Method Article

시아노박테리아의 피코빌리좀의 격리 및 특성화

DOI:

10.3791/63272

⸱

November 10th, 2021

 , 
1Department of Life Science, National Taiwan University, 2Institute of Plant Biology, National Taiwan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

현재 프로토콜은 불연속 자당 밀도 그라데이션을 통해 원심분리에 의한 시아노박테리아로부터의 피코빌리좀의 분리를 자세히 설명합니다. 그대로 피코빌리좀의 분획은 77K 형광 스펙트럼 및 SDS-PAGE 분석에 의해 확인된다. 결과 물리경분획은 TEM 및 질량 분광법 분석의 음수 염색에 적합합니다.

Abstract

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시아노박테리아에서 피코빌리솜은 빛을 수확하고 광화학을 위해 광시스템 I와 II로 에너지를 전달하는 중요한 안테나 단백질 복합체입니다. 식물성 생물의 구조와 구성을 연구하는 것은 시아노 박테리아에서 광합성의 진화와 차이를 드러내기 때문에 과학자들에게 큰 관심사입니다. 이 프로토콜은 비드 비터에 의해 저렴한 비용으로 시아노균 세포를 분해하는 상세하고 최적화된 방법을 제공합니다. 그대로 피코빌리솜은 자당 그라데이션 초원심분리에 의해 세포 추출물로부터 분리될 수 있다. 이 방법은 다른 세포 모형을 가진 모형 및 비 모형 시아노박테리아 둘 다에 적합한 다는 것을 보여주었습니다. 또한 77K 형광 분광기 및 아연 황산염 및 쿠마시 블루에 의해 얼룩진 SDS-PAGE에 의해 물리 코빌리단백질의 무결성과 특성을 확인하기 위한 단계별 절차가 제공됩니다. 격리된 피코빌리솜은 또한 추가 구조 및 조성 분석을 실시할 수 있다. 전반적으로,이 프로토콜은 치아 노 박테리아에 익숙하지 않은 연구원이 신속하게 분리하고 그대로 피코빌리솜을 특성화 할 수있는 유용한 시작 가이드를 제공합니다.

Introduction

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Phycobilisome (PBS)는 시아노 박테리아1의 틸라코이드 막에서 광시스템의 세포질 측에 부착하는 거대한 수용성 안료 단백질 복합체입니다. PBS는 주로 유색 물리 단백질과 무색 링커 단백질1,2로 구성됩니다. 물리코빌리단백질은 물리에리스린, 피코에리스로시아닌, 피코시아닌 및 동종코시아니닌3의 4가지 주요 그룹으로 나눌 수 있습니다. 4개의 주요 단은 엽록소가 비효율적으로 흡수한 490-650 nm 범위에서 다른 광에너지를 흡수합니다3. PBS는 광 에너지를 수집하고 광시스템 II 및 I4에 전달하기 위한 광 수확 안테나 역할을 할 수 있습니다.

PBS의 구조와 구성은 종마다 다릅니다. 전체적으로, 피코빌리솜의 세 가지 모양 (헤미디스탈, 번들 모양 및 막대 모양)은 다른 시아노박테리아 종5에서 확인되었습니다. 같은 종에서도 PBS의 조성은 광질 및 영양 고갈과 같은 환경에 반응하여 변화합니다

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Protocol

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시코시스테티스 SP. PCC 6803, 모델 포도당 내성 균주, 박사에서 얻은 추, Hsiu-An 아카데미아 시니카, 대만. 렙토렝비아 SP. JSC-1, 비 모델 필라멘트, 미국 펜실베니아 주립 대학에서 박사 도널드 A. 브라이언트에서 얻은.

1. 세포 배양 및 수확

  1. 비헤페스 배지28의 50mL를 포함하는 100mL 원추형 플라스크로 금속 접종 루프를 사용하여 접종Syn6803 또는 JSC-1 세포를 접종한다. 배양이 중간 지수 성장 단계(OD750 = 0.6-0.8)에 도달할 때까지 자기 교반기(120 rpm)에 의해 일정한 교반을 하는 50 μmol 광자 m-2 s-1(백색광 LED) 하에서 30°C에서 세포를 배양한다.
    참고: 750nm(OD750)에서 배양의 광학 밀도가 0.6-0.8에 도달하면 새로운 플라스크로 이송하여 세포 배양을 수확한다. 광학 밀도는 액체 배양에서 미생물 세포 밀도를 추정하기 위해 일상적으로 사용되었다29. 720-750 nm의 파장은 시아노균 ....

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Results

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Syn6803 및 JSC-1 세포는 30°C에서 B-HEPES 배지에서 일정한 교반을 하는 원추형 플라스크에서 재배되었으며, LED 백색광(50 μmol 광자 m-2s-1)에서 1%(v/v) CO2로 채워진 성장 챔버에서 재배하였다. 기하급수적 성장 단계(OD750 = ~0.5)에서, 세포는 최종 광학 밀도 OD750 = ~0.2를 가진 신선한 배지로 하위 배양되었다. 후기 지수 성장 단계(OD750 = 0.6-0.8)에 도달한 후 배양물(실온에서 20분 동안 10,000 x g)을 수집하고 원심분리하였다. 상판은 폐기되었고, 다음 단계가 가능할 때까지 세포 펠릿은 -80°C로 저장되었다.

