Method Article

과립 세포 전구체에서 1 차적인 실륨 의존적 신호 경로를 연구하는 효율적이고 비용 효율적인 전기 포기법

DOI:

10.3791/63283

⸱

November 30th, 2021

 ,  , 
1Department of Chemistry, Faculty of Science, Hong Kong Baptist University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서, 우리는 비용 효율적이고 효율적이며 실행 가능한 1 차성 과립 세포 전구체 (GCP)의 유전 조작을 위한 시험관 내 전기화 프로토콜을 제시합니다. 더욱이, 이 프로토콜은 또한 1 차적인 GCP 세포에 있는 1 차적인 고슴도치 신호 통로의 분자 연구를 위한 간단한 방법을 보여줍니다.

Abstract

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1차 실륨은 고슴도치(Hh)가 세포 표면으로부터 자극을 신호하는 거의 모든 세포에서 발견되는 중요한 신호 세포입니다. 과립 세포 전구체(GCP)에서, 1차 실슘은 Hh 신호 경로를 조절하여 전구체 세포 증식을 오케스트레이션하는 중추적인 신호 센터역할을 한다. 1차 실슘 의존Hh 시그널링 기계류의 조사는 경로 구성 요소의 체외 유전자 조작에 의해 촉진되어 동적 국소화를 1차 실륨으로 시각화합니다. 그러나, 현재 알려진 전기기화 방법을 사용하는 GCP의 1차 배양에서 의 전염은 일반적으로 비용이 많이 들며 종종 낮은 세포 생존력과 바람직하지 않은 트랜스포션 효율을 초래한다. 이 백서는 ~80-90%의 높은 배분 효율과 최적의 세포 생존가능성을 보여주는 효율적이고 비용 효율적이며 간단한 전기 기립 프로토콜을 소개합니다. 이것은 1 차적인 GCP 문화에 있는 1 차적인 고슴도치 신호 통로의 연구 결과에 적용되는 간단하고 재현 가능하고 능률적인 유전 수정 방법입니다.

Introduction

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소뇌GCP는 생체 내에서 Hh 신호 경로에 대한 높은 풍부함과 높은 민감성으로 인해 뉴런 전구 세포 유형의 Hh 신호 경로의 기계를 연구하는 데 널리 사용됩니다. GCP에서, 1차 실슘은 전구체 세포의 증식을 조율하는 중추적인 Hh 신호 변환 허브5로서 작용한다6,7,8. 1차 실륨에서 Hh 신호 성분의 체외 시각화는 낮은 내인성 기저 수준으로 인해 종종 도전적입니다. 따라서, 관심 유전자의 단백질 발현 수준 및 형광소 태깅의 유전자 변형은 분자 해상도에서 경로를 연구하는 유용한 접근이다. 그러나, 지방성 기지를 둔 transfection 접근을 사용하여 GCP 1 차적인 배양을 유전 조작은 수시로 더 분자 조사를 방해하는 낮은 transfection 효율성 귀착됩니다9. 전기기화는 ....

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Protocol

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모든 동물 관련 절차는 동물 취급 지침과 홍콩 보건부에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 동물 실험 면허 (실험 의 제어) 조례 (캡. 340) 보건부에서 취득되었다, 홍콩 정부. 동물 작업은 HKBU 연구실 및 실험실 안전 위원회가 승인한 동물 안전 윤리에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 사전 실험 준비

  1. 문화 미디어 및 버퍼 준비
    1. 세럼 프리 매체(SFM)
      1. SFM 50mL를 준비하려면 100x L-글루타민 대용품 500 μL, 페니실린-스트렙토마이신 500μL, 피루바테 나트륨 1mM, 1M KCl(최종 250 μM)의 12.5μL을 신경계 중간 값49mL에 추가한다.
      2. SFM을 50mL 원뿔관에 10mL및 40mL의 2개의 알리쿼트로 분할하여 최대 1개월 동안 4°C에 보관합니다.
    2. 소화 차단 매체: SFM에서 10% FBS
      1. 1.1mL의 열 활성화 FBS를 SFM의 10mL 알리쿼트에 추가하여 소화 차단 매체를 준비합니다.
    3. GCP 배양 ....

