따라서 API가 의도 된 ....
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프로토콜
누드 마우스 귀 조직의 사용은 매사추세츠 종합 병원 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았으며 인간의 피부 조직 사용은 매사추세츠 종합 병원 기관 검토위원회 (IRB)의 승인을 받았습니다. IACUC 프로토콜에 따르면, 갓 안락사된 마우스는 누드 마우스 콜로니를 가진 협력자로부터 수득되었다. 인간 조직은 승인 된 프로토콜을 통해 매사추세츠 종합 병원의 선택 복부 성형술 절차에서 조달되었습니다. 또한, 복부 피부 이외의 특정 조직 유형은 신체 기증 기관을 통해, 또한 IRB 승인 프로토콜을 통해 획득되었다.
1. 조직의 제조
- 누드 마우스 귀 피부 조직의 제조
- 갓 수확한 누드 마우스 시체를 얻은 후 포셉과 미세외과 가위를 사용하여 귀를 제거합니다. 한쪽 귀를 작은 페트리 접시 (즉, 35mm x 10mm)에 넣으십시오. 누드 마우스 몸체를 지역 IACUC 프로토콜에 따라 폐기할 생물학적 위험 백에 넣는다.
- 각 마우스 귀를 인산염 완충 식염수(PBS)로 헹구고 작업 와이퍼로 부드럽게 두드려 말립니다. 두 번 반복하여 이미징 품질에 영향을 줄 수 있는 귀에 잔류 먼지나 이물질을 제거합니다( 그림 1 참조). ....
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결과
이미징은 실험 완료 시 조직이 축방향(<10μm) 또는 횡방향으로 유의하게 이동하지 않은 경우 성공적인 것으로 간주됩니다(그림 4). 이는 관심 있는 API에 대한 SRS 측정이 정량화가 계층별 초기 깊이를 나타내지 않는 경우 즉각적인 표시입니다. 이는 관심 있는 각 XY 위치에 대해 z-스택을 이미징하여 완화되며, 트레이드오프는 시간 해상도입니다. 냉동 피부가 이러한 연구에 사용되는 경우, API의 침투 및 투과는 신선한 피부에 비해 빠르며, 제형 적용과 이미징 시작 사이의 최소 시간이 필수적입니다. 또 다른 고려 사항은 실험에 사용 된 목표입니다. 60x 목표를 사용하는 경우 단일 시야각(FOV) 내에서 평평한 표면을 선택하는 것이 비교적 쉽습니다. 그러나, 20x 목표의 경우, 전망 필드가 훨씬 더 크고, 따라서, 조직 준비의 핵심 단계는 유리바닥 이미징 접시와 피부의 균일한 접촉을 보장하는 것이다. FOV 내의 원래 깊이와 비교하여 평평한 FOV와 유사한 깊이는 긍정적.......
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토론
국소 BA / BE의 평가는 단일 방법이 생체 내 cPK를 완전히 특성화 할 수 없기 때문에 다각적 인 접근이 필요한 연구 영역입니다. 이 프로토콜은 일관된 라만 이미징을 기반으로 국소 의약품의 BA / BE를 평가하기위한 방법론을 제시합니다. 간과 될 수있는 첫 번째 포인트 중 하나는 특히 정량적 전송 SRS 이미징의 경우 피부 샘플이 얼마나 얇아야하는지입니다. 피부가 너무 두꺼우면(즉, 빛이 쉽게 통과할 수 없는 경우), SRS 검출기에 의해 측정된 신호가 거의 또는 전혀 존재하지 않으며, 따라서 불량한 농도 데이터를 제공할 것이다. 이러한 조직 샘플을 적절하게 준비하려면 실험을 만들거나 중단 할 수 있으므로주의를 기울여야합니다. 누드 마우스 귀의 관점에서, PBS로 헹구고 귀에 남아있는 먼지를 제거하기 위해 건조시키는 것 외에, 거의 준비가 필요하지 않습니다.
마우스 귀는 전형적으로 수백 μm의 두께이며, 이는 SRS 전송에 최적이다. 인간 .......
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공개 사항
CLE는 여러 현미경 제조업체에 허가된 CARS 현미경 특허에 대한 발명가입니다. 다른 모든 저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자들은 에반스 그룹의 Fotis Iliopoulos 박사와 Daniel Greenfield 박사에게이 원고에 대한 토론과 교정에 감사드립니다. 또한 저자는 LEO Pharma의 지원을 인정하고 싶습니다. 그림 2는 BioRender.com 로 작성되었습니다.
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재료
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| 세포 배양 완충액: Dulbecco의 인산염 완충 염 용액 1x | Corning | MT21030CV | 텍스트에서 참조: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv& 검색 유형= RAPID& matchedCatNo=21-030-cv |
| 일회용 메스 | Exel International | 14-840-00 | 텍스트에서 참조된 대로: scalpel https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true |
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| Kimwipes 섬세한 작업 와이퍼, 1-Ply | Kimberly-Clark Professional Kimtech Science | 06-666 | 본문에 언급된 바와 같이: task wiper https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666 |
| Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Bemis | 13-374-12 | 본문에 언급된 바와 같이: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412 |
| Petri Dish (35 mm x 10 mm) | Fisherbrand | FB0875711YZ | 본문에 언급된 바와 같이: 작은 페트리 접시 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true |
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| 외과용 가위 | Roboz | NC9411473 | 텍스트에서 언급 한대로: scissors https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC& 검색 유형 = RAPID & matchedCatNo=RS-5915SC |
| Laser/microscope | |||
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| Data Analysis | |||
| FIJI | 오픈 소스 | 텍스트에서 참조: FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/ | |
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참고문헌
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