세포 대사를 평가하기 위한 자가형광 이미징

요약

이 프로토콜은 내인성 대사 조효소, 환원된 니코틴아미드 아데닌(인산염) 디뉴클레오타이드(NAD(P)H) 및 산화된 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드(FAD)의 형광 이미징 및 분석을 기술한다. NAD(P)H 및 FAD의 자가형광 이미징은 세포 대사를 평가하기 위한 라벨이 없는 비파괴적인 방법을 제공한다.

초록

세포 대사는 세포가 에너지를 생성하는 과정이며, 암을 포함한 많은 질병은 비정상적인 신진 대사를 특징으로합니다. 환원된 니코틴아미드 아데닌(포스페이트) 디뉴클레오타이드(NAD(P)H) 및 산화된 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드(FAD)는 대사 반응의 조효소이다. NAD(P)H 및 FAD는 자가형광을 나타내며 여기 및 방출 파장에 의해 분광적으로 분리될 수 있다. 조효소인 NAD(P)H 및 FAD는 모두 유리 또는 단백질 결합 구성으로 존재할 수 있으며, 이들 각각은 형광단이 여기된 상태로 유지되는 시간인 뚜렷한 형광 수명을 갖는다. 형광 수명 이미징 (FLIM)은 세포 대사의 라벨없는 분석을 위해 NAD (P) H 및 FAD의 형광 강도와 수명을 정량화 할 수 있습니다. 형광 강도 및 수명 현미경은 적절한 여기 및 방출 파장을 선택하여 NAD(P)H 및 FAD 이미징에 최적화할 수 있습니다. 시안화물에 의한 대사 교란은 세포 내의 대사 변화를 검출하기 위해 자기 형광 이미징 프로토콜을 검증합니다. 이 기사에서는 세포 신진 대사를 측정하기위한 NAD (P) H 및 FAD의 자기 형광 이미징 기술을 시연합니다.

서론

신진 대사는 에너지를 생산하는 세포 과정입니다. 세포 대사는 글리코 분해, 산화 인산화 및 글루타미노분해를 포함한 여러 경로를 포함합니다. 건강한 세포는 면역 세포에 의한 사이토카인의 생산과 같은 증식 및 기능을위한 에너지를 생성하기 위해 이러한 대사 경로를 사용합니다. 대사 장애, 암 및 신경 변성을 포함한 많은 질병은 변경된 세포 대사^{를 특징으로합니다1}. 예를 들어, 일부 암 세포 유형은 산소의 존재 하에서도 핵산, 단백질 및 지질의 합성을 위한 분자를 생성하기 위해 상승된 당분해 속도를 갖는다^2,3. 바르부르크 효과로 알려진 이 현상은 유방암, 폐암, 교모세포종⁴을 포함한 많은 암 유형의 특징이다. 암 진행과 관련된 세포 대사의 변화로 인해, 세포 대사는 약물 반응에 대한 대리 바이오마커가 될 수 있다^5,6. 더욱이, 세포 수준에서 약물 효능을 이해하는 것은 세포 이질성이 개인에서 상이한 약물 반응을 초래할 수 있기 때문에 중요하다^7,8

프로토콜

1. 이미징을위한 셀 도금

1. MCF-7 세포의 80-90% 컨플루언트 T-75 플라스크로부터 배지를 흡인하고, 세포를 멸균 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 10 mL로 헹구고, 0.25% 트립신(1x) 2 mL를 첨가하여 플라스크 바닥으로부터 세포를 분리한다.
2. 플라스크를 ∼4분 동안 37°C에서 인큐베이션한다. 분리를 확인하기 위해 현미경으로 세포를 확인하십시오.
3. 즉시 배지 8 mL를 첨가하여 트립신을 비활성화시킨다.
4. 세포를 원뿔형 튜브 (15 mL 또는 50 mL)에 수집하십시오. 혈구계를 사용하여 세포를 계수하십시오.
5. 세포 200 × g 을 5분 동안 원심분리한다.
6. 일단 원심분리되면, 상청액을 흡인한다. 세포의 펠렛을 1 mL의 배지에 재현탁시키고, 시드 4 × 105 세포를 ³⁵ mm 유리 바닥 이미징 접시 (또는 사용되는 현미경에 적합한 샘플 홀더) 상에 상에.
7. 세포 대사를 유지하기 위해 이미징 접시에 2 mL의 배지를 첨가하십시오.
8. 세포를 37°C에서 24-48시간 동안 5% _CO2 와 함께 인큐베이션한 후 세포가 부착하고 대수 성장 단계에 도달하도록 이미징....