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Results

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Opti-MEM( 재료의 표 참조)을 보편적 시약으로 사용하여, 이 제안된 전기기화 방법론은 ~80-90%(그림 1)에서 일관되게 높은 전기기화 효율을 달성할 수 있었다. Smo-EGFP 벡터의 전기기화 효율은 모든 페어링된 상자 단백질-6(Pax6)-발현 GCP 세포에서 녹색 형광 양성 세포의 백분율을 정량화함으로써 DIV 2 후 전기기화에서 결정되었다. DMSO 및 SAG 처리 군의 전기기 효율은 비교할 수 있는 것으로 나타났다(그림 1 및 표 2).

또한, 1차 실슘 마커인 Arl13b의 면역염색은 DIV 2에서 GCP의 모온률이 차량 및 SAG 처리군 모두에서 ~18%였으며(DMSO: 17.35% ± 0.59%; SAG: 18.24% ± 0.88%). 섬광 속도는 DIV 2 후 전기포레이션(

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Discussion

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전기기화 방법에 의한 1차 GCP 배양에서 의 전형적 트랜스펙트(transfection)는 전형적으로 낮은 세포 생존력 및 불량한 형질 효율9,10과 연관된다. 이 백서는 고효율과 생존력을 입증한 비용 효율적이고 재현 가능한 전기 화 프로토콜을 소개합니다. 또한, 우리는 또한 1 차적인 GCP 세포에 있는 1 차적인 cilium 의존적인 Hh 신호 통로를 공부하는 간단한 방법을 보여줍니다.

그밖 일반적인 전기기화 방법은 수시로 특정 제조자에서 구입해야 하는 비용이 많이 드는 세포 모형 특정 전기기 시약을 요구합니다. 여기에 기재된 방법은 상이한 세포 유형에 대한 일반적이고 경제적인 전기기시약을 사용하기 때문에 유리한 것으로 간주된다. 더욱이, 이들 데이터는 전기기공 효율이 ~80-90%에 도달한 것으로 나타났으며, 이는 다른 전기기공및 경화 방법에 비해 매우 효율적입니다

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 HKBU 시드 펀드와 Tier-2 스타트업 그랜트 (RG-SGT2/18-19/SCI/SCI/009), 연구 보조금 위원회-협력 연구 기금 (CRF-C2103-20GF)에서 C.H.H. Hor에 의해 지원되었습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
GCP Culture
B27 supplementLife Technologies LTD17504044
Cell strainer, 70 µ mCorning352350
DNase I from bovine pancreasRoche11284932001
Earle' s Balanced Salt SolutionGibco, Life Technologies14155063
FBS, ThermoScientificSH30028.02
GlutamMAXTM-I, 100xGibco, Life Technologies35050061L-글루타민 대체체
L-시스테인Sigma AldrichC7352
MatrigelBD Biosciences354277기저막 매트릭스
NeurobasalGibco, Life Technologies21103049
Papain,현탁액Worthington Biochemical CorporationLS003126
Poly-D-lysine HydrobromideSigma AldrichP6407
SAGCayman Chemical11914-1Smoothened agonist
IF staining
소 혈청 알부민시그마 알드리치A7906
파라포름알데히드시그마 알드리치P6148
트리톤 X-100시그마 알드리치X100
Primary antibody mix
Anti-GFP-goat abRockland600-101-215희석 계수: 1 : 1000
Anti-Arl13b 마우스 단클론 abNeuroMab75-287희석 계수: 1 : 1000
Anti-Pax6 토끼 다클론 abCovancePRB-278P희석 계수: 1 : 1000
2차 항체 믹스
Alexa Fluor 488 당나귀 항염소 IgGInvitrogenA-11055희석 계수: 1 : 1000
Alexa Fluor 555 당나귀 안티 마우스 IgGInvitrogenA-31570희석 계수 : 1 : 1000
Alexa Fluor 647 당나귀 안티 토끼 IgGInvitrogenA-31573희석 계수 : 1 : 1000
DAPIThermo Scientific62247희석 계수 : 1 : 1000
Electroporation
CU 500 큐벳 챔버NepageneCU500
EPA 전기천공법 큐벳 (2 mm 간격)NepageneEC-002
Opti-MEMLife Technologies LTD31985070transfection
pEGFP-mSmoAddgene25395
Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In vivo ElectroporationNepageneNEPA21electroporator

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
  2. Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the....

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Primary CiliumElectroporation MethodGranule Cell PrecursorHedgehog SignalingGenetic ModificationIn Vitro TransfectionCell ViabilityCilium Marker Arl13bSmoothened EGFP LocalizationPax6 Expression

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