세포를 깨기 위해 세포는 먼저 실온에서 해동되었습니다. 세포는 0.75 M K-인산염 버퍼 내에서 0.1mm 유리 구슬로 비드 를 때리면서 중단되었습니다. 완전.......

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Discussion

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이 프로토콜은 시아노박테리아, 단세포 모델 Syn6803 및 필라멘트 비모델 JSC-1의 두 가지 유형에서 그대로 PBS를 격리하는 간단하고 표준적인 방법을 설명합니다. 프로토콜의 중요한 단계는 자당의 불연속 밀도 그라데이션에 세포 균질화 및 초원심 분리입니다. 일반적으로 필라멘트 세포의 중단은 단세포 세포보다 더 복잡합니다. 시작 물질의 양을 증가 (세포 펠릿의 젖은 무게) 및 구슬 구타의 반복은 필라멘트 시아노박테리아 세포에서 PBS의 수율을 증가시키는 데 도움이되었다. 필라멘트 시아노박테리움, JSC-1의 경우, 단세포 1, Syn6803보다 3배 더 많은 세포가 사용되었다. 또한 필라멘트 시아노박테리움을 완전히 깨기 위해서는 추출 버퍼에서 어두운 푸르스름한 보라색 색상을 관찰하기 위해 단세포 시아노박테리아보다 구단 박동이 더 필요합니다.

비드 구타의 지속 기간은 샘플이 각 비드 박동 주기 동안 가열되기 때문에 30 s를 초과하는 것이 좋습니다. 튜브는 그대로 PBS가 낮은.......

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Disclosures

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저자는 경쟁적인 관심을 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

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저자는 기술 공용, 생명 과학 대학, 울트라 센드 심분리기의 편리한 사용에 대한 국립 대만 대학 감사합니다. 시아노균 균주 시코시티스 sp. PCC 6803 및 렙토립비아 sp. JSC-1은 미국 펜실베이니아 주립 대학의 아카데미미아 시니카의 추, Hsiu-An 박사, 미국 펜실베이니아 주립 대학의 도널드 A. 브라이언트 박사로부터 각각 재능이 있었습니다. 이 작품은 과학기술부(대만)(109-2636-B-002-013-110-2628-B-002-065-)와 교육부(대만) 유산영장프로그램(109V1102, 110V102)이 지원했다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1mm 유리 구슬PBS 추출용BioSpec11079101
13mL 원심분리 튜브Hitachi13PA초원심분리
40mL 원심분리 튜브Hitachi40PA초원심분리
, 아세트산Merck8.1875.2500Coomassie Blue 염색,
B-HEPES 배지BG-11 매체
Brilliant Blue R-250SigmaB-0149Coomassie Blue 염색
Bromophenol 블루Wako 순수 화학 산업2-291단백질 로딩 버퍼
전자 저울RadwagWLC 2/A2/C/2세포 펠릿의 습식 중량 측정을 위한
광 분광 광도계HitachiF-7000분광 광도계
글리세롤BioShopGly001.500단백질 로딩 버퍼
용고속 냉장 원심분리기HitachiCR22N
leptolyngbya sp. JSC-1실베니아 주립 대학의 도널드 A. 브라이언트 박사의
저온 측정 액세서리Hitachi5J0-0112액세서리에는 77K 형광 분광법용 투명 Dewar 용기가 포함되어 있습니다.
메탄올Merck1.07018,2511Coomassie Blue 염색
마이크로 원심분리기Thermo FisherPico 21PBS 추출용
Mini-Beadbeater-16BioSpec모델 607PBS 추출용
산칼륨 이염기성PanReac AppliChem121512.121PBS 추출
인산칼륨 일염기PanReac AppliChem141509.121PBS 추출용
스크류 캡 바이알PBS 추출용BioSpec10832
SmartView Pro Imager주요 과학Znic 염색 신호 감지를 위한UVCI-2300
Sodium dodecyl sulfateZymesetBSD101단백질 로딩 버퍼
SucroseZymesetBSU101PBS 분리
용 Zymeset BSU101Synechocystis sp. 대만Academia Sinica의 Dr. Chu, Hsiu-An의
TrisBioShopTRS 011.1단백질 로딩 버퍼
Triton X-100BioShopTRX 506.500PBS 추출용
Ultra 10 K 멤브레인 원심 필터MilliporeUFC901024버퍼 교환용
울트라 3 K 멤브레인 원심 필터MilliporeUFC500324버퍼 교환용
초원심분리기HitachiCP80WX초원심분리
UV/Vis 분광 광도계AgilentCary 60분광 광도계
산아연PanReac AppliChem131787.121Znic 염색
&베타;-메르캅토에탄올BioBasicMB0338단백질 로딩 버퍼
, , , , 형교환 펜 JSC-1. 인성 PCC 6803 포도당 내성 균주황

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model. Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).
  2. Glazer, A. N. Phycobilisomes: Structure and dynamics. Annual Review of Microbiology.

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