결과

상피 유방암 세포주인 MCF-7을 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 형광 이미징을 위해, 세포를 이미징 48 h 전에 35 mm 유리 바닥 이미징 디쉬 당 4 × ¹⁰⁵ 세포의 밀도로 시딩하였다. 세포를 상기 언급된 프로토콜을 사용하여 시안화물 처리 전후에 이미지화하였다. 시안화물 실험의 목표는 NAD(P)H 및 FAD 형광의 스펙트럼 분리를 확인하고 세포의 대사 변화를 검출하기 위한 이미징 시스템 및 분석 프로토콜을 검증하는 것입니다. 쌍을 이룬 NAD(P)H 및 FAD 형광 수명 이미지는 시안화물 이전의 다섯 개의 상이한 위치와 시안화물을 배지에 첨가한 후 다섯 개의 상이한 위치에서 촬영되었다. 형광 수명 파라미터(광학 산화환원 비, NAD(P)H α 1, NAD(P)H τ1, NAD(P)H τ2, NAD(P)H τm, FAD τ1, FAD τ2, FAD α ₁, FAD _τ1<.......

토론

자가 형광 강도 및 평생 이미징은 세포의 신진 대사를 평가하기 위해 널리 사용되어 왔습니다.^21,55. FLIM은 고분해능이므로 단일 세포를 해결하는데, 이는 세포 이질성이 종양 공격성 및 약물 내성에 기여하기 때문에 암 연구에 중요합니다^.7,39,41,44,45,46,58. 마찬가지로, 세포 대사의 자가형광 영상은 면역 세포 기능이 세포 대사와 연결되어 있고, 면역 세포 집단이 종종 이질적이기 때문에 면역 세포를.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2-deoxy-d-glucose (2-DG)	시그마	AC111980000; AC111980010; AC111980050;
항생제, 항균제(펜-스트렙),	Gibco	15240096
세포 샘플,	미국형 배양 컬렉션	해당 없음	MCF-7 암 라인
, CellProfiler	, Broad Institute	해당 없음,	이미지 분석 소프트웨어
원뿔형 튜브	VWR	89039-664	15 mL 원뿔형 튜브
DMEM	ThermoFisher	11965092	배양 매체
FAD 이색성 거울	Semrock	FF495-Di03-25x36	495 nm
FAD 방출 필터	Semrock	FF01-550/88-25	550/88 nm
FAD 여기 필터	Semrock	FF01-458/64-25	458/64 nm
FBS	ThermoFisher	16000036
형광 수명 현미경	3i	N/A
유리 바닥 접시	MatTek Corp	P35G-1.0-14-C
다광자 레이저	간섭성	N/A	2P 간섭성 레이저, 조정 가능한 680 nm-1080 nm
NAD(P)H 이색성 거울	Semrock	FF409-Di03-25x36	409 nm
NAD(P)H 방출 필터	Semrock	FF02-447/60-25	447/60 nm
NAD(P)H 여기 필터	Semrock	FF01-357/44-25	357/44 nm
PBS	ThermoFisher	70011044
시안화칼	시그마-알드리치	380970
슬라이드북 6	3i	N/A	이미지 수집 소프트웨어
SPCImage	Becker & Hickl GmbH	N/A	형광 수명 분석 소프트웨어
스테이지 탑 인큐베이터	okoLab	N/A
Trypsin	Biosciences	786-262
Urea	Sigma-Aldrich	U5128
YG beads	Polysciences	19096-2	Yg 마이크로스피어 (20.0 µ m)